The authors have no acknowledgements.

1. Bakteriensuspension Zubereitung: <ol><li> Aus einer Kulturplatte ausgestrichen, aseptisch zu inokulieren eine einzelne Kolonie in einen 250 ml sterile Flasche mit 100 ml des geeigneten Wachstumsmedium (Tabelle 1) durch sterile Impföse. </li><li> Die Flasche in einem Orbital Schüttelinkubator bei den geeigneten Bedingungen (Tabelle 1) für 1-2 Tage, Überprüfung auf Wachstum in regelmäßigen Abständen. Stellen Sie den Schüttler Geschwindigkeit bis 140 RPM. </li><li> Unter aseptischen Bedingungen wird die Bakteriensuspension in zwei sterile 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugiere die Röhrchen bei 3.000 xg für 20 min bei 23 ° C. </li><li> Aspiration des Überstands und Resuspendieren jeder Bakterienpellet mit 15 ml sterilem Peptonwasser. Vortex wie nötig. Kombinieren Sie die suspendierten Bakterienkultur in einem Rohr / Behälter. </li><li> Titer der Stammkultur in dreifacher Ausfertigung pro Abschnitt 4 an Stammkultur Titer zu bestimmen. </li><li> Kühlschrank für bis zu 2 Wochen bei 477; 2 ° C, bis es benötigt. Re-Titer der Kultur zum Zeitpunkt der Verwendung, siehe Schritt 4.8. </li></ol> 2. Platelet Verarbeitung: <ol><li> Sammeln Sie eine Standard-Apherese menschlichen Blutplättchenprodukt an einer anerkannten Blutbank. Die Blutplättchenprodukt muss folgende Sammlung Spezifikationen entsprechen: 90 bis 360 ml Volumen und 0,8 -3,8 x 10 6 Plättchen / ul-Konzentration. <ol><li> Sicherzustellen, daß die Blutplättchen-Produkt ist für mindestens 2 Stunden vor der Verarbeitung für die Erregerreduzierung ruhte. Die Produkte lagern bei 22 ± 2 ° C in einem Inkubator Blutplättchen ohne Rühren für diese 2 Stunden. Nach zwei Stunden gewährleisten die Blutplättchenprodukt wird bei 22 ± 2 ° C in einem Inkubator Thrombozyten gerührt. Verwenden Sie das Produkt für bis zu 22 Stunden nach der Sammlung. </li></ol></li><li> Mit einem 3-ml-Spritze entfernen Sie ein 2-ml-Probe, um den pH-22C der Blutplättchenprodukt zu messen. Verwenden Sie einen Blutgasanalysator um ein Produkt zu gewährleisten, hat einen pH-Wert&gt; 6,6. Verwenden Sie die gleiche Probe, um die Blutplättchenkonzentration der Blutplättchenprodukt mit einer hämatologischen Analysator messen. Stellen Sie sicher, das Produkt die von 0,80 bis 3,8 x 10 6 Plättchen / ul Sammlung Konzentration Anforderung erfüllt. </li><li> Optisch bewerten Drall der Blutplättchenprodukt. Wenn das Produkt eine &quot;0&quot; wirbeln das Produkt entsorgt werden. </li><li> Halten Sie die Blutplättchenbeutel unter einer direkten Weißlichtquelle und drücken Sie die Blutplättchenbeutel kurz. Visuelle Beobachtung der wirbelnden Muster der Blutplättchenprobe. Note das Produkt anhand der folgenden Skala. HINWEIS: 2 - Positive Swirl: Wirbelnde Inhomogenität in der gesamten Tasche sichtbar mit starkem Kontrast. 1 - Intermediate-Strudel: Einige Inhomogenität sichtbar, aber nur in wenigen Orten und mit schlechten Kontrast. 0 - Negative Swirl: vor und nach dem Zusammendrücken der Blutplättchenbeutel verbleibende Trübe Homogenität </li></ol> 3. Riboflavin und UV-Licht-Prozess: <ol><li> TranSfer die Thrombozyten Produkt einem Riboflavin und UV-Licht-Beleuchtung und Aufbewahrungstasche mit einer sterilen Schlauch Docking-Gerät. Nach der Überführung nehmen Sie die leere Thrombozyteneinheit Sammelbeutel mit einem Schlauchversiegelungsvorrichtung und entsorgen Sie die leere Tasche als biologisch gefährlichen Abfall. </li><li> Entfernen Sie eine 35 ml Beutel von 500 um Riboflavin Stammlösung von seiner Lichtschutz äußere Umhüllung. Sterile dock das Riboflavin-Kit auf die Zuleitung der Behandlung und Aufbewahrungstasche. Damit der Inhalt in die Thrombozyteneinheit entleeren. </li><li> Hängen Sie das Riboflavin-Beutel / Behandlung und Aufbewahrungstasche aus der Riboflavin Tasche gesetzt und vorsichtig ausdrücken Restluft aus der Behandlung und Aufbewahrungstasche und in die Riboflavin Tasche. Sorgen für eine geringe Menge an Blutplättchenprodukt wird ebenfalls in den Beutel Riboflavin ausgedrückt, um jegliche restliche Riboflavin in das Blutplättchenprodukt zu spülen. Lassen Sie das Riboflavin und Thrombozyten Lösung zurück Drain in die Behandlung und Aufbewahrungstasche und klemmen Sie die Einlassleitung. Entfernen Sie die leere Riboflavin Beutel unsing eine Schlauchversiegelungsvorrichtung und entsorgen Sie die leere Tasche als biologisch gefährlichen Abfall. </li><li> Sterile Dock ein 6 &quot;Schlauchleitung mit weiblichen Spritzenverbindungsstecker auf die Einlassleitung der Beleuchtung und Aufbewahrungstasche. Bringen Sie ein 10 ml Spritzenzylinder (Entfernen Sie den Kolben) auf die Spritze Stecker weiblich. </li><li> Aseptisch in den Spritzenzylinder 5 ml stock Bakterien über eine Pipette. Öffnen Sie die Klemme an der Einlassleitung und lassen die Bakterien in Thrombozyten Produkt abzulassen. Spülen Sie den Spritzenzylinder, indem einige Blutplättchenprodukt in den 10 ml Spritzenzylinder zurückfließen. Entfernen Sie die 10-ml-Spritze Barrel. </li><li> Aseptisch fügen Sie eine 30-ml-Spritze und spülen der Einlassöffnung mindestens zwei Mal, um die Lager Bakterien in die Thrombozyten Produkt gemischt zu gewährleisten. Nachdem das Produkt ist gut gemischt, mit einem sauberen 5-10 ml Spritze und einer 2 ml Vorbehandlung Probe zu entfernen. Verwenden Sie eine neue Spritze sicherzustellen, jede von der Inokulation Schritt eingeführten Luft oder Probenahmeschritt entfernt wird. <ol><li> Titer der Vorbehandlung Probe pro Abschnitt 4. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Einlassleitung von der Behandlung und Aufbewahrungstasche und wiegen das Produkt. </li><li> Stellen Sie das Gerät in den Illuminator und befolgen Sie die angezeigten Befehle, um eine Standard-Blutplättchen-Behandlung zu beginnen. <ol><li> Geben Sie im Bediener-ID. </li><li> Sichern Sie und hängen Sie die Tasche, um den Illuminator Platte. </li><li> Geben Sie die Proben-ID in den Illuminator entweder mit dem Barcode-Leser oder die manuelle Eingabe-Tastatur. </li><li> Scan Produkttyp. </li><li> Schließen Sie die Quarzklemme. </li><li> Die Beleuchtungseinrichtung automatisch zu liefern 6,24 J / ml von Energie. Die typische Behandlungszeit dauert 5-10 min. </li></ol></li><li> Nach der Behandlung sterile Dock ein 6 &quot;Schlauchleitung mit weiblichen Spritzenverbinder auf die Probe Glühlampe Linie der Behandlung und Aufbewahrungstasche. Stellen Sie sicher, das Produkt gut gemischt und dann fügen Sie eine 5-ml-Spritze und einer 2 ml Nachbehandlung Probe zu entfernen. <ol><li> Titer der Nachbehandlung samPLe gemäß Abschnitt 4. </li></ol></li></ol> 4. Bacterial Titer <ol><li> Schätzen Sie die Titer der Vorbehandlung und Nachbehandlung Proben und Vorbereitung der entsprechenden Anzahl von 5 ml Verdünnungsröhrchen benötigt, um einen Endpunkt serielle Verdünnung jeder Probe durchzuführen. Aseptisch die benötigten Röhrchen mit 1,8 ml Peptonwasser zu füllen. </li><li> Titer jeder Probe unter Verwendung einer 10-fachen Verdünnungsschema. Unter aseptischen Bedingungen wird 0,2 ml der unverdünnten Probe zu dem ersten Verdünnungsröhrchen (10 -1). Vortex Dieses Verdünnungsröhrchen und Transfer von 0,2 ml auf die nächste Verdünnungsröhrchen. Fahren Sie mit der Verdünnungsreihe durch die erforderliche Anzahl von Verdünnungen. <ol><li> Unter aseptischen Bedingungen wird 100 ul jeder Verdünnung zu einer entsprechenden Agarplatte (Tabelle 1) plattiert werden. </li></ol></li><li> Mit einem sterilen Zelltreuer verteilen die Probe auf jeder Agarplatte. </li><li> Invertieren und Inkubation der Platten bei geeigneten Bedingungen ( <strong&gt; Tabelle 1) für 1-2 Tage die Überprüfung für das Wachstum in regelmäßigen Abständen. </li><li> Count-Platten mit 30 bis 300 Kolonien. Die Platten, die mehr als 300 Kolonien werden als zu zahlreich (TNTC) zählen. Platten, die weniger als 30 Kolonien werden als unter der Bestimmungsgrenze (LOQ) liegen. </li><li> Berechnen Sie den Titer von jeder Testprobe und notieren Sie die Ergebnisse als KBE / ml. <ol><li> Verwenden Sie die folgende Gleichung, um CFU / ml zu berechnen: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Wenn es keine Kolonien auf der niedrigsten Verdünnungsplatte, verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Nachweisgrenze (LOD) berechnen: <img alt="Gleichung 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> und <img alt="Gleichung 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Wo: N = niedrigste Anzahl von Partikeln (CFU) in product das Vertrauen festgestellt werden kann. P = Wahrscheinlichkeit, dass ein Mikroorganismus unerkannt sein; mit einer statistischen Sicherheit von Nachweis eines Mikroorganismus 95%, p = .05. V = Gesamtproduktvolumen in ml V = Volumen überzogen (ml) x Verdünnungsgrad von Platte </li></ol></li><li> Zur Negativkontrolle, Platte mit 0,5 ml der Peptonwasser, die für den seriellen Verdünnungen auf jeder von zwei Agarplatten verwendet. Verwenden das gleiche Plattentyp wie der zu testenden Proben. Invertieren und inkubieren Sie die Platte an den entsprechenden Bedingungen für 1-2 Tage die Überprüfung für das Wachstum in regelmäßigen Abständen. <ol><li> Wenn das Wachstum auf beiden Agar-Platte beobachtet, muss die Flasche verwendet Peptonwasser verworfen werden; Die Ergebnisse der Studie werden auch ungültig gemacht. </li></ol></li><li> Für Positive Control, Wieder Titer der Stammkultur von Bakterien, die verwendet wurde. Invertieren und Inkubation der Platten bei geeigneten Bedingungen für 1-2 Tage die Überprüfung für das Wachstum in regelmäßigen Abständen. Der Titer darf ± 1,0 log KBE / ml des Datensatzesed stock Titer (siehe Abschnitt 1.5) für die Studie als gültig betrachtet werden. </li></ol>

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Alle Autoren dieses Beitrags werden derzeit von Terumo BCT, Entwickler und Hersteller des Mirasol PRT-System eingesetzt. Publikationsgebühren zu diesem Video-Artikel wurden von Terumo BCT bezahlt worden.

Bakterielle Screening üblich geworden in Blutbanken und für viele Orte es als primäre Methode zur Transfusion von bakteriell kontaminierten Thrombozyten verhindern, dient. Obwohl bakterielle Screening verbietet in der Regel die Mehrheit der schnell wachsenden gramnegativen Bakterien wie S. marcescens, E. coli und E. cloacae, kämpft es um langsam wachsende Gram-positive Bakterien wie S. erkennen aureus, Streptococcus spp. und S. epidermidis 8. Leider sind diese drei Gram-positive Bakterien in nach oben von 50% aller kontaminierten Thrombozyteneinheiten und Transfusion von Blutplättchen-Produkte, die diese drei Organismen verwickelt hat, um Patienten die Sterblichkeit 1 zu führen. Bakterielle Screening basiert auf dem bakteriellen Titer in einem Blutplättchenprodukt, ausreichend hoch sein, so dass zumindest ein Organismus innerhalb des typischen 4-8 ml Screeningprobe enthaltenen. Wenn die Keim Titer nicht ausreichend hoch ist für ein Bakterium, in dem 4-8 ml Probenvolumen eingefangen werden, ist das Gerät korrekt als negativ gekennzeichnet, und es wird für die Transfusion freigegeben. Ein alternativer Ansatz, um bakterielle Screening könnte sein, einen proaktiven Prozess, der auf allen Thrombozyteneinheiten durchgeführt werden kann, und dass die kontaminierenden Organismen als nicht-funktionale machen könnte zu beschäftigen. In dieser Studie wurden hohe Titer von Bakterien absichtlich Thrombozyteneinheiten hinzugefügt, um die Gesamtreduktionskapazität des Riboflavin und UV-Licht Erregerreduzierung Prozess zu testen. Obwohl die bakterielle Belastung in dieser Studie getesteten weit über den normalerweise in Blutprodukten bei der Spende fand diese Untersuchung hilft, zeigen, dass das Riboflavin und UV-Licht-Verfahren ist in der Lage, um den Titer von lebensfähigen Bakterien signifikant reduzieren in einem kontaminierten Blutplättcheneinheit 2,6-5,4 log (99,7 bis 99,9996% ige Reduktion der verunreinigenden Bakterien) (Abbildung 2). Um eine Accura erhaltente log Reduktionswert, ist es entscheidend, dass der Bediener eine gute aseptische Technik zusammen mit präzises Pipettieren Fähigkeiten bei der Durchführung der bakteriellen Titer Schritte. Ungenaue Pipettieren bei der Durchführung von Verdünnungsreihen können zu einer Anhäufung von Fehlern und damit zu einer ungenauen Titer Messung führen. Die in dieser Studie erhobenen Daten unterstützt früheren Arbeiten mit Riboflavin und UV-Licht, die das System vor niedrigem Niveau, klinisch relevante Bakteriämie (&lt;20 KBE / Einheit) in Frage gestellt. Der vorherige Studie wurde entworfen, um eine tatsächliche klinische Kontamination Ereignis zu imitieren, und die Ergebnisse zeigten, Riboflavin und UV-Licht wirksam verhindert Bakterienwachstum über die 7-Tage-Plättchenlagerdauer war. Modellierung auf der Basis der Daten der vorherigen Studie schlägt vor, dass die aktuellen Risikoschätzungen der bakteriellen Kontamination von Blutplättchen Produkte konnten bis zu 98% vom aktuellen Niveau 8 reduziert werden. Die Riboflavin und UV-Licht-Prozess günstig im Vergleich zu bakteriellen Bildschirmtion, die nur eine Wirksamkeit von 66%, bakterielle Verunreinigungen in Thrombozyteneinheiten erfassen, wenn mit einer klinisch relevanten Bakterienlast 8 gefordert demonstriert. Wie bei allen Technologien, PRT Behandlung von Thrombozytenprodukte zu Komplikationen mit bakteriell kontaminierten Thrombozyten-Einheiten hat ihre Grenzen vermieden werden. PRT Systeme sind nicht wirksam gegen bakterielle Sporen und nicht inaktivieren Endotoxin, wodurch, selbst wenn ein PRT System kann hohe Titer von Gram-negativen Bakterien zu inaktivieren, die verbleibende Endotoxin noch im Empfänger verursachen septischem Schock. PRT wird am besten früh während der Lagerung durchgeführt, bevor die Bakterien, um hohe Titer zu propagieren. Abschließend, wie durch die Kombination dieser beiden Studien gezeigt haben, ist das Riboflavin und UV-Licht-Prozess effektiv bei der Reduzierung der bakteriellen Belastung sowohl gegenüber gramnegativen und grampositiven Organismen und eine praktikable Alternative zu bakteriellen Abschirmung bieten. Routinemäßig treating Thrombozytenkonzentraten mit Riboflavin und UV-Licht hat den zusätzlichen Vorteil, dass der potentielle Übertragung von anderen Blut übertragbaren Agenzien wie Viren und Parasiten.

Transfusion von Blutplättchen, Plasma, gepackte Erythrozyten und Vollblut-Produkte spielen eine wichtige Rolle in der modernen Medizin und kann verwendet werden, um verschiedene Krankheiten zu behandeln, zu ersetzen lebenswichtigen Flüssigkeiten und letztlich Leben retten werden. Blutplättchen sind ein Zellprodukt, das entweder aus Vollblut isoliert und vereinigt in ein transfusable Dosis oder durch den Prozess der Blutplättchen-Apherese gewonnen. Die Hauptaufgabe der Thrombozyten im Körper ist blut an Wundstellen zu stoppen und zur Aufrechterhaltung der Hämostase. Patienten mit einer niedrigen Thrombozytenzellzahl (Thrombozytopenie) sind anfällig für spontane Blutungen und mit Thrombozyten transfundiert zu bringen ihre Thrombozytenzellzahl wieder in einen normalen Bereich. Gesammelten Blutplättchen für maximal 5-7 Tage gelagert und bei 22 ± 2 ° C unter ständigem Rühren gelagert. Trotz der lebensrettenden Eigenschaften von Thrombozytentransfusionen bleibt ein geringfügiges Risiko für Transfusionsempfänger aufgrund Contamination dieser Produkte durch Parasiten, Bakterien und Viren 11. Die Umsetzung von viralen Nukleinsäuretests (NAT) das Risiko viraler Übertragung von großen Blut getragen Mittel, wie Hepatitis-C-Virus (HCV), Hepatitis-B-Virus (HBV) und menschliches Immunschwächevirus (HIV) signifikant verringert 5. Eine aktuelle Veröffentlichung von den Canadian Blood Services schätzt das Restrisiko für diese Mittel auf 1 pro 8.000.000 Spenden für HIV, 1 je 6,7 Millionen Spenden für HCV und 1 je 1,7 Millionen Spenden für HBV 15 sein. Obwohl Bakterien typischerweise sammeln weniger Aufmerksamkeit in der Öffentlichkeit hat sich die Frequenz von bakterieller Kontamination in Thrombozytenkonzentraten wurde geschätzt, dass bis zu 1: 1.000 7 und da Millionen von Thrombozytenkonzentraten werden jährlich trans viele Empfänger sind potentiell lebensbedrohliche Komplikationen ausgesetzt wie Sepsis 6. Untersuchungen zeigen, dass die bakterielle Belastung zu dem ZeitpunktKontaminations niedrig ist, &lt;100 koloniebildenden Einheiten (CFU) / product 2,16, aber das nährstoffreiche Umgebung und Lagerung bei Raumtemperatur ermöglicht kontaminierenden Bakterien gefährlich hohen Titern vor der Transfusion zu proliferieren. Derzeit ist die einzige zugelassene Methoden zur Verfügung, um bakteriell kontaminierte Produkte aus einer Thrombozyten Empfänger erreichen zu verhindern, ist die Verwendung von Kultur-basierte Systeme und schnelle Point of Care-Tests. Kurz gesagt, für die Kultur basierten Systemen Thrombozytenprodukte werden auf einem Schüttler bei 22 ° C für 12-24 h auf, dass Bakterien in dem Produkt zu proliferieren, auf dem ein 4-8 ml Probe aus dem Blutplättchenprodukt entfernt und in einer Flasche inokuliert gespeicherten haltigen Nährmedien. Die Flasche wird in ein Instrument, das die Flasche für das Bakterienwachstum überwacht platziert. Erkennt das Gerät, das Bakterienwachstum in der Flasche wird markiert und die entsprechende Thrombozyteneinheit verworfen. Während dieser Prozess recht erfolgreich bei der Erkennung schnell groFlügel Organismen viele der langsam wachsenden Arten nicht auf einen ausreichend hohen Titer wachsen zu erfassen ist, und damit das Potenzial für falsch-negative Einheiten für Trans 7,12,14,16,22 freigegeben. Im Gegensatz zu Kultur Detektionssysteme, schnelle Point of Care-Tests wird in der Regel später in der Thrombozytenlagerzeit durchgeführt, wenn die bakterielle Belastung deutlich erhöht hat. Die höhere Titer erforderlich sind, da point of care-Tests sind weniger empfindlich als die Kultur, die Systeme und Bakterien nur zuverlässig zu detektieren, wenn sie einen Titer ≥1 × 10 3 CFU / ml 17 erreichen. Aber solche Tests liefern Ergebnisse innerhalb von 1 Stunde der Probenahme. Variabilität in der Leistung dieser Tests zur Freisetzung von einem falsch negativen Produkt geführt, was zu einer tödlichen septischen Reaktion im Empfänger 9. Ein alternativer Weg, um das Problem der bakteriellen Kontamination von Thrombozyten-Produkten zu bekämpfen, ist durch die routinemäßige Verwendung eines Erregerreduzierung process, der anstelle von verunreinigenden Bakterien zu inaktivieren können versuchen, sie zu erkennen. Mit Riboflavin als Photosensibilisator in Kombination mit UV-Licht, wurde gezeigt, dass die Infektiosität von einem breiten Bereich von pathogenen hämatogenen Verunreinigungen zu reduzieren, einschließlich Bakterien 3,4,8,10,19-21 .Verwendung Riboflavin und UV Licht für die Erregerreduzierung ist nicht toxisch und nicht-mutagen, und Riboflavin und UV-Licht behandelten Komponenten sind gezeigt worden, sicher für Transfusionsempfänger als auch für diejenigen, Umgang mit Blutprodukten 18 zu sein. Kurz gesagt, kann Riboflavin Molekülen mit den Nukleinsäuren (DNA und RNA) von Bakterien, Parasiten, Viren und jeder kernhaltigen Zelle (zB weiße Blutzellen) zu verknüpfen. Bestrahlung mit UV-Licht aktiviert Riboflavin, was zu einer chemischen Veränderung, um funktionelle Gruppen der Nukleinsäuren (meist Guaninen), wodurch die Replikation und / oder Transkription der Nukleinsäuren und der Organismus ist inaktiviert 13. Kernlose Zellen wie Platteermöglicht und die roten Blutkörperchen nicht durch die Riboflavin Chemie aufgrund des Fehlens von Nukleinsäure beeinflußt. Frühere Arbeiten mit Riboflavin und UV-Licht-Technologie evaluiert eine ausgewählte Gruppe von Bakterien mit Hilfe eines experimentellen Design soll ein Blutplättchenprodukt mit einer klinisch relevanten Bakterienlast (&lt;20 KBE / Produkt) 8 verunreinigt zu imitieren. Das Ziel dieser Studie war, die Riboflavin und UV-Licht-Prozess gegen die hohen Titer bakterielle Kontamination zu bewerten (&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml) in Thrombozytenprodukte im Plasma, um zu messen, die Gesamtkeimreduktionskapazität des Systems behandelt. Basierend auf Daten aus Hämovigilanz-Studien 1 gesammelt, wurde eine Gruppe von häufig vorkommenden gram-negative und gram-positive Organismen für die Bewertung in dieser Studie ausgewählt und enthalten die folgenden Arten: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica .Brucella neotomae, Bacillus cereus (vegetative Form), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Klebsiella pneumoniae. Alle Organismen, mit der Ausnahme, B. cereus, wurden von ATCC erhalten und eine Priorität auf den Erhalt Bakterienstämme, die als von Blutbestandteilen getrennt identifiziert worden waren gelegt. Die B. cereus in dieser Studie untersucht ist eine klinische Belastung intern von einem kontaminierten Thrombozytenprodukt isoliert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mirasol Illuminator</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Ac&#8226;T diff&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Analyzer</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidLab 1265&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Docking Device</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Incubator</td>
			<td>Helmer</td>
			<td>PC2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Incubator Shaker</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td align="right">4628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Iso-temp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo-forma</td>
			<td align="right">1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td>Smart Sealer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Centra GP8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Dilution Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>R-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mL 500 &#181;M Riboflavin</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>35 mL 500 &#181;M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella Agar with 5% Horse Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td align="right">221547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>B9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Water</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">257087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">299113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination

Die Kontamination von Thrombozyten-Einheiten, die durch Bakterien ist seit langem als einer signifikanten Transfusionsrisiko aufgrund ihrer post-Spende Lagerbedingungen anerkannt. Produkte werden routinemäßig bei 22 ° C auf einem Schüttler Schütteln gespeichert, eine Bedingung, die das Bakterienwachstum fördern können. Obwohl die Gesamtzahl der Bakterien angenommen, dass zu einem Blutplättchenprodukt eingebracht werden kann, extrem niedrig ist, können diese Bakterien zu einem sehr hohen Titer vor der Transfusion zu multiplizieren, was möglicherweise zu schwerwiegenden Nebenwirkungen. Das Ziel dieser Studie war es, eine Riboflavin-basierten Pathogen Reduktionsverfahren gegen eine Reihe von Bakterien, die so häufig Verunreinigungen der Thrombozyten Produkte identifiziert wurden, zu bewerten. Dieses Panel umfasste die folgenden Organismen: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa und K. pneumoniae. Jedes Plättchen-Einheit wurde mit einer hohen Keimbelastung impft und Proben wurden b entferntOTH vor und nach der Behandlung. Eine Kolonie-bildenden-Assay unter Verwendung eines Endpunktverdünnungsschema wurde verwendet, um die Vorbehandlung und Nachbehandlung bakteriellen Titer zu bestimmen. Log-Reduktion wurde durch Subtraktion der Nachbehandlung Titer von der Vorbehandlung Titer berechnet. Die folgenden Protokollsenkungen wurden beobachtet: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) und K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Die Ergebnisse aus dieser Studie deuten darauf hin, das Verfahren könnte dazu beitragen, das Risiko von schweren unerwünschten Transfusionsereignisse mit bakteriellen Kontamination assoziiert zu senken.

Die Reduktion von elf verschiedenen Bakterienarten wurde mit der Riboflavin und UV-Licht basiert PRT Prozess bewertet. Diese Mittel repräsentieren einige der häufigsten Verunreinigungen der Thrombozyten Produkte und gehören fünf Gram-positive und Gram-negative Organismen sechs. Mindestens sechs Thrombozytenprodukte wurden pro Organismus ausgewertet und jedes Produkt mit genügend Bakterien geimpft, um&gt; 1,0 x 10 &amp; sup5; CFU / ml Endtiter von Bakterien in dem Blutplättchenprodukt zu ergeben. Vor der Behandlung wurde eine Probe entnommen, um die Vorbehandlung Titer, wonach das Blutplättchenprodukt wurde sofort mit dem Riboflavin und UV-Verfahren behandelt bestimmen. Nach der Behandlung der Thrombozytenprodukte die folgenden Protokollsenkungen wurden beobachtet: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B.neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥ 5,4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) und K. pneumoniae 2,8 log (99,8%) (Abbildung 2). Alle Einheiten erfüllt die Systemspezifikationen wie oben für die Riboflavin und UV-Verfahren angegeben. Zusätzliche Reduzierung Tests wurden durchgeführt mit S. pyogenes mit Buffy-Coat-Thrombozyten abgeleitet. Kein signifikanter Unterschied bei der Reduktion von S. beobachtet pyogenes in Leukozytenmanschette stammen Blutplättchen gegen Apherese Thrombozyten (Daten nicht gezeigt). <img alt="Tabelle 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tabelle 1: Wachstumsbedingungen für Bakterien-Spezies untersucht unter Verwendung von Riboflavin und UV-Licht. Ein Panel von sowohl Gram-negative und Gram-positive Bakterien, die gezeigt haben, um die Thrombozytenprodukte verunreinigt wurden für diese Studie ausgewählt. Die Wachstumsbedingungen (Temperatur und Medientyp) zum Propagieren und Titer die Organismen gezeigt. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Abbildung 1: Riboflavin und UV-Licht Erregerreduzierung Prozess. Riboflavin wurde in 0,9% Kochsalzlösung bei einer nominalen Konzentration von 500 uM gelöst. Die Lösung wurde steril verbunden und in jedem Thrombozyten Produkt abgelassen. Bakterien wurde aseptisch in jede Blutplättcheneinheit aufgenommen und dann mit 6,2 J / ml UV-Energie (ca. 6-10 min) behandelt. In dieser in vitro-Studie die Nachbehandlung Thrombozyteneinheit wurde als Probe entnommen, um die endgültige bakteriellen Titer zu bestimmen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Abbildung 2: Reduktion von verschiedenen Bakterienarten, wenn sie mit Riboflavin und UV-Licht behandelt, Riboflavin und UV-Licht verwendet, um die bakterielle Belastung der häufigsten bakteriellen Verunreinigungen der Thrombozytenprodukte zu reduzieren.. Die log 10 Reduzierung ist der Unterschiedzwischen dem durchschnittlichen Vorbehandlungs Titer und die durchschnittliche Nachbehandlung Titer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Behandlung von Thrombozyten Produkte mit Riboflavin und UV-Licht: Wirksamkeit gegen bakterielle Kontamination mit hohem Titer

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K Aufrufe.  Scientific Affairs. The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Serie: Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

A Parasite Rescue and Transformation Assay auf leishmanientötende Screening gegen intrazelluläre<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Menschliche Akute Monozytenleukämie Cell Line

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentiviral vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types of cells. Because of safety concerns associated with these HIV-1 derived vectors, producing large quantities of LVs is challenging. In this paper, we report a method for producing high titers of self-inactivating LVs. We retrovirally transduce the tet-off stable producer cell line GPR to generate a cell line, GPRS, which can express all the viral components, including a dendritic cell-specific glycoprotein, SVGmu. Then, we use concatemeric DNA transfection to transfect the LV transfer plasmid encoding a reporter gene GFP in combination with a selectable marker. Several of the resulting clones can produce LV at a titer 10-fold greater than what we achieve with transient transfection. Plus, these viruses efficiently transduce dendritic cells in vitro and generate a strong T cell immune response to our reporter antigen. This method may be a good option for producing strong LV-based vaccines for clinical studies of cancer or infectious diseases.

Here, we use retroviral transduction and concatemeric transfection to create a cell line that can express the components of a lentiviral vector (LV) in the absence of tetracycline. This LV encodes GFP and is pseudotyped with a glycoprotein, SVGmu, which is specific for a receptor on dendritic cells.

Eine Tetracyclin-regulierten Zelllinie produziert qualitativ Titer lentiviralen Vektoren, die gezielt Dendritische Zellen

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation und Multi-phänotypischen High-Content-Screening<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon-Mutanten

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Ein High-Throughput- Shigella-spezifischen bakterizide Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic Tötung Assay Immunreaktionen gegen bakterielle Krankheitserreger zu bewerten

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Messung spezieller mycobakterieller Mistranslation-Raten mit Funktionsfunktionen

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Herstellung von hochtiterinfektiösen Influenza-Pseudotyppartikeln mit Hülllykoproteinen aus hoch pathogenen H5N1- und Avian H7N9-Viren

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

Etablierung eines Porcine Ex Vivo Cornea Modells zur Untersuchung von medikamentösen Behandlungen gegen bakterielle Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...