The authors have no acknowledgements.

1. Preparação: suspensão de bactérias <ol><li> A partir de uma placa de cultura de estrias, inocular assepticamente uma única colónia em um frasco de 250 ml esterilizado, contendo 100 ml do meio de crescimento apropriado (Tabela 1) por meio de ansa de inoculação estéril. </li><li> Colocar o frasco dentro de um incubador com agitação orbital a as condições adequadas (Tabela 1) durante 1-2 dias, verificando-se o crescimento periodicamente. Defina a velocidade do agitador a 140 RPM. </li><li> Transferir assepticamente a suspensão bacteriana em dois tubos de 50 ml estéreis cónicos e os tubos de centrífuga a 3000 xg durante 20 min a 23 ° C. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender cada pellet bacteriano com 15 ml de água de peptona estéril. Vortex conforme necessário. Combine a cultura de bactérias suspensas em um tubo / container. </li><li> Titule a cultura de reserva em triplicado por seção 4 para determinar o título cultura estoque. </li><li> Leve à geladeira por até 2 semanas a 477; 2 ° C até ser necessário. Re-título na cultura no momento da utilização, ver passo 4.8. </li></ol> 2. Preparação de plaquetas produto: <ol><li> Recolha um produto de plaquetas humano aférese padrão em um banco de sangue credenciada. O produto de plaquetas deve atender às seguintes especificações de coleta: 90-360 ml de volume e 0,8 -3,8 x 10 6 plaquetas / ul concentração. <ol><li> Certifique-se de que o produto de plaquetas tem descansado para um mínimo de 2 horas antes do processamento para redução de patógenos. Armazenamento dos produtos a 22 ± 2 ° C num incubador de plaquetas sem agitação durante estes 2 h. Depois de duas horas de garantir que o produto de plaquetas é agitada a 22 ± 2 ° C num incubador de plaquetas. Use o produto por até 22 horas após coleta. </li></ol></li><li> Utilizando uma seringa de 3 ml de remover uma amostra de 2 mL para medir a 22C do produto em plaquetas de pH. Use um analisador de gases de sangue para garantir que o produto tem um pH&gt; 6.6. Utilizar a mesma amostra para medir a concentração de plaquetas de o produto de plaquetas usando um analisador hematológico. Verifique se o produto atende a 0.80-3.8 x 10 6 plaquetas / ul exigência concentração coleção. </li><li> Visualmente avaliar o redemoinho do produto plaquetas. Se o produto tem um &quot;0&quot; homogeneizar o produto vai ser descartado. </li><li> Mantenha o saco de plaquetas-se sob uma fonte de luz branca direta e aperte o saco de plaquetas brevemente. Visualmente observar o padrão de roda da amostra de plaquetas. Pontuação do produto utilizando a seguinte escala. NOTA: 2 - redemoinho Positivo: roda inhomogeneity visível ao longo de todo o saco com forte contraste. 1 - Intermediate Swirl: Alguns inhomogeneity visível, mas apenas em alguns lugares e com pouco contraste. 0 - redemoinho negativo: homogeneidade Turbid restante antes e depois apertar o saco de plaquetas </li></ol> Processo 3. A riboflavina e UV Light: <ol><li> TranSfer o produto de plaquetas para um riboflavina e UV iluminação de luz e saco de armazenamento utilizando um dispositivo de tubo de encaixe estéril. Após a transferência remover o saco de recolha de unidade de plaquetas vazio usando um aferidor de tubulação e descartar o saco vazio como resíduo bioinfectante. </li><li> Remover uma bolsa de 35 ml de 500 mM riboflavina solução estoque de sua luz invólucro exterior de protecção. Doca estéril o kit de riboflavina para a linha de entrada do tratamento e armazenamento de saco. Deixar o conteúdo para drenar para dentro da unidade de plaquetas. </li><li> Pendure a bolsa / tratamento e armazenagem saco riboflavina definido a partir da bolsa riboflavina e expressar suavemente ar residual para fora do tratamento e armazenamento de saco e para o saco de riboflavina. Assegurar uma pequena quantidade de produto de plaquetas também é expresso na bolsa de riboflavina para enxaguar qualquer riboflavina residual no produto de plaquetas. Permitir que a solução riboflavina e plaquetas drenar de volta para o tratamento e armazenamento de saco e, em seguida, apertar a linha de entrada. Retire o saco vazio nos riboflavinaing um aferidor de tubulação e descartar o saco vazio como resíduo bioinfectante. </li><li> Doca estéril uma &quot;linha 6 tubos com conector de seringa fêmea para a linha de entrada da iluminação e saco de armazenamento. Anexar uma seringa de 10 ml (remover o êmbolo) na conexão seringa feminino. </li><li> Adicionar assepticamente 5 ml de bactérias de ações para o corpo da seringa através de uma pipeta. Abrir o grampo na linha de entrada e permitir que a bactéria seja drenado para o produto de plaquetas. Lavar o corpo da seringa, permitindo que algum produto de plaquetas a fluir de volta para o corpo da seringa de 10 ml. Remover o tambor da seringa de 10 ml. </li><li> Assepticamente anexar uma seringa de 30 mL e lavar a porta de entrada de um mínimo de duas vezes para assegurar que as bactérias banco é misturado no produto de plaquetas. Depois que o produto é bem misturado, utilizar uma seringa limpa 5-10 ml e remover uma amostra de 2 ml pré-tratamento. Utilizando uma nova seringa assegurar que o ar introduzido a partir do passo a inoculação ou amostragem passo é removido. <ol><li> Titular a amostra pré-tratamento por seção 4. </li></ol></li><li> Remova a linha de entrada do tratamento e armazenamento de saco e pesar o produto. </li><li> Colocar o produto para o iluminador e seguir os comandos de ecrã para começar um tratamento de plaquetas padrão. <ol><li> Digite na Operator ID. </li><li> Seguros e montar o saco para a placa iluminador. </li><li> Digite o ID da amostra para o Iluminador usando o leitor de código de barras ou o teclado de entrada manual. </li><li> Tipo de produto Scan. </li><li> Fechar o grampo de quartzo. </li><li> O dispositivo de iluminação irá entregar automaticamente 6,24 J / ml de energia. O tempo de tratamento típico demora 5-10 min. </li></ol></li><li> Após o tratamento doca estéril uma &quot;linha 6 tubos com conector de seringa fêmea para a linha ampola da amostra de tratamento e saco de armazenamento. Verifique se o produto é bem misturado e em seguida, anexar uma seringa de 5 ml e remover um 2 ml da amostra de pós-tratamento. <ol><li> Titule a pós-tratamento samsoas por seção 4. </li></ol></li></ol> 4. bacteriana Titer <ol><li> Estimar o título das amostras de pré-tratamento e pós-tratamento e preparar o número apropriado de tubos de 5 ml de diluição necessário para efectuar uma diluição em série ponto final de cada amostra. Assepticamente encher os tubos necessários com 1,8 ml de água peptonada. </li><li> Titer cada amostra utilizando um regime de diluição em série de 10 vezes. Transferir assepticamente 0,2 ml da amostra não diluída para o primeiro tubo de diluição (10 -1). Vortex este tubo de diluição e de transferência de 0,2 ml para o próximo tubo de diluição. Continuar a diluição em série através do número necessário de diluições. <ol><li> Transferência assepticamente 100 ul de cada diluição a ser revestida a uma placa de agar apropriado (Tabela 1). </li></ol></li><li> Usando um espalhador de células estéril, distribuir uniformemente a amostra em cada placa de ágar. </li><li> Inverter e incubar as placas nas condições apropriadas ( <strong&gt; Tabela 1) por 1-2 dias de testes para o crescimento periodicamente. </li><li> Contagem de placas com 30-300 colônias. As placas contendo mais de 300 colônias são considerados demasiado numerosos para contar (TnTc). As placas que continham menos de 30 colónias são considerados abaixo do limite de quantificação (LOQ). </li><li> Calcula-se a título de cada amostra de teste e gravar os resultados como CFU / ml. <ol><li> Utilize a seguinte equação para calcular CFU / ml: <img alt="Equação 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Se não houver colônias na placa de diluição menor, use a seguinte equação para calcular o limite de detecção (LOD): <img alt="Equação 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> e <img alt="Equação 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Onde: N = número de partículas menor (CFU) em produto que pode ser detectado com segurança. P = probabilidade de que um microorganismo será não detectado; para 95% de confiança de detecção de um microrganismo, P = 0,05. V = volume total do produto em ml v = volume banhado (ml) x nível de diluição de placa </li></ol></li><li> Para controlo negativo, placa 0,5 ml de peptona a água que é utilizado para as diluições em série em cada uma das duas placas de agar. Utilizar o mesmo tipo de placa como as amostras a serem testadas. Inverter e incubar a placa em condições adequadas por 1-2 dias a verificação de crescimento periodicamente. <ol><li> Se o crescimento é observado em qualquer placa de ágar, a garrafa de água peptonada usado deve ser eliminado; os resultados do estudo também são invalidados. </li></ol></li><li> Para Controlo Positivo, re-titulação da cultura de reserva de bactéria que foi usado. Inverter e incubar as placas com as condições adequadas para 1-2 dias para verificar o crescimento periodicamente. O título deve ser de ± 1,0 log ufc / ml do registroed título de estoque (ver secção 1.5) para o estudo seja considerado válido. </li></ol>

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Todos os autores deste trabalho está empregado atualmente pela Terumo BCT, desenvolvedora e fabricante do sistema Mirasol PRT. Taxas de publicação do video-artigo foram pagos pela Terumo BCT.

Triagem bacteriana tornou-se prática comum nas instituições bancárias de sangue e para muitos locais que serve como o principal método para evitar a transfusão de plaquetas contaminadas com bactérias. Embora o rastreio bacteriana normalmente interdita a maioria de rápido crescimento de bactérias Gram negativas, como S. marcescens, E. coli e E. cloacae, ele se esforça para detectar crescimento lento bactérias Gram positivas como S. aureus, Streptococcus spp., e S. epidermidis 8. Infelizmente, estes três bactérias Gram-positivas estão implicados em para cima de 50% de todas as unidades de plaquetas contaminadas e transfusão de plaquetas dos produtos contendo estes três organismos tem conduzir a mortalidade dos pacientes 1. Rastreio bacteriano baseia-se na titulação bacteriana num produto de plaquetas de ser suficientemente elevada de modo a que pelo menos um organismo está contido dentro do típico 4-8 ml da amostra de rastreio. Se o título bacteriana não é suficientemente elevado para uma bactéria para ser capturado no volume de amostra 4-8 ml, a unidade está incorretamente sinalizado como negativa e ele é liberado para transfusão. Uma abordagem alternativa ao rastreio bacteriana pode ser empregar um processo de pró-activo que pode ser realizada em todas as unidades de plaquetas e que pode tornar os organismos contaminantes como não funcional. Neste estudo, os títulos elevados de bactérias foram propositadamente adicionadas às unidades de plaquetas para testar a capacidade de redução total do processo de redução de luz patógeno riboflavina e UV. Embora as cargas bacterianas testadas neste estudo ultrapassam de longe os normalmente encontrados em produtos de sangue, no momento da doação, este estudo ajuda a demonstrar que o processo de riboflavina e luz UV é capaz de reduzir significativamente a título de bactérias viáveis ​​numa unidade de plaquetas contaminado por 2,6 a 5,4 log (% de redução 99,7-99,9996 bactérias contaminantes) (Figura 2). Para obter uma accuravalor da redução log te, é fundamental que o operador tem boa técnica asséptica, juntamente com habilidades de pipetagem precisos ao realizar as etapas de titulação bacterianas. Pipetagem imprecisa ao realizar diluições em série podem conduzir a uma acumulação de erros, assim, uma medição título impreciso. Os dados coletados neste estudo apoia o trabalho anterior com riboflavina e luz ultravioleta, que desafiou o sistema contra baixo nível, bacteremia clinicamente relevantes (&lt;20 UFC / unidade). O estudo anterior foi concebido para mimetizar um evento contaminação clínica real e os resultados mostraram riboflavina e luz UV foi eficaz na prevenção do crescimento de bactérias ao longo do período de armazenagem de plaquetas de 7 dias. Modelando com base nos dados do estudo anterior sugere que as estimativas de risco de contaminação bacteriana de corrente de produtos de plaquetas pode ser reduzida em tanto quanto 98% em relação aos níveis de corrente 8. O processo de riboflavina e luz UV compara favoravelmente com tela bacterianaing, que só demonstrou uma eficácia de 66% para detectar contaminantes bacterianos em unidades de plaquetas quando desafiado com uma carga bacteriana clinicamente relevantes 8. Tal como acontece com todas as tecnologias, o tratamento PRT de produtos de plaquetas para evitar complicações associadas com unidades de plaquetas contaminadas com bactérias tem as suas limitações. PRT sistemas não são eficazes contra os esporos bacterianos e não inactivar endotoxinas, mesmo se, assim, um sistema PRT pode inactivar títulos elevados de bactérias Gram-negativas da endotoxina restante ainda pode causar choque séptico no receptor. PRT é melhor realizada precocemente durante o armazenamento antes que as bactérias podem se propagar para altos títulos. Em conclusão, conforme demonstrado pela combinação destes dois estudos, o processo de riboflavina e luz UV é eficaz em reduzir as cargas bacterianas de ambas as bactérias gram negativas e gram positivos e podem oferecer uma alternativa viável para a triagem bacteriana. Rotineiramente treatinprodutos g de plaquetas com riboflavina e luz UV também tem o benefício adicional de reduzir o potencial de transmissão de outros agentes transmitidos pelo sangue, como vírus e parasitas.

A transfusão de plaquetas, plasma, glóbulos vermelhos embalados e produtos de sangue total desempenhar um papel importante na medicina moderna e pode ser utilizada para tratar várias condições médicas, substituir fluidos vitais e, finalmente, salvar vidas. As plaquetas são um produto celular que, ou são isoladas a partir de sangue total, e reunido em uma dose ou transfusable são recolhidos através do processo de aférese plaquetária. O principal papel de plaquetas no corpo é para parar o sangramento em locais de feridas e para ajudar a manter a hemostasia. Pacientes que sofrem de uma contagem de células de plaquetas baixa (trombocitopenia) são suscetíveis a eventos hemorrágicos espontâneos e são transfundidos com plaquetas de trazer sua contagem de células de plaquetas para trás em um intervalo normal. Plaquetas recolhidos são armazenados durante um período máximo de 5-7 dias e são armazenadas a 22 ± 2 ° C enquanto sob agitação constante. Apesar de as propriedades de transfusões de plaquetas salvar a vida continua a haver um pequeno risco para receptores de transfusão devido a contamination desses produtos por parasitas, bactérias e vírus 11. A implementação de teste de ácido nucleico virai (NAT) diminuiu de forma significativa o risco de transmissão viral de sangue suportados agentes principais, tais como o vírus da hepatite C (HCV), vírus da hepatite B (HBV) e o vírus da imuno-deficiência humana (HIV) 5. Uma publicação recente do Canadian Blood Services estima o risco residual para esses agentes a ser de 1 por 8.000.000 doações para HIV, 1 por 6,7 milhões de doações para HCV e 1 por 1.700.000 doações para HBV 15. Embora as bactérias normalmente angariar menos atenção do público em geral, a frequência de contaminação bacteriana em produtos de plaquetas foi estimado para ser tão alta quanto 1: 1000 7 e porque milhões de produtos de plaquetas são transfundidos cada ano muitos destinatários estão expostos a potenciais complicações fatais como sepse 6. A investigação sugere que a carga bacteriana no momentode contaminação é baixo, &lt;100 unidades formadoras de colónias (UFC) / produto 2,16, no entanto, o ambiente rico em nutrientes e temperatura ambiente de armazenamento permite que bactérias contaminem a proliferar a perigosamente altos títulos antes da transfusão. Atualmente, os métodos só aprovados disponíveis para evitar que os produtos contaminados por bactérias de chegar a um destinatário de plaquetas é através do uso de sistemas de cultura de base e ponto rápido dos testes de cuidado. Resumidamente, para os sistemas de cultura de produtos à base de plaquetas são armazenadas em um agitador a 22 ° C durante 12-24 h, para permitir a proliferação de bactérias no produto, no qual uma amostra de 4-8 mL é retirada a partir do produto de plaquetas e inoculados num frasco contendo meio nutriente. O frasco é colocado num instrumento que monitora o frasco para o crescimento bacteriano. Se o instrumento detecta o crescimento bacteriano dentro da garrafa que é apanhado e a unidade de plaquetas correspondente é descartado. Enquanto este processo é razoavelmente bem sucedida na detecção de gro rápidoasa organismos, muitas das espécies de crescimento lento não crescem a um título suficientemente elevado para ser detectado, criando, assim, o potencial para as unidades de falsos negativos para ser lançado para a transfusão 7,12,14,16,22. Ao contrário dos sistemas de detecção de cultura com base, ponto de teste rápido cuidados é tipicamente realizada no final do período de armazenagem de plaquetas quando a carga bacteriana tem aumentado significativamente. Os títulos mais elevados são necessários dado que o ponto de cuidados testes são menos sensíveis do que os sistemas de cultura de base, e apenas detectar com fiabilidade, uma vez que as bactérias atingir um título ≥1 x 10 3 CFU / ml 17. No entanto, tais testes podem fornecer resultados dentro de 1 hora da amostragem. A variabilidade no desempenho destes ensaios levaram ao lançamento de um produto falso negativo, causando uma reacção séptico fatal no recipiente 9. Uma forma alternativa para combater o problema da contaminação bacteriana de produtos de plaquetas é através do uso de rotina de um agente patogénico Proc reduçãoess que podem inactivar bactérias contaminantes em vez de tentar detectá-los. Usando riboflavina como um fotossensibilizador, em combinação com luz UV, tem demonstrado reduzir a infecciosidade de uma vasta gama de contaminantes transmitidas pelo sangue patogénicos, incluindo bactérias 3,4,8,10,19-21 .A utilização de riboflavina e UV luz para a redução dos organismos patogénicos é não-tóxico e não-mutagênico, e componentes tratados com luz UV e riboflavina foram mostrados para ser seguro para receptores de transfusão, bem como para aqueles que manipulam produtos derivados de sangue 18. Resumidamente, as moléculas de riboflavina pode associar com os ácidos nucleicos (ADN e ARN) de bactérias, parasitas, vírus e qualquer célula nucleada (por exemplo, células brancas do sangue). A exposição à luz UV ativa riboflavina, causando uma alteração química de grupos funcionais dos ácidos nucleicos (principalmente bases de guanina), impedindo assim a replicação e / ou a transcrição dos ácidos nucleicos e deixando o organismo inactivado 13. Anucleadas como placae permite que as células vermelhas do sangue não são afectados pela química de riboflavina, devido à falta de ácido nucleico. Trabalhos anteriores com a tecnologia riboflavina e luz UV avaliaram um grupo seleto de bactérias usando um desenho experimental destina-se a imitar um produto de plaquetas contaminadas com uma carga bacteriana clinicamente relevante (&lt;20 UFC / produto) 8. O objetivo deste estudo foi avaliar o processo de riboflavina e luz UV contra a contaminação bacteriana título elevado (&gt; 1,0 x 10 5 UFC / ml) em produtos de plaquetas tratadas no plasma, a fim medir a capacidade de redução bacteriana total do sistema. Com base em dados recolhidos a partir de estudos de hemovigilância 1, um painel de comumente ocorrem organismos gram positivas negativas e gram foi selecionado para avaliação neste estudo e incluiu as seguintes espécies: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Neotomae Brucella, Bacillus cereus (forma vegetativa), Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae. Todos os organismos, exceto B. cereus, foram obtidas da ATCC e foi colocada uma prioridade na obtenção de estirpes bacterianas que foram identificados como sendo isolado a partir de componentes do sangue. O B. cereus testados neste estudo é uma estirpe clínica isolada internamente a partir de um produto de plaquetas contaminado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mirasol Illuminator</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Ac&#8226;T diff&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Analyzer</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidLab 1265&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Docking Device</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Incubator</td>
			<td>Helmer</td>
			<td>PC2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Incubator Shaker</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td align="right">4628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Iso-temp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo-forma</td>
			<td align="right">1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td>Smart Sealer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Centra GP8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Dilution Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>R-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mL 500 &#181;M Riboflavin</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>35 mL 500 &#181;M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella Agar with 5% Horse Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td align="right">221547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>B9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Water</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">257087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">299113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination

Contaminação de unidades de plaquetas por bactérias tem sido reconhecida como um risco significativo de transfusão, devido às suas condições de armazenamento pós-doação. Os produtos são rotineiramente armazenadas a 22 ° C num agitador de agitação, uma condição que pode promover o crescimento bacteriano. Embora o número total de bactérias que se acredita ser introduzida num produto de plaquetas é extremamente baixa, estas bactérias podem multiplicar-se a um título muito elevado antes da transfusão, potencialmente resultando em efeitos adversos graves. O objectivo deste estudo foi o de avaliar um processo de redução de agentes patogénicos riboflavina base contra um painel de bactérias que foram identificadas como contaminantes comuns de produtos de plaquetas. Este painel incluiu os seguintes organismos: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae. Cada unidade de plaquetas foi inoculado com uma alta carga bacteriana e as amostras foram removidas bOTH antes e após o tratamento. Um ensaio de formação de colónias, usando um esquema de diluição ponto final, foi usado para determinar os pré-tratamento e pós-tratamento títulos bacterianos. Redução log foi calculada subtraindo-se o título pós-tratamento do título de pré-tratamento. Foram observadas as seguintes reduções de log: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) e K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Os resultados deste estudo sugerem que o processo pode ajudar a diminuir o risco de eventos adversos graves transfusão associados à contaminação bacteriana.

A redução de onze diferentes espécies bacterianas foi avaliada utilizando o processo PRT baseado riboflavina e luz UV. Estes agentes representam alguns dos contaminantes mais comuns de produtos de plaquetas e incluem bactérias Gram-positivas e cinco seis organismos gram negativos. Pelo menos seis produtos de plaquetas foram avaliados por organismo e cada produto foi inoculado com bactérias suficiente para se obter&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml de bactérias título final no produto de plaquetas. Antes do tratamento, foi removida uma amostra para determinar o título de pré-tratamento, após o que o produto foi prontamente plaquetas tratadas com o processo de riboflavina e UV. Após o tratamento dos produtos de plaquetas foram observadas as seguintes reduções de log: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B.neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥ 5,4 log (99,9996%), aeruginosa 4,7 log P. (99,998%) e K. pneumoniae 2,8 log (99,8%) (Figura 2). Todas as unidades satisfeitas as especificações do sistema conforme indicado anteriormente para o processo de riboflavina e UV. Testes de redução adicional foi realizada com S. pyogenes usando creme leucocitário plaquetas derivadas. Não foi observada diferença significativa na redução de S. pyogenes em creme leucocitário plaquetas derivadas de plaquetas por aférese contra (dados não mostrados). <img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tabela 1: As condições de crescimento para as espécies bacterianas avaliadas usando riboflavina e luz UV. Um painel de ambas as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas que foram mostrados para contaminar os produtos de plaquetas foram seleccionados para este estudo. As condições de crescimento (temperatura e tipo de mídia) utilizados para propagar e titer os organismos são mostrados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Figura 1: processo de redução de luz patógeno riboflavina e UV. Riboflavina foi dissolvido em 0,9% de solução salina a uma concentração nominal de 500 um. A solução foi esterilizada e ligado drenada para cada produto de plaquetas. As bactérias foram adicionados assepticamente para cada unidade de plaquetas e, em seguida, tratada com 6,2 J / ml de energia UV (aproximadamente 6-10 minutos). Neste estudo in vitro a unidade de plaquetas pós-tratamento foram amostrados para determinar o título bacteriano final. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Figura 2: Redução de diferentes espécies bacterianas, quando tratados com riboflavina e luz UV riboflavina e luz UV foi usada para reduzir as cargas bacterianas de contaminantes bacterianos comuns de produtos de plaquetas.. A redução log 10 é a diferençaentre a média título de pré-tratamento e da média título pós-tratamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Tratamento de produtos de plaquetas com riboflavina e luz UV: Eficácia Contra alta Titer contaminação bacteriana

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.5K visualizações.  Scientific Affairs. The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Vídeo: Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions 1. The major cell types of the innate immune system, macrophages and neutrophils, develop during the first days of embryogenesis prior to the maturation of lymphocytes that are required for adaptive immune responses. The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, the optical transparency of embryonic and larval stages, a wide range of genetic tools, extensive mutant resources and collections of transgenic reporter lines, all add to the versatility of the zebrafish model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) and Mycobacterium marinum can reside intracellularly in macrophages and are frequently used to study host-pathogen interactions in zebrafish embryos. The infection processes of these two bacterial pathogens are interesting to compare because S. typhimurium infection is acute and lethal within one day, whereas M. marinum infection is chronic and can be imaged up to the larval stage 2, 3. The site of micro-injection of bacteria into the embryo (Figure 1) determines whether the infection will rapidly become systemic or will initially remain localized. A rapid systemic infection can be established by micro-injecting bacteria directly into the blood circulation via the caudal vein at the posterior blood island or via the Duct of Cuvier, a wide circulation channel on the yolk sac connecting the heart to the trunk vasculature. At 1 dpf, when embryos at this stage have phagocytically active macrophages but neutrophils have not yet matured, injecting into the blood island is preferred. For injections at 2-3 dpf, when embryos also have developed functional (myeloperoxidase-producing) neutrophils, the Duct of Cuvier is preferred as the injection site. To study directed migration of myeloid cells towards local infections, bacteria can be injected into the tail muscle, otic vesicle, or hindbrain ventricle 4-6. In addition, the notochord, a structure that appears to be normally inaccessible to myeloid cells, is highly susceptible to local infection 7. A useful alternative for high-throughput applications is the injection of bacteria into the yolk of embryos within the first hours after fertilization 8. Combining fluorescent bacteria and transgenic zebrafish lines with fluorescent macrophages or neutrophils creates ideal circumstances for multi-color imaging of host-pathogen interactions. This video article will describe detailed protocols for intravenous and local infection of zebrafish embryos with S. typhimurium or M. marinum bacteria and for subsequent fluorescence imaging of the interaction with cells of the innate immune system.

Transparent zebrafish embryos have proved useful model hosts to visualize and functionally study interactions between innate immune cells and intracellular bacterial pathogens, such as Salmonella typhimurium and Mycobacterium marinum. Micro-injection of bacteria and multi-color fluorescence imaging are essential techniques involved in the application of zebrafish embryo infection models.

A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Imunologia e Infecção

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Leishmaniasis is one of the world's most neglected diseases, largely affecting the poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million people are considered at risk of contracting leishmaniasis, and approximately 2 million new cases occur yearly1. Leishmania donovani is the causative agent for visceral leishmaniasis (VL), the most fatal form of the disease. The choice of drugs available to treat leishmaniasis is limited 2;current treatments provide limited efficacy and many are toxic at therapeutic doses. In addition, most of the first line treatment drugs have already lost their utility due to increasing multiple drug resistance 3. The current pipeline of anti-leishmanial drugs is also severely depleted. Sustained efforts are needed to enrich a new anti-leishmanial drug discovery pipeline, and this endeavor relies on the availability of suitable in vitro screening models.
In vitro promastigotes 4 and axenic amastigotes assays5 are primarily used for anti-leishmanial drug screening however, may not be appropriate due to significant cellular, physiological, biochemical and molecular differences in comparison to intracellular amastigotes. Assays with macrophage-amastigotes models are considered closest to the pathophysiological conditions of leishmaniasis, and are therefore the most appropriate for in vitro screening. Differentiated, non-dividing human acute monocytic leukemia cells (THP1) (make an attractive) alternative to isolated primary macrophages and can be used for assaying anti-leishmanial activity of different compounds against intracellular amastigotes.
Here, we present a parasite-rescue and transformation assay with differentiated THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani for screening pure compounds and natural products extracts and determining the efficacy against the intracellular Leishmania amastigotes. The assay involves the following steps: (1) differentiation of THP1 cells to non-dividing macrophages, (2) infection of macrophages with L. donovani metacyclic promastigotes, (3) treatment of infected cells with test drugs, (4) controlled lysis of infected macrophages, (5) release/rescue of amastigotes and (6) transformation of live amastigotes to promastigotes. The assay was optimized using detergent treatment for controlled lysis of Leishmania-infected THP1 cells to achieve almost complete rescue of viable intracellular amastigotes with minimal effect on their ability to transform to promastigotes. Different macrophage:promastigotes ratios were tested to achieve maximum infection. Quantification of the infection was performed through transformation of live, rescued Leishmania amastigotes to promastigotes and evaluation of their growth by an alamarBlue fluorometric assay in 96-well microplates. This assay is comparable to the currently-used microscopic, transgenic reporter gene and digital-image analysis assays. This assay is robust and measures only the live intracellular amastigotes compared to reporter gene and image analysis assays, which may not differentiate between live and dead amastigotes. Also, the assay has been validated with a current panel of anti-leishmanial drugs and has been successfully applied to large-scale screening of pure compounds and a library of natural products fractions (Tekwani et al. unpublished).

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A parasite-rescue and transformation assay with THP1 cells infected in vitro with Leishmania donovani has been optimized for anti-leishmanial drug screening. The assay involves differentiation of THP1 cells, infection with promastigotes, treatment with test drugs, controlled lysis of the infected macrophages, rescue of amastigotes, transformation to promastigotes and monitoring promastigote growth and proliferation with a fluorometric assay.

Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentiviral vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types of cells. Because of safety concerns associated with these HIV-1 derived vectors, producing large quantities of LVs is challenging. In this paper, we report a method for producing high titers of self-inactivating LVs. We retrovirally transduce the tet-off stable producer cell line GPR to generate a cell line, GPRS, which can express all the viral components, including a dendritic cell-specific glycoprotein, SVGmu. Then, we use concatemeric DNA transfection to transfect the LV transfer plasmid encoding a reporter gene GFP in combination with a selectable marker. Several of the resulting clones can produce LV at a titer 10-fold greater than what we achieve with transient transfection. Plus, these viruses efficiently transduce dendritic cells in vitro and generate a strong T cell immune response to our reporter antigen. This method may be a good option for producing strong LV-based vaccines for clinical studies of cancer or infectious diseases.

Here, we use retroviral transduction and concatemeric transfection to create a cell line that can express the components of a lentiviral vector (LV) in the absence of tetracycline. This LV encodes GFP and is pseudotyped with a glycoprotein, SVGmu, which is specific for a receptor on dendritic cells.

Uma linha de células Tetraciclina-regulado Produz Vetores Lentivirus alta titulação que visam especificamente as células dendríticas

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

Um do elevado-throughput Shigella-ensaio bactericida específico

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Ensaio de matar Opsonophagocytic para avaliar as respostas imunológicas contra patógenos bacterianos

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Medição de taxas de mistranslation micobacterianas específicas com sistemas de repórter de ganho de função

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious public health issues and suggest the possibility of an epidemic. However, our molecular understanding of the virus is rudimentary, and it is necessary to study the biological properties of its envelope proteins as therapeutic targets and to develop strategies to control infection. We developed a solid viral pseudotyped particle (pp) platform to study avian influenza virus, including the functional analysis of its hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) envelope glycoproteins, the reassortment characteristics of the HAs and NAs, receptors, tropisms, neutralizing antibodies, diagnosis, infectivity, for the purposes of drug development and vaccine design. Here, we describe an experimental procedure to establish pps with the envelope glycoproteins (HA, NA) from two influenza A strains (HAPI H5N1 and 2013 avian H7N9). Their generation is based on the capacity of some viruses, such as murine leukemia virus (MLV), to incorporate envelope glycoproteins into a pp. In addition, we also detail how these pps are quantified with RT-qPCR, and the infectivity detection of native and mismatched virus pps depending on the origin of the HAs and NAs. This system is highly flexible and adaptable and can be used to establish viral pps with envelope glycoproteins that can be incorporated in any other type of enveloped virus. Thus, this viral particle platform can be used to study wild viruses in many research investigations.

This protocol describes an experimental process to produce high-titer infectious viral pseudotyped particles (pp) with envelope glycoproteins from two influenza A strains and how to determine their infectivity. This protocol is highly adaptable to develop pps of any other type of enveloped viruses with different envelope glycoproteins.

Produção de partículas pseudodigitadas de gripe infecciosa de alto titer com glicoproteínas envelope de vírus H5N1 e H7N9 altamente patogênicos

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

Estabelecendo um modelo de córnea porcina ex vivo para estudar tratamentos medicamentosos contra ceratite bacteriana

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...