The authors have no acknowledgements.

1. Préparation: Les bactéries Suspension <ol><li> D&#39;une plaque de culture strié, inoculer de manière aseptique une seule colonie dans un flacon stérile 250 ml contenant 100 ml de milieu de croissance approprié (Tableau 1) par voie de öse stérile. </li><li> Placer le flacon dans un incubateur agitateur orbital à des conditions appropriées (tableau 1) pendant 1-2 jours, en vérifiant périodiquement croissance. Réglez la vitesse d&#39;agitation à 140 RPM. </li><li> Transférer de façon aseptique la suspension bactérienne en deux stériles tubes de 50 ml conique et centrifuger les tubes à 3000 g pendant 20 min à 23 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot bactérien avec 15 ml d&#39;eau peptonée stérile. Vortex, si nécessaire. Combiner la culture des bactéries en suspension dans un tube / conteneur. </li><li> Titrer la culture du stock en trois exemplaires par l&#39;article 4 pour déterminer le titre boursier de la culture. </li><li> Réfrigérer jusqu&#39;à 2 à 4 semaines77; 2 ° C jusqu&#39;à utilisation. Re-titre de la culture au moment de l&#39;utilisation, voir l&#39;étape 4.8. </li></ol> 2. Préparation des plaquettes produit: <ol><li> Recueillir un produit standard de plaquettes d&#39;aphérèse humaine à une banque de sang accrédité. Le produit des plaquettes doit répondre aux spécifications de collecte suivants: 90-360 ml de volume et 0,8 -3,8 x 10 6 plaquettes / ul concentration. <ol><li> Assurez-vous que le produit plaquettaire a reposé pendant un minimum de 2 heures avant le traitement de réduction des agents pathogènes. Stocker les produits à 22 ± 2 ° C dans un incubateur à plaquettes sans agitation pendant ces 2 heures. Après deux heures que le produit de plaquettes est agité à 22 ± 2 ° C dans un incubateur de plaquettes. Utilisez le produit pour un maximum de 22 après le prélèvement h. </li></ol></li><li> En utilisant une seringue de 3 ml retirer un échantillon de 2 ml pour mesurer le pH 22C du produit plaquettaire. Utilisation d&#39;un analyseur des gaz du sang pour assurer que le produit a un pH&gt; 6,6. Utiliser le même échantillon pour mesurer la concentration de plaquettes du produit plaquettaire en utilisant un analyseur hématologique. Vérifiez que le produit répond aux 0.80-3.8 x 10 6 plaquettes / ul exigence de concentration de collecte. </li><li> Évaluer visuellement le tourbillon du produit plaquettaire. Si le produit a un &quot;0&quot; agiter le produit sera mis au rebut. </li><li> Tenir le sac de plaquettes sous une source de lumière blanche directe et presser le sac de plaquettes brièvement. Visuellement observer le motif de tourbillonnement de l&#39;échantillon de plaquettes. Note du produit en utilisant l&#39;échelle suivante. NOTE: 2 - Positif Swirl: Swirling hétérogénéité visible tout au long du sac avec un fort contraste. 1 - Intermédiaire Swirl: Certains hétérogénéité visible, mais seulement dans quelques endroits et avec un faible contraste. 0 - Swirl Négatif: homogénéité Turbid restant avant et après presser le sac de plaquettes </li></ol> 3. Processus riboflavine et la lumière UV: <ol><li> TranSFER le produit plaquettaire à un sac riboflavine et UV éclairage en lumière et de stockage à l&#39;aide d&#39;un dispositif d&#39;accueil tube stérile. Après le transfert enlever le sac de collecte de l&#39;unité de plaquettes vide à l&#39;aide d&#39;un scellement de tubes et de jeter le sac vide comme déchets biologiques. </li><li> Retirer une poche de 35 ml de 500 um riboflavine solution stock de sa lumière enveloppe extérieure de protection. Quai stérile du kit de riboflavine sur la ligne d&#39;entrée de la poche de traitement et de stockage. Laisser égoutter le contenu dans l&#39;unité de plaquettes. </li><li> Accrochez la riboflavine pochette / traitement et du stockage ensemble de sacs de la poche de riboflavine et d&#39;exprimer doucement l&#39;air résiduel du sac de traitement et de stockage et dans le sac de riboflavine. Assurer une petite quantité de produit plaquettaire est également exprimé dans la poche de riboflavine pour rincer toute la riboflavine résiduelle dans le produit plaquettaire. Laisser la solution de riboflavine et de plaquettes de vidange dans le sac de traitement et du stockage, puis serrer la ligne d&#39;entrée. Retirez la riboflavine sac vide-nousing un scellement de tubes et de jeter le sac vide comme déchets biologiques. </li><li> Quai stérile une ligne de tube 6 &quot;avec connecteur femelle de la seringue sur la ligne d&#39;entrée de la poche d&#39;illumination et de stockage. Joindre un cylindre de seringue de 10 ml (retirer le piston) sur le connecteur femelle de la seringue. </li><li> Ajouter aseptiquement 5 ml de bactéries sous licence dans le cylindre de seringue par l&#39;intermédiaire d&#39;une pipette. Ouvrez la pince sur la ligne d&#39;entrée et permettre aux bactéries de se déversent dans le produit plaquettaire. Rincer le cylindre de la seringue en permettant à certains des plaquettes produit de refluer dans le cylindre de la seringue de 10 ml. Retirez la seringue de 10 ml baril. </li><li> Fixer une seringue de manière aseptique de 30 ml et rincer l&#39;orifice d&#39;entrée d&#39;au moins deux fois pour assurer les bactéries sous licence est mélangé dans le produit de plaquettes. Après que le produit est bien mélangé, utilisez un chiffon propre 5-10 ml seringue et retirer un échantillon de 2 ml de pré-traitement. En utilisant une nouvelle seringue assurer l&#39;air introduit à partir de l&#39;étape d&#39;inoculation ou l&#39;étape d&#39;échantillonnage est retiré. <ol><li> Titrer l&#39;échantillon de pré-traitement par l&#39;article 4. </li></ol></li><li> Supprimez la ligne d&#39;entrée du sac de traitement et de stockage et peser le produit. </li><li> Placez le produit dans l&#39;illuminateur et suivez les commandes à l&#39;écran pour commencer un traitement de plaquettes standard. <ol><li> Entrez dans ID opérateur. </li><li> Secure monter le sac sur le plateau de l&#39;illuminateur. </li><li> Saisissez l&#39;ID de l&#39;échantillon dans l&#39;Illuminateur en utilisant soit le lecteur de code à barres ou le clavier de saisie manuelle. </li><li> Numérisation type de produit. </li><li> Fermez le collier de quartz. </li><li> Le dispositif d&#39;éclairage sera automatiquement offrir 6,24 J / ml de l&#39;énergie. Le temps de traitement typique prend de 5 à 10 min. </li></ol></li><li> Après le traitement quai stérile une ligne 6 &quot;des tubes avec connecteur femelle de la seringue sur la ligne de l&#39;ampoule de l&#39;échantillon de traitement et de sac de rangement. Assurez-vous que le produit est bien mélangé et puis fixez une seringue de 5 ml et prélever un échantillon de post-traitement 2 ml. <ol><li> Titrer le post-traitement samPLE par l&#39;article 4. </li></ol></li></ol> 4. bactérienne Titer <ol><li> Estimer le titre des échantillons de pré-traitement et de post-traitement et de préparer le nombre approprié de tubes de 5 ml de dilution nécessaires pour effectuer une dilution en série du point final de chaque échantillon. De remplir de façon aseptique les tubes nécessaires avec 1,8 ml d&#39;eau peptonée. </li><li> Titre chaque échantillon en utilisant un système de dilution en série de 10 fois. Transférer de manière aseptique 0,2 ml de l&#39;échantillon dilué au premier tube de dilution (10 -1). Vortex ce tube de dilution de 0,2 ml et le transfert vers le tube de dilution suivante. Continuer la dilution en série par le nombre requis de dilutions. <ol><li> Transfert de façon aseptique 100 ul de chaque dilution à plaquer à une plaque de gélose appropriée (Tableau 1). </li></ol></li><li> Utiliser un épandeur de cellules stérile, répartir uniformément l&#39;échantillon sur chaque plaque de gélose. </li><li> Inversez et incuber les plaques à des conditions appropriées ( <strong&gt; Tableau 1) pour 1-2 jours de vérification pour la croissance périodiquement. </li><li> Comptez plaques avec 30-300 colonies. Les plaques contenant plus de 300 colonies sont considérées comme trop nombreuses pour être comptées (TNTC). Les plaques contenant moins de 30 colonies sont considérés comme étant au-dessous de la limite de quantification (LOQ). </li><li> Calculer le titre de chaque échantillon de test et enregistrer les résultats en UFC / ml. <ol><li> Utilisez l&#39;équation suivante pour calculer UFC / ml: <img alt="Equation 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Si il n&#39;y a pas de colonies sur la plaque de dilution plus faible, utiliser l&#39;équation suivante pour calculer la limite de détection (LOD): <img alt="Equation 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> et <img alt="Équation 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Où: N = la plus faible nombre de particules (UFC) à produit qui peut être détecté avec certitude. P = probabilité qu&#39;un microorganisme sera inaperçue; pour une fiabilité de 95% de la détection d&#39;un micro-organisme, P = 0,05. V = volume total du produit en ml v = volume plaqué (ml) x niveau de la plaque de dilution </li></ol></li><li> Pour le contrôle négatif, une plaque 0,5 ml de l&#39;eau peptonée qui est utilisé pour les dilutions en série sur chacune des deux plaques de gélose. Utiliser le même type de plaque que les échantillons à tester. Inversez et incuber la plaque à des conditions appropriées pendant 1-2 jours pour la croissance de vérifier périodiquement. <ol><li> Si la croissance est observée de part et plaque de gélose, la bouteille d&#39;eau peptonée usagé doit être jeté; les résultats de l&#39;étude sont également invalidés. </li></ol></li><li> Pour le contrôle positif, re-titre le stock culture de bactéries qui a été utilisé. Et inverser les plaques à incuber les conditions appropriées pendant 1-2 jours pour vérifier périodiquement la croissance. Le titre doit être de ± 1,0 log UFC / ml de l&#39;enregistremented Stock titre (Voir la section 1.5) pour l&#39;étude soit considéré comme valide. </li></ol>

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Tous les auteurs de ce document sont actuellement employés par Terumo BCT, développeur et fabricant du système PRT Mirasol. Publication frais pour cette vidéo-article ont été payés par Terumo BCT.

Détection bactérienne est devenu pratique courante dans les établissements bancaires de sang et pour de nombreux endroits, il sert comme la principale méthode pour empêcher transfusion de plaquettes contaminés par des bactéries. Bien que le dépistage bactérienne interdits généralement la majorité de croissance rapide des bactéries Gram-négatives telles que S. marcescens, E. E. coli et cloacae, il a du mal à détecter croissance lente bactéries à Gram positif comme S. aureus, Streptococcus spp. et S. 8 epidermidis. Malheureusement, ces bactéries Gram positives trois sont impliqués dans plus de 50% de toutes les unités de plaquettes contaminées et la transfusion de produits plaquettaires contenant ces trois organismes a conduit à la mortalité des patients 1. Criblage bactérienne repose sur le titre bactérienne dans un produit plaquettaire être assez suffisamment élevée pour que au moins un organisme est contenu dans le criblage typique échantillon de 8.4 ml. Si le titre bactérien est pas suffisamment élevée pour une bactérie à saisir dans le volume d&#39;échantillon de 4-8 ml, l&#39;unité est incorrectement marqué comme négatif et il est libéré pour transfusion. Une approche alternative au dépistage bactérienne pourrait être d&#39;employer un processus proactif qui peut être effectuée sur toutes les unités de plaquettes et qui pourraient rendre les organismes contaminants que la non-fonctionnelle. Dans cette étude, des titres élevés de bactéries ont été ajoutées exprès aux unités de plaquettes de tester la capacité du processus de réduction des agents pathogènes riboflavine lumière UV et réduction totale. Bien que les charges bactériennes testés dans cette étude dépassent de loin ceux qui se trouvent normalement dans les produits sanguins au moment du don, cette étude permet de démontrer que le processus de la riboflavine et la lumière UV est capable de réduire de façon significative le titre de bactéries viables dans une unité de plaquettes contaminées par 2,6 à 5,4 log (réduction de 99,7 à 99,9996% d&#39;bactéries contaminantes) (figure 2). Pour obtenir une accurate valeur de réduction logarithmique, il est essentiel que l&#39;opérateur possède une bonne technique aseptique ainsi que des compétences de pipetage précis lorsque vous effectuez les étapes de titre bactériennes. Pipetage imprécis lors de l&#39;exécution des dilutions en série peut conduire à une accumulation d&#39;erreurs, donc une mesure de titre inexacte. Les données recueillies dans cette étude prend en charge les travaux antérieurs avec la riboflavine et la lumière UV, qui contestait le système contre le faible niveau, la bactériémie cliniquement pertinente (&lt;20 UFC / unité). L&#39;étude précédente a été conçu pour imiter un événement clinique réel de contamination et les résultats ont montré la riboflavine et la lumière UV a été efficace dans la prévention de la croissance bactérienne au cours de la période de stockage des plaquettes de 7 jours. Modélisation basée sur les données de l&#39;étude précédente suggère que les estimations actuelles du risque de contamination bactérienne de produits plaquettaires pourraient être réduits par autant que 98% des niveaux actuels 8. Le processus de riboflavine et la lumière UV se compare favorablement à l&#39;écran bactérienneING, qui ne fait preuve d&#39;une efficacité de 66% pour détecter les contaminants bactériens dans les unités de plaquettes en cas de contestation avec une charge bactérienne cliniquement pertinente 8. Comme avec toutes les technologies, le traitement PRT de produits plaquettaires pour prévenir les complications associées à des unités de plaquettes contaminés par des bactéries a ses limites. Systèmes PRT ne sont pas efficaces contre les spores bactériennes et ne inactivent endotoxine, donc même si un système PRT peut inactiver des titres élevés de bactéries à Gram négatif l&#39;endotoxine restant peut encore provoquer un choc septique chez le receveur. PRT est préférable d&#39;effectuer tôt au cours du stockage avant que les bactéries peuvent se propager à des titres élevés. En conclusion, comme l&#39;a démontré par la combinaison de ces deux études, le processus de la riboflavine et la lumière UV est efficace pour réduire les charges bactériennes des deux organismes Gram positifs et Gram négatif et peut offrir une alternative viable au dépistage bactérienne. Régulièrement treating produits plaquettaires avec la riboflavine et la lumière UV a aussi l&#39;avantage de réduire la transmission potentielle d&#39;autres agents transmissibles par le sang comme les virus et les parasites.

La transfusion de plaquettes, plasma, globules rouges emballés et de produits sanguins entiers jouent un rôle majeur dans la médecine moderne et peut être utilisé pour traiter diverses conditions médicales, remplacer les liquides vitaux et, finalement, sauver des vies. Les plaquettes sont un produit cellulaire qui sont soit isolé à partir de sang total et regroupées dans une dose transfusable ou sont collectées à travers le processus d&#39;aphérèse. Le rôle principal de plaquettes dans le corps est pour arrêter le saignement au niveau des sites de la plaie et pour aider à maintenir l&#39;hémostase. Les patients souffrant d&#39;une faible numération cellulaire plaquettaire (thrombocytopénie) sont sensibles aux événements de saignements spontanés et sont transfuser des plaquettes à apporter leur cellule de numération plaquettaire de nouveau dans une fourchette normale. Les plaquettes collectées sont stockées pour un maximum de 5-7 jours et sont conservés à 22 ± 2 ° C tout sous agitation constante. Malgré le gain de propriétés de transfusions de plaquettes vie, il reste un léger risque pour les receveurs de transfusion en raison de contamination de ces produits par les parasites, les bactéries et les virus 11. La mise en œuvre des tests d&#39;acide nucléique viral (NAT) a diminué de façon significative le risque de transmission virale de diffusion hématogène principaux agents, tels que le virus de l&#39;hépatite C (VHC), virus de l&#39;hépatite B (VHB) et le virus de l&#39;immunodéficience humaine (VIH) 5. Une publication récente de l&#39;Société canadienne du sang estime que le risque résiduel pour ces agents serait de 1 pour 8 millions de dons pour le VIH, 1 par 6,7 millions de dons pour le VHC et 1 par 1,7 million de dons pour le VHB 15. Bien que les bactéries Garner généralement moins d&#39;attention dans le grand public, la fréquence de la contamination bactérienne dans les produits de plaquettes a été estimée à être aussi élevé que 1: 1000 7 et parce que des millions de produits plaquettaires sont transfusées chaque année de nombreux bénéficiaires sont exposés à un danger de mort des complications comme la septicémie 6. La recherche suggère que la charge bactérienne à l&#39;époquede contamination est faible, &lt;100 unités formant colonie (UFC) / produit 2,16, mais le riche environnement et la température ambiante entreposage d&#39;éléments nutritifs permet bactéries contaminantes à proliférer dangereusement élevés des titres avant la transfusion. Actuellement, les méthodes approuvées seulement disponibles pour empêcher les produits contaminés par des bactéries d&#39;atteindre un destinataire de plaquettes est par l&#39;utilisation de systèmes fondés sur la culture et point rapide de tests de soins. En bref, pour les systèmes de culture à base de produits de plaquettes sont stockées sur un agitateur à 22 ° C pendant 12 à 24 h pour permettre aux bactéries de proliférer dans le produit, sur lequel un échantillon de 4-8 ml est éliminé du produit de plaquettes et inoculé dans un flacon contenant des milieux nutritifs. La bouteille est placée dans un instrument qui surveille la bouteille pour la croissance bactérienne. Si l&#39;instrument détecte la croissance bactérienne dans la bouteille, il se trouve en position et l&#39;unité de plaquettes correspondant est éliminé. Bien que ce processus est raisonnablement réussi à détecter gro rapideorganismes de l&#39;aile, la plupart des espèces à croissance lente ne poussent pas à un titre suffisamment élevé pour être détecté, créant ainsi le potentiel d&#39;unités faux négatifs à être libéré pour la transfusion 7,12,14,16,22. Contrairement fondés sur la culture des systèmes de détection, le point rapide de tests de soins est généralement effectuée plus tard dans la période de stockage des plaquettes lorsque la charge bactérienne a augmenté de manière significative. Les titres plus élevés sont nécessaires puisque le point de tests de soins sont moins sensibles que les systèmes fondés sur la culture, et seulement détecter de manière fiable les bactéries une fois qu&#39;ils atteignent un titre ≥1 x 10 3 UFC / ml 17. Cependant, de tels tests peuvent fournir des résultats en 1 heure de l&#39;échantillonnage. La variabilité de la performance de ces tests ont conduit à la libération d&#39;un produit de faux négatifs, ce qui provoque une réaction septique fatale chez le receveur 9. Une autre manière de lutter contre le problème de la contamination bactérienne de produits plaquettaires est grâce à l&#39;utilisation de routine d&#39;un proc de réduction des agents pathogènesESS qui peuvent inactiver les bactéries contaminantes lieu d&#39;essayer de les détecter. Utilisation de la riboflavine comme photosensibilisant, en combinaison avec de la lumière UV, on a démontré à réduire l&#39;infectivité d&#39;un large éventail de contaminants pathogènes à diffusion hématogène, y compris les bactéries 3,4,8,10,19-21 .L&#39;utilisation de riboflavine et UV la lumière pour la réduction des agents pathogènes est non-toxique et non mutagène, et riboflavine et UV composants légers traités ont été montré pour être sans danger pour les transfusés ainsi que pour ceux qui manipulent les produits sanguins 18. En bref, des molécules riboflavine peut associer aux acides nucléiques (ADN et ARN) des bactéries, des parasites, des virus et des cellules nucléées (par exemple les globules blancs). L&#39;exposition à la lumière UV active la riboflavine, ce qui provoque une modification chimique de groupes fonctionnels des acides nucléiques (bases de guanine principalement), empêchant ainsi la réplication et / ou la transcription des acides nucléiques et en laissant l&#39;organisme inactivé 13. Cellules anucléées comme plaqueet permet aux globules rouges ne sont pas affectés par la chimie de la riboflavine en raison de l&#39;absence de l&#39;acide nucléique. Des travaux antérieurs avec la technologie la riboflavine et la lumière UV a évalué un groupe restreint de bactéries en utilisant une conception expérimentale visant à imiter un produit plaquettaire contaminé par une charge bactérienne cliniquement pertinente (&lt;20 UFC / produit) 8. Le but de cette étude était d&#39;évaluer le processus de riboflavine et la lumière UV contre la contamination bactérienne de titre élevé (&gt; 1,0 x 10 5 UFC / ml) dans les produits plaquettaires traités dans le plasma afin de mesurer la capacité de réduction bactérienne totale du système. Basé sur des données recueillies à partir d&#39;études d&#39;hémovigilance 1, un panel d&#39;survenant couramment organismes Gram positifs et négatifs du gramme a été sélectionné pour l&#39;évaluation dans cette étude et inclus les espèces suivantes: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Brucella neotomae, Bacillus cereus (forme végétative), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae. Tous les organismes, à l&#39;exception B. cereus, on a obtenu auprès de l&#39;ATCC et la priorité a été placée obtention de souches bactériennes qui ont été identifiés comme étant isolé à partir de composants sanguins. Le B. cereus testée dans cette étude est une souche clinique isolée à l&#39;intérieur d&#39;un produit plaquettaire contaminé.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mirasol Illuminator</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Ac&#8226;T diff&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Analyzer</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidLab 1265&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Docking Device</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Incubator</td>
			<td>Helmer</td>
			<td>PC2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Incubator Shaker</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td align="right">4628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Iso-temp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo-forma</td>
			<td align="right">1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td>Smart Sealer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Centra GP8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Dilution Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>R-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mL 500 &#181;M Riboflavin</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>35 mL 500 &#181;M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella Agar with 5% Horse Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td align="right">221547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>B9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Water</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">257087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">299113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination

La contamination des unités de plaquettes par les bactéries est reconnu depuis longtemps comme un risque de transfusion en raison de leur importante des conditions de stockage après le don. Les produits sont stockés en routine à 22 ° C dans un agitateur sous agitation, une condition qui peut promouvoir la croissance bactérienne. Bien que le nombre total de bactéries censées être introduits dans un produit de plaquettes est extrêmement faible, ces bactéries peuvent se multiplier à un titre très élevé avant la transfusion, ce qui pourrait entraîner des effets indésirables graves. Le but de cette étude était d&#39;évaluer un processus de réduction des agents pathogènes de la riboflavine base sur un panel de bactéries qui ont été identifiés comme des contaminants courants de produits plaquettaires. Ce groupe comprenait les organismes suivants: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa et K. pneumoniae. Chaque unité plaquettaire a été inoculé avec une charge bactérienne élevée et ont été retirés des échantillons both avant et après traitement. Une colonie essai de formation, en utilisant un schéma point de dilution final, a été utilisé pour déterminer les titres bactériennes pré-traitement et de post-traitement. Connexion réduction a été calculé en soustrayant le titre du titre de pré-traitement de post-traitement. Les réductions de journaux suivants ont été observés: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4.0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 journal (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) et K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Les résultats de cette étude suggèrent que le processus pourrait aider à réduire le risque de graves incidents transfusionnels indésirables associés à la contamination bactérienne.

La réduction de onze espèces bactériennes différentes a été évaluée en utilisant le procédé EPR de riboflavine et la lumière UV. Ces agents représentent certains des contaminants les plus courants de produits plaquettaires et comprennent cinq Gram positif et Gram six organismes négatifs. Au moins six produits ont été évalués par des plaquettes organisme et chaque produit a été inoculées avec suffisamment de bactéries pour donner&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml titre final de bactéries dans le produit de plaquettes. Avant le traitement d&#39;un échantillon a été prélevé pour déterminer le titre de pré-traitement, après quoi le produit a été rapidement des plaquettes traitée avec la riboflavine et procédé UV. Après le traitement des produits plaquettaires les réductions de journaux suivants ont été observés: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4.0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B.neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥ 5,4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) et K. pneumoniae 2,8 log (99,8%) (figure 2). Toutes les unités ont rencontré les spécifications du système comme indiqué ci-dessus pour la riboflavine et le processus UV. Les tests de réduction supplémentaire a été réalisée avec S. pyogenes utilisant Buffy coat plaquettes dérivées. Aucune différence significative n&#39;a été observée dans la réduction de S. pyogenes dans couenne plaquettes dérivées par rapport aux plaquettes d&#39;aphérèse (données non présentées). <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tableau 1: conditions de croissance pour les espèces bactériennes évaluées à l&#39;aide de la riboflavine et la lumière UV. Un panel de deux bactéries à Gram positif et Gram négatif qui ont été montrés à contaminer les produits plaquettaires ont été sélectionnés pour cette étude. Les conditions de croissance (température et les médias de type) utilisés pour propager et titer les organismes sont présentés. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Figure 1: La riboflavine et UV processus de réduction de la lumière de l&#39;agent pathogène. La riboflavine est dissous dans 0,9% de solution saline à une concentration nominale de 500 uM. La solution était stérile connecté et drainé dans chaque produit plaquettaire. Les bactéries ont été ajoutés de manière aseptique dans chaque unité de plaquettes et ensuite traités avec 6,2 J / ml de l&#39;énergie UV (environ 6-10 minutes). Dans cette étude in vitro de l&#39;unité de traitement post-plaquettaire a été échantillonné pour déterminer le titre bactérienne finale. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Figure 2: Réduction de différentes espèces bactériennes lorsqu&#39;ils sont traités avec la riboflavine et la lumière UV riboflavine et la lumière UV a été utilisé pour réduire la charge bactérienne de contaminants bactériens courants de produits plaquettaires.. La réduction log 10 est la différenceentre le titre de pré-traitement moyen et la moyenne titre post-traitement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Le traitement des produits plaquettaires avec riboflavine et la lumière UV: Efficacité contre Haute Titer contamination bactérienne

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K vues.  Scientific Affairs. The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Vidéo: Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

L&#39;infection des embryons de poisson zèbre avec bactéries pathogènes intracellulaires

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Recherche

Immunologie et infection

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Un test Parasite sauvetage et à la transformation pour le dépistage anti-leishmaniose contre intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes dans THP1 humaines ligne leucémie aiguë monocytaire cellulaire

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentiviral vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types of cells. Because of safety concerns associated with these HIV-1 derived vectors, producing large quantities of LVs is challenging. In this paper, we report a method for producing high titers of self-inactivating LVs. We retrovirally transduce the tet-off stable producer cell line GPR to generate a cell line, GPRS, which can express all the viral components, including a dendritic cell-specific glycoprotein, SVGmu. Then, we use concatemeric DNA transfection to transfect the LV transfer plasmid encoding a reporter gene GFP in combination with a selectable marker. Several of the resulting clones can produce LV at a titer 10-fold greater than what we achieve with transient transfection. Plus, these viruses efficiently transduce dendritic cells in vitro and generate a strong T cell immune response to our reporter antigen. This method may be a good option for producing strong LV-based vaccines for clinical studies of cancer or infectious diseases.

Here, we use retroviral transduction and concatemeric transfection to create a cell line that can express the components of a lentiviral vector (LV) in the absence of tetracycline. This LV encodes GFP and is pseudotyped with a glycoprotein, SVGmu, which is specific for a receptor on dendritic cells.

Un régulée par la tetracycline lignée cellulaire produit vecteurs lentiviraux titre élevé qui ciblent spécifiquement les cellules dendritiques

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants de transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Un haut débit de Shigella-test bactéricide spécifique

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic meurtre dosage pour évaluer les réponses immunologiques contre les bactéries pathogènes

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Mesure de taux de Détraduction mycobactériens spécifiques avec des systèmes de reporter à gain de fonction

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Production de particules pseudotypées de grippe infectieuse à haut régime avec des glycoprotéines d'enveloppe provenant de virus H5N1 hautement pathogènes et de virus H7N9 aviaires

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

Établissement d’un modèle de cornée Porcine Ex Vivo pour l’étude des traitements médicamenteux contre la kératite bactérienne

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...