Work in Dr. Ogunwobi&#8217;s laboratory is supported by a Research Centers in Minority Institutions Program grant from the National Institute on Minority Health and Health Disparities (MD007599) of the National Institutes of Health. The contents of this manuscript are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIMHD or the NIH.

倫理の声明：すべての動物実験は、ニューヨーク市立大学ハンターカレッジの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。 1.前の実験手順<ol><li>動物施設に到着すると、最初にフィルタトップと木材チップの寝具をケージに3匹のBALB / cマウスを収容します。マウスは食品、ピュリナ齧歯類固形飼料および水を自由にアクセスできることを確認します。ケージは週に一度クリーニングする必要がありながら、寝具や食品を週に2回変更する必要があります。 </li><li>毎分1リットルの一定流量で酸素と一緒にイソフルラン気化器を使用して、マウスでの全身麻酔を誘導します。システムは、自立であり、精密な気化器が含まれています。 </li><li>精密気化器とそれに接続されたガス/麻酔システムを持っているプラ​​スチック製の箱の位置動物。動物は2に気化器を下げ、その時点で、意識不明になるまで、最初は2.5に気化器を設定します。 </li><li>その時、スイッチバルブライン、ボックスにそれをシールし、ノーズコーンにそれを開きます。 </li><li>ノーズコーン（メンテナンス麻酔のために）適切に配置し、接続して、準備領域に動物を移動します。 </li><li>マウス当たりの移植のために5×10 6 BNL 1ME A.7R.1マウスHCC細胞を準備します。 BNL 1ME A.7R.1培地中で増殖されるべきである（10％熱不活化FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミン）空気及び5％の加湿インキュベーター中、37℃で細胞培養皿中でインキュベートCO 2。 </li><li>シリンジ20 G針を有する、BALB / cマウスの肝臓の葉に5×10 6 BNL 1ME A.7R.1マウス肝細胞癌細胞を含むPBSを100μlのインプラントは、原発腫瘍を生成します。移植後、社内着床前と同じ家の要件にケージ内のBALB / cマウス。 </li><li>実験のエンドポイントで、肝細胞癌の臨床的証拠は、身体条件の有意な減少として観察されますスコア（通常は4週間後に検出されます）。この時点では、転移性の堆積物が肺に形成されているが、一次腫瘍は肝臓で開発している可能性があります。その後、循環腫瘍細胞の単離および増殖のプロセスを開始します。 </li></ol>腫瘍細胞の単離を循環させるための全血の2コレクション注：適切に手術領域を消毒し、それが乱雑フリーであることを確認してください。すべての手術器具をオートクレーブするか、製造元の推奨に従って消毒剤に浸し<ol><li>実験のエンドポイントでの人道的な安楽死（腫瘍発生の臨床的証拠）によりマウスを生け贄に捧げます。マウスの安楽死は、CO 2窒息を関与させるべきです。麻酔が正しく配布されて確認するために、適切にマウスを守ってください。呼吸停止を起こし、10分 - 二酸化炭素は5かけてチャンバー内にゆっくりと放出されるべきです。心臓内放血とcervicによってフォローアル脱臼。5 </li><li>全血の収集のための1mlシリンジに取り付けた25 G針を使用してください。 0.01ミリリットルヘパリンと注射器をHeparanize。約45°の角度でxyphisternumに劣る針とすぐにパンク肌。心を穿刺するために、ゆっくりと針を進め、その後、針の角度を下げます。着実な場所に針と注射器を保持し、500μlの引き出し - 心臓から全血を1000μLを。 </li><li>注射器と針を外し、前標識された1.5ミリリットルの発熱物質を含まないチューブに血液を移します。 5分間1167×gで1.5ミリリットルの発熱物質を含まないチューブに採取した全血を遠心分離します。 注：遠心分離を3層に全血試料を分離：赤血球、軟膜の中間薄層、および上部血漿層からなる下部層またはヘマトクリット。 </li><li>ピペットで慎重にプラズマを取り外し、フュルトのための独立した1.5​​ミリリットルの発熱物質を含まないチューブにそれを集めますそのような無細胞核酸の検出7としてER実験。 </li><li>循環腫瘍細胞（CTCの）を単離するために、赤血球（RBC）溶解の準備のために別々の1.5 mlの発熱物質を含まないチューブに軟膜を収集します。これは、バフィーコート層中の残留赤血球を除去する必要があります。 </li></ol>赤血球（RBC）溶解バッファー3.レシピ<ol><li> RBC溶解緩衝液1 L溶液を作ります。 </li><li>塩化アンモニウムの500ミリリットルとトリスの500ミリリットルを行います。その後、塩化アンモニウムの155 mMのトリスと10mMの最終濃度でRBC溶解緩衝液の1リットルの溶液を作成するために混合します。 </li><li> 7.5のpHに解決策をバッファ。 2 +8℃でのRBC溶解バッファを保存し、使用前に、すぐに室温にもたらします。 </li></ol>軟膜の4 RBC溶解<ol><li>収集したバフィーコートを含む滅菌した発熱物質を含まない1.5mlチューブにRBC溶解緩衝液1mlを追加します。 </li><li>により、チューブの内容物を混合複数回転倒。ベンチに室温で5分間チューブの混合された内容物をインキュベートします。遠心1167×gで5分間混合した内容物。 </li><li>遠心分離後、白っぽいペレットが得られます。ペレットを中断することなく、ゆっくりと慎重に、10％の漂白剤に赤みを帯びた上清を捨てます。 3.5 - ペレットが白っぽくていない場合は、再doが3.1を繰り返します。 10にRBC溶解緩衝液中でインキュベーション時間を増やす - 15分することも有用であろう。 </li><li> 10％の漂白剤での生物学的廃棄物の除染は、24時間後に完了すると、安全に生物学的廃棄物を処分します。 </li></ol>細胞培養物中の5伝播注：腫瘍細胞は、通常、急速に細胞をシャーレに播種した細胞のオリジナルミックスに豊富に存在する白血球を拡大しています。媒体の繰り返し変更、CTCのその後の継代の後、全ての白血球が除去され、CTCの比較的純粋な集団が残ります。 <ol><li>後10％の漂白剤に上清を廃棄し、少なくとも一回1 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に白っぽいペレットを洗浄し、細胞培養における増殖のための完全培地中で再懸濁します。 </li><li>洗浄が完了した後、ペレットに完全BNL 1ME A.7R.1培養培地1ml（FBS 10％熱不活性化、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mM L-グルタミン）を添加し、培養液中にペレットを再懸濁します。 </li><li>細胞培養皿への細胞の再懸濁ミックスをシード。空気および5％CO 2の加湿インキュベーター中で37℃で細胞培養皿をインキュベートします。 </li><li> 2〜3日ごとに細胞培養培地を変更します。 5~7日後のCTCは、細胞培養皿に付着し、増殖し始めています。これらの細胞は25継代を超えて生存したままで繰り返し凍結融解サイクル5の後になります。 </li></ol>肝細胞癌の6検証は、腫瘍細胞株を循環します<ol><li> APを実行しますolymerase連鎖反応（PCR）の新規確立CTCの細胞株は、元の移植BNL 1ME A.7R.1 HCC線のようなマウス細胞であることを確認するために、マウスβグロビン遺伝子の1つの特定のDNAセグメントを増幅するためのベースの方法。方法は、もともとSteube らによって記載され、検証された。5,8 </li><li>特異的な抗体を用いて、タンパク質3のような3（CREB3L3）に結合する肝細胞特異的なマーカーcAMP応答要素の免疫染色を行います。これは、確立されたCTCは、肝細胞移植元のBNL 1ME A.7R.1細胞株のような実際にあるその小説を確認します。5 </li></ol>

<ol>
	<li>Ashworth, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+case+of+cancer+in+which+cells+similar+to+those+in+the+tumors+were+seen+in+the+blood+after+death.">A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death.</a> Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).</li><li>van de Stolpe, A., den Toonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+Tumor+Cells:+What+Is+in+It+for+the+Patient?+A+Vision+towards+the+Future.">Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future.</a> Cancers. 6, 1195-1207 (2014).</li><li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture,+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip.">Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).</li><li>George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#34;Tissue+is+the+issue&#34;:+circulating+tumor+cells+in+pancreatic+cancer.">&#34;Tissue is the issue&#34;: circulating tumor cells in pancreatic cancer.</a> Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).</li><li>Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+upregulation+of+HGF+and+c-Met+drives+metastasis+in+hepatocellular+carcinoma.">Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma.</a> PloS one. 8, e63765 (2013).</li><li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent,+biocompatible+nanostructured+surfaces+for+cancer+cell+capture+and+culture.">Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture.</a> International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).</li><li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells:+approaches+to+isolation+and+characterization.">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li><li>Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+verification+of+rodent+cell+lines+by+polymerase+chain+reaction.">Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction.</a> Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).</li><li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+micrometastases.">Cancer micrometastases.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).</li><li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection,+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells.">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).</li><li>Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells,+disease+progression,+and+survival+in+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).</li><li>De Giorgi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumor+cells+and+bone+metastases+as+detected+by+FDG-PET/CT+in+patients+with+metastatic+breast+cancer.">Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).</li><li>Eloubeidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+biopsy+of+patients+with+suspected+pancreatic+cancer:+diagnostic+accuracy+and+acute+and+30-day+complications.">Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).</li><li>O'Toole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+complications+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration.">Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration.</a> Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

In this study, how to isolate and propagate CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse with HCC were described. The objective of this work is to enhance the ongoing studies of the mechanisms of cancer metastasis. 
A factor that contributes to the poor prognosis of many cancers is the lack of timely detection and consequent widespread dissemination of the malignancy3. CTCs originate from primary cancers and spread via the blood stream to distant organs. As such, CTCs are importan...

The cancer research community has known of the existence of circulating tumor cells (CTCs) since first being observed by Thomas Ashworth in 18691. Since then, CTCs have been shown to be important in tumor metastasis and disease progression2-5. Today, solid tumors are a major cause of morbidity and mortality worldwide. CTCs are rare cells that originate from primary tumors and travel through the blood stream to different organs of which only a small fraction ultimately develop into metastasis2-5. Notably, there is positive correlation between tumor size and CTC number3,4. 
An understanding of CTC biology can contribute to the search for targeted therapy. Furthermore, CTCs may have diagnostic applications. To achieve these potential clinical applications, one needs to overcome some current challenges to studying CTCs. One challenge is related to the fact that CTCs may be present as single cells or as clusters and they may even be able to change their phenotype in response to the blood microenvironment2. Moreover, detection can be very challenging, in part, due to the low count of CTCs (a few to hundreds per milliliter) among one billionhematologic cells per milliliterin the blood6. Nevertheless, in recent years, research into the potential clinical applications of CTCs from solid organ cancers has intensified.
Despite these efforts, the challenges of studying and understanding the role of CTCs persist due to the rarity of CTCs and the inadequacy of the technological tools currently available. Despite these challenges, the tremendous potential for clinical applications continues to be an incentive to pursue research into the role of CTCs in cancer metastasis.
We were recently successful in isolating and propagating in cell culture CTCs from an orthotopic syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis5. The purpose of the current paper is to describe in detail all aspects of the successful methodology. The significance of this methodology lies in the fact that this approach may be modified in order to successfully isolate and propagate in culture human CTCs, thus enhancing the possibility of in vitro studies of CTC biology. 
There are multiple potential clinical applications for the use of CTCs. CTCs may be useful for prognosis, response monitoring, screening, dynamic monitoring of tumor molecular alterations, and personalized therapy4. Therefore, a better understanding of the biology of CTCs has high potential for clinical impact.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt 1G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89508-852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX Tube Micro 1.5mL Clear NS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89511-254</td>
			<td>1.5mL&#160; pyrogen-free eppendorf Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Sterile Disp BD 25GX1IN</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD305125</td>
			<td>25G Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slp Tip SRNG 1ml 200 each per pack</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309659</td>
			<td>1mL syringe tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1ml leur lok Pk 100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BD309628</td>
			<td>1 mL syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Forceps Tissue 6</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-446</td>
			<td>Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyromold intrm 15X15X5MM PK 100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-924</td>
			<td>Cyromold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo-oct compund 4oz</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>Oct compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Slide sprfrst 25X75MM PK72</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td>Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cover Glass #2 22X5oMM OZ</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48-382-128</td>
			<td>Cover Glass</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Slide Box True North Fm Pu</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89140-278</td>
			<td>Slide Box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super HT PAP Pen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89427-058</td>
			<td>PAP pen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water RNASe and DNAse free 2L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101454-204</td>
			<td>Nuclease Free Water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer Tris Ultra Pure Grade 500G</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-796</td>
			<td>Tris Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride ACS Grade 2&#160; 5KG</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-048</td>
			<td>Ammonium Chloride Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Tissue Culture Dish 60 x 15mm Style polystyrene</td>
			<td>VWR</td>
			<td align="right">353002</td>
			<td>Tissue Culture Dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox&#174; Germicidal Bleach, Regular</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89501-620</td>
			<td>Clorox Bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X (Phosphate-Buffered Saline) without calcium &#38; magnesium (500mL)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>PBS, 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1X&#160; with 4.5 g/L glucose &#38; L-glutamine without sodium pyruvate</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10-017-CV</td>
			<td>DMEM 1X media for BNL 1ME A.7R.1 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Seru8m</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>35-010-CV</td>
			<td>FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin Solution, 100X</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Biofuge pico</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td align="right">75002411</td>
			<td>13000rpm Centrifuge</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and propagation of circulating tumor cells from a mouse cancer model

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer metastasis. Indeed, the number of CTCs correlates with tumor size. Here, a detailed description is provided of a methodology for isolation and propagation of CTCs from a syngeneic mouse model of hepatocellular carcinoma (HCC) which allows for downstream analysis of potentially important molecular mechanisms of solid organ tumor metastasis. This method is efficient and reproducible. It is a non-invasive technique and, therefore, has potential to replace the invasive biopsy of tissues from humans which may be associated with complications. Therefore, the method discussed here allows for the isolation and propagation of CTCs from whole blood samples such that they can be examined and characterized. This has potential for future adaptation for clinical applications such as diagnosis, and personalized targeted therapy.

ここで説明する方法は、CTCを単離することができることを示しています。マウスは、人道的に、実験終了時点で安楽死させました。プロセスは、二酸化炭素窒息、心臓内瀉血、および頸椎脱臼を含みました。手順の重要なステップの概略図を図2に示した。心臓内放血により採取した全血試料は、上記のプロトコルを用いて処理しました。その後、遠心分離は、RBCの?...

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Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.

マウス癌モデルからの循環腫瘍細胞の単離と伝播

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

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11.9K ビュー.  Hunter College of The City University of New York. Circulating tumor cells (CTCs) have been shown to play an important role in tumor metastasis. Here, a method for the isolation and propagation of CTCs from the whole blood of a syngeneic mouse tumor model of hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis is described.