The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

يتم تنفيذ هذا البروتوكول وفقا للتوصيات الواردة في &quot;دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لجمعية البحوث في الرؤية وطب العيون&quot;. 1. التعامل مع البيض وجمع العين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين البيض ليفورنو البيضاء في 12-14 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع. إذا كانت متوفرة، واستخدام برودة النبيذ تبريد لتخزين البويضات المخصبة. ملاحظة: درجات الحرارة متجر ارتفاع تؤدي إلى نمو غير طبيعي للأجنة، في حين انخفضت درجات الحرارة إلى زيادة معدل الوفيات. مددت فترة التخزين يزيد على حد سواء وفيات والتنمية غير طبيعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض في 37.5 درجة مئوية و 60٪ البيض مرطب حاضنة مع هزاز لطيف على تردد 5 مرات في 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة البيض المحتضنة من حاضنة البيض في سن الجنينية المطلوب. ملاحظة: يتم تحديد عمر الجنين الدجاج لأن الوقت من الحضانة وكما تدل أيام الجنينية (E) أو المراحل (ش)، وفقا لسلسلة من مراحل النمو التي وصفها همبرغر وهاميلتون 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البيض المحدد في غطاء تدفق الصفحي. مسح قشر البيض مع 70٪ من الإيثانول لتجنب التلوث من الجنين. ملاحظة: إجراء كافة الإجراءات تحت ظروف معقمة مع حلول عقيمة <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> والصكوك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على جانب من البيض بحزم ضد سطح صلب لاتخاذ اجراءات فتح البيض. وضع المحتوى في طبق بيتري 100 ملم. استخدام ملعقة صغيرة لنقل الجنين الى طبق بيتري 35 ملم تحتوي مسبقا تحسنت (37 ° C) برنامج تلفزيوني 1X لمنع الأنسجة من التجفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق بيتري 35 ملم تحتوي على الأنسجة الجنينية في الصعود إلى مجهر مجهر stereovision تشريح في غطاء تدفق الصفحي. قطع رأس الجنين عن طريق معسر الرقبة مع ملقط غرامة والتخلص من الجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط غرامة لإجراء شق عشرالخام الفم، البطني للعين. بدءا من موقع شق، المسيل للدموع مفتوحة الأنسجة المحيطة بالعين بأكملها. قرصت العصب البصري وإزالة العين سليمة من محجر العين. جمع كل من اليسار والعين اليمنى من نفس الجنين للاستخدام إما السيطرة أو العين المعالجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة صغيرة لنقل وجهة نظر إلى 35 مم طبق بتري جديدة تحتوي مسبقا تحسنت (37 ° C) برنامج تلفزيوني 1X. </li></ol> 2. إعداد الجامع الشبكية إإكسبلنتس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط غرامة لإزالة جميع الأنسجة حول العين بما في ذلك بدأة صلبوية. ملاحظة: سوف الأنسجة مما يسهل فصل شبكية العين على الجسم الزجاجي والعدسة مع الظهارة الصبغية سليمة (الشكل 1A-B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط غرامة لقرصة شق صغير في ظهارة الصباغ في الجزء الظهري من العين دون الإضرار العصبية في الشبكية (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط غرامة المسيل للدموع بلطف فتح starti الظهارة الصبغيةنانوغرام في موقع شق، وترك العدسة والشبكية كلها تعلق على الجسم الزجاجي (1D الشكل). إبقاء العين في دافئ (37 درجة مئوية) برنامج تلفزيوني 1X لتسهيل إزالة الظهارة الصبغية. ملاحظة: قد يكون من الصعب الظهارة الصبغية لإزالة، وخصوصا على طول الجسم الهدبي حول التلميذ، في المنطقة الأمامية للعين، وعلى طول الشق المشيمية. ولذلك، فإن بعض ظهارة الصباغ قد يكون غادر على الشبكية العصبية (الشكل 1E-F). </li></ol> 3. علاج الجامعة الشبكية إإكسبلنتس <ol start="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Electroporation للمن إإكسبلنتس شبكية العين كلها ملاحظة: Electroporation للمن إإكسبلنتس شبكية العين كلها لا يمكن أن يؤديها مباشرة بعد الخطوة 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مستنبت تحتوي على 1: 1 DMEM: F12 مزيج العناصر الغذائية، و 10٪ FBS، 10 U / مل البنسلين الستربتومايسين، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، و2 مم L-الجلوتامين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 1.5 مل القابل للتصرف كفيت البلاستيك (12،5 مم × 12.5 مم × 45 مم) (أو أي حاوية صغيرة قادرة على اجراء حل 300-400 ميكرولتر) حوالي 8 ملم من أسفل باستخدام منشار غرامة ذات نصول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع DNA البلازميد الاختيار في 1xDPBS إلى تركيز النهائي من 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على electroporator ومجموعة المعلمات إلى 15 V لST20 - st25 (E3-E4) شبكية العين و 20 V لst26 - st27 (E5) شبكية العين. تعيين نبض يكرر إلى 5 نبضات من 50 مللي ثانية نبض طول مع 1 فترات ثانية. استخدام مولد النبض التي يمكن السيطرة عليها من قبل دواسة القدم على الأرض كما ستكون هناك حاجة بكلتا يديه لعقد الأقطاب في المكان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط اثنين مجداف على شكل (شقة، بقطر دائري. 4 ملم) أقطاب البلاتين (الشكل 2A) إلى مقبس إخراج على مولد النبض. ملاحظة: أدلى الأقطاب البلاتين المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل ورشة عمل الجامعة. وأدلى الأقطاب الكهربائية من 0.1 ملم لوحة البلاتين &quot;rondelles&quot; (البلاتين الصف: 950 PT / 5 النحاس). وربط 0.8 ملم وايإعادة ومعزول باستخدام الأنابيب البلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية يزدرع الشبكية كله من الخطوة 2.3 إلى كفيت (أو وعاء صغير ما يعادلها) باستخدام ماصة باستير البولي ايثيلين مع طرف قطع للحصول على الحجم الصحيح طرف فتح ليزدرع الشبكية. تجنب استخدام نصائح ماصة كما تميل الشبكية لنعلق على البلاستيك وتمزيق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة 100 ميكرولتر لإزالة بلطف كامل برنامج تلفزيوني 1X المحيطة الشبكية اتخاذ يزدرع الحرص على عدم لمس شبكية العين لتجنب تمزق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر حل البلازميد كفيت لتغطية يزدرع الشبكية كله. دفع برفق يزدرع الشبكية بالملقط إذا كان يطفو إلى الأعلى. استخدام ملقط أو أقطاب من وضع العدسة لمواجهة أي جانب واحد من كفيت والعصب البصري إلى أسفل كفيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القطب الموجب أمام العدسة والقطب السالب وراء شبكية العين (الشكل 2A)، دون لمس الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">تطبيق الحالية عن طريق الضغط على أسفل دواسة القدم. التحقق من وجود فقاعات في الأقطاب مشيرا إلى تفريغ ناجحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة 100 ميكرولتر لإزالة كافة مزيج من البلازميد كفيت دون الإضرار شبكية العين. هذا المزيج البلازميد يمكن إعادة استخدامها 3-5 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تملأ كفيت مع ما قبل تحسنت (37 ° C) برنامج تلفزيوني 1X. استخدام ملقط لفصل بلطف يزدرع الشبكية من جدار كفيت. بعد Electroporation للشبكية العين وتغطي في بعض الأحيان مع فقاعات، مما يجعل من التمسك جدار كفيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ماصة باستور البولي ايثيلين لنقل يزدرع الشبكية كله في 24 لوحة جيدا تحتوي على 1 مل قبل تحسنت (37 ° C) مستنبت لكل بئر. احتضان يزدرع الشبكية واحد لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان يزدرع الشبكية عند 37 درجة مئوية على شاكر المدورة، مع سرعة ثابتة من 50 دورة في الدقيقة، داخل الخلية الحاضنة مع 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة. تناوب هو ضمان أقصى قدر من التعرض إلى المتوسطة وpreveالإقليم الشمالي التصاق الشبكية في الجزء السفلي من لوحة 24-جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الخطوة 4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج إإكسبلنتس الشبكية كاملة مع الكواشف الكيميائية ملاحظة: العلاج الكيميائي للإإكسبلنتس شبكية العين كلها يمكن القيام بها مباشرة بعد الخطوة 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مستنبت تحتوي على 1: 1 DMEM: F12 مزيج العناصر الغذائية، و 10٪ FBS، 10 U / مل البنسلين الستربتومايسين، 5 ميكروغرام / مل الأنسولين، و2 مم L-الجلوتامين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية من الخطوة 2.3 إلى 24 لوحة جيدا تحتوي على 1 مل قبل حرارة (37 درجة مئوية) مستنبت لكل بئر. احتضان يزدرع الشبكية واحد لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان يزدرع الشبكية كامل لمدة 60 دقيقة في 37 ° C على شاكر المدورة، مع سرعة ثابتة من 50 دورة في الدقيقة، داخل الخلية الحاضنة مع CO 2 5٪ قبل إضافة كاشف كيميائي أو مركبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير المحلول الكيميائي، على سبيل المثال Cdk1 / 2 المانع الثالث، مثبط لM-مرحلة تطور 13، في المباراة النهائيةتركيز 30 ميكرومتر في DMSO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 24 لوحة جيدا، وتحتوي على يزدرع الشبكية كله، من الخلية الحاضنة. إضافة 10 ميكرولتر من كاشف كيميائي أو السيارة (DMSO) مباشرة إلى المتوسطة في شبكية العين، مما أدى إلى تركيز النهائي من 300 نانومتر Cdk1 / 2 المانع الثالث في 0.01٪ DMSO. تدوير يدويا لوحة 24-جيدا للسماح حتى توزيع الكاشف الكيميائي أو مركبة في الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لل explants الشبكية عند 37 درجة مئوية على شاكر المدورة، مع سرعة ثابتة من 50 دورة في الدقيقة، داخل حاضنة مع 5٪ CO 2 في الوقت المطلوب (تصل إلى 24 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتقل إلى الخطوة 4. </li></ol></li></ol> 4. التثبيت وتجميد الجامعة الشبكية Eexplants <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 24 لوحة جيدا تحتوي على تعامل يزدرع الشبكية كله من الخلية الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل / بئر الجليد البارد 4٪ لامتصاص العرق في 1XPBS. Incubaالشركة المصرية للاتصالات على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية كله إلى لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل / جيد 1XPBS المثلجة لغسل شبكية العين. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية كله إلى لوحة 24-جيدا تحتوي على 1 مل / بئر الجليد الباردة السكروز 30٪ في 1XPBS. احتضان على الجليد لمدة 1-3 ساعة اعتمادا على يوم الجنينية لشبكية العين. لST20 - st25 (E3) شبكية العين، احتضان لمدة 1 ساعة، شبكية العين السن يحتاجون وقتا أطول في الحضانة السكروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملعقة صغيرة لنقل يزدرع الشبكية كله على فيلم البارافين تحتوي على ما يقرب من 500 ميكرولتر ناظم البرد تجميد المتوسطة المتزايدة. إزالة أكبر السكروز أقصى حد ممكن عن طريق تحريك بلطف يزدرع الشبكية في المتوسط ​​تجميد باستخدام ملعقة صغيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل يزدرع الشبكية إلى قالب التضمين التي تحتوي على تجميد المتوسطة. وضع العين لتسهيل باجتزاء في المستقبل. وضع قالب التضمين التي تحتوي على يزدرع الشبكية كله على الدكتورذ الجليد حتى المتوسطة يتم تجميد الصلبة. تخزين في -80 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

في هذا العمل قدم بروتوكول مفصلة للتشريح، Electroporation للأو العلاج الكيميائي، وزراعة شبكية العين من إإكسبلنتس كاملة من أجنة الدجاج. هذا البروتوكول هو سهل وسريع ويسمح لكل من نسبة نجاح عالية واستنساخه النتائج. Electroporation للمن إ...

شبكية العين هي جزء من الجهاز العصبي المركزي وأنه هو، مع بساطتها النسبية والهندسة المعمارية الخلوية تتميز جيدا، وهذا نموذج شعبية لدراسة تطوير النظام العصبي المركزي. عين الجنين الدجاج كبيرة نسبيا بالمقارنة مع بقية الجنين. وبالتالي فإنه يمكن الوصول إليه بسهولة في البيضة للتلاعب التجريبية، مثل الحقن أو Electroporation لل، وبمثابة أداة ممتازة لاكتساب المعرفة حول خلايا شبكية والبيولوجيا التطورية في الجسم الحي. على الرغم من هذه المزايا الرئيسية، ويمكن البقاء على قيد الحياة من الأجنة تكون منخفضة عند التجارب هي الغازية مثل مع electroporations، تكرار الحقن، أو التلاعب التجريبية مجتمعة. Electroporation للمن البلازميدات الحمض النووي في الجنين الدجاج في البيضة هي تقنية مهمة وراسخة 1. انها تسمح لوصفها من الخلايا العصبية والبحث عن المفقودين من مصير المحمولة، فضلا عن مساحات العصبية في NERV المركزينظام الأوس ويسمح للتعبير عن الجينات خارج الرحم لتحليل وظيفة البروتين في الجسم الحي. وقد استخدمت هذه التقنية للدراسات الأنبوب العصبي 2، الدماغ المؤخر 3، وشبكية العين 4. Electroporation للمن شبكية العين الجنينية في البيضة لديه بعض الصعوبات التجريبية التي ترتبط الوضع في الجسم الحي. موقف العين، ويرجع ذلك إلى لطي الجمجمة الجنين، نسبيا قريبة إلى القلب. هذا القرب يزيد من خطر الإصابة بالسكتة القلبية بعد Electroporation لل، وتتزايد المخاطر مع تزايد عمر الجنين. وعلاوة على ذلك، للوصول إلى العين، فمن الضروري لفتح الأغشية الجنينية، مما يزيد من خطر النزيف والتشوهات وانخفاض الجدوى لاحقة. عند اختبار وتحسين البلازميد الحمض النووي الجديد في كثير من الأحيان دون نتيجة المظهرية معروفة، هذه القيود قد يقلل من فعالية وقوة الأسلوب حتى لالتجريبي من ذوي الخبرة. كما وردت في هذا البروتوكول، وثقافة ثثقب يزدرع الشبكية، الذي يعرف بأنه الشبكية العصبية كاملة مع الظهارة الصبغية إزالتها، وسيلة فعالة أن يكمل في نهج البيضة. الحقن داخل العين من الكواشف الكيميائية هي سهلة نسبيا لأداء في البيضة. ومع ذلك، فإن التركيز الفعال والدقيق الكواشف حقن داخل الشبكية العصبية قد يكون من الصعب السيطرة عليها بشكل كامل. قد تختلف حجم حقن بسبب التسرب والموقع الدقيق للحقن قد تؤثر على كل من توزيع كاشف داخل العين ونشرها من خلال والجسم الزجاجي. سوف تقلب لها آثار كبيرة على تفسير النتائج عند أي يتم تحديد منحنى الاستجابة للجرعة لمثبطات الانزيم. ولا سيما إذا كان تأثير صغير ونافذة الزمني للتأثير ضيق. وعلاوة على ذلك، سوى عين واحدة يمكن استخدامها من كل جنين عند إجراء التجارب في البيضة وذلك بسبب الآثار النظامية المحتملة عبر مجرى الدمعلى العين المقابل. العمر مطابقة مهم عند دراسة التنمية والتغير الفردي بين المعالجة ويمكن أن يؤدي الأجنة التحكم لتقلب التجريبية إضافية. لهذه الأسباب، وضعت البيضة السابقين أسلوب يعتمد على إإكسبلنتس الشبكية من أجنة الدجاج، والتي يمكن أن يتعرض العصبية في الشبكية إلى موحدة وتسيطر حالة تجريبية في المختبر. وقد تم تطوير هذا البروتوكول على أساس البروتوكولات السابقة 5-9. إإكسبلنتس الشبكية من مرحلة (ش) 20 (أيام الجنينية [E] 3) لst31 (E7) تم تشريح أجنة الدجاج، مثقف و electroporated مع تركيز الحمض النووي البلازميد محددة أو يتعرض إلى المتوسطة التي تحتوي على تركيز محددة من كاشف كيميائي. تم تنفيذ بروتوكول المعروضة هنا بنجاح في المنشورات الحديثة، وذلك باستخدام العديد من الكواشف الكيميائية المختلفة، بما في ذلك المنظمين من الحمض النووي من التلف الطريق، مثل KU55933، SB 218078، وNSC 109555 ديتوsylate، ودورة الخلية، مثل Cdk1 / 2 المانع الثالث 10،11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1xPBS (tablet)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18912-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10xDPBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14080-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable plastic cuvette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8495V01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/2 inhibitor III</td>
			<td>217714</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300nM in 0.01% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Platina, custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro square porator ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>0108-5-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium NEG50</td>
			<td>Cellab, Sweden</td>
			<td>6502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td>
			<td>8204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1214P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way embedding mold&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphoHistone 3 (PH3)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Dilution 1/4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes (custom made from &#34;rondelles&#34;)</td>
			<td>Sargenta</td>
			<td>390-R (rondeller)</td>
			<td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platimun electrodes&#160;</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Dia: 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spoon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-2151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443815S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Leghorn eggs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Local supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wine cooler</td>
			<td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

شبكية العين هي نموذج جيد للجهاز العصبي المركزي النامية. حجم كبير للعين والأهم من ذلك الوصول للتلاعب التجريبية في البيضة / في الجسم الحي يجعل من الدجاج شبكية العين الجنينية نموذج تجريبي تنوعا وفعالة جدا. على الرغم من أن شبكية العين الدجاج سهلة لاستهداف في البيضة عن طريق الحقن داخل العين أو Electroporation لل، والتركيز الفعال والدقيق للالكواشف داخل شبكية العين قد يكون من الصعب السيطرة عليها بشكل كامل. قد يكون هذا بسبب الاختلافات في موقع الحقن الدقيق، والتسرب من العين أو نشرها متفاوتة من المواد. وعلاوة على ذلك، وتواتر التشوهات والوفيات بعد التلاعب الغازية مثل Electroporation للمرتفع إلى حد ما. يصف هذا البروتوكول والبيضة السابقين تقنية لزراعة إإكسبلنتس شبكية العين كلها من أجنة الدجاج ويوفر طريقة للتعرض للرقابة في شبكية العين إلى الكواشف. بروتويصف العقيد كيفية تشريح، تجريبيا التلاعب، وإإكسبلنتس الشبكية ثقافة بأكملها من أجنة الدجاج. لل explants يمكن تربيتها لحوالي 24 ساعة وأن تخضع للتلاعب مختلفة مثل Electroporation لل. المزايا الرئيسية هي أن التجربة ليست متوقفة على بقاء الجنين وأن تركيز الكاشف قدم يمكن أن تختلف والسيطرة من أجل تحديد وتحسين التركيز الفعال. وعلاوة على ذلك، والتقنية هي سريعة ورخيصة وجنبا إلى جنب مع ارتفاع نسبة النجاح التجريبية، فإنه يضمن استنساخه النتائج. وينبغي التأكيد على أنه بمثابة مكمل ممتاز لتجارب أجريت في البيضة.

يصف هذا البروتوكول إعداد (الشكل 1A-F) وزراعة شبكية العين من إإكسبلنتس كاملة من أجنة الدجاج. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح لإإكسبلنتس كلها الشبكية من الأجنة من ST20 (E3) لst31 (E7). Electroporation للمن البلازميدات الحمض النووي في إإكسب...

Watch this Scientific Journal Video about Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments at JoVE.com

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

يصف هذا البروتوكول وسيلة لتشريح، والتعامل معها بشكل تجريبي وإإكسبلنتس الشبكية ثقافة بأكملها من أجنة الدجاج. ثقافات يزدرع هي مفيدة عند نسبة نجاح عالية والفعالية واستنساخ هناك حاجة لاختبار آثار البلازميدات ل electroporation و / أو المواد كاشف، أي مثبطات الأنزيمية.

إإكسبلنتس الشبكية كاملة من الدجاج الأجنة لعلاج Electroporation للوالكيميائية الكاشف

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

whole-retinal-explants-from-chicken-embryos-for-electroporation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K Views.  Uppsala University.  يصف هذا البروتوكول وسيلة لتشريح، والتعامل معها بشكل تجريبي وإإكسبلنتس الشبكية ثقافة بأكملها من أجنة الدجاج. ثقافات يزدرع هي مفيدة عند نسبة نجاح عالية والفعالية واستنساخ هناك حاجة لاختبار آثار البلازميدات ل electroporation و / أو المواد كاشف،

Video: Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

وضع العلامات المزدوجة من خلايا كريست العصبية والأوعية الدموية داخل أجنة الدجاج باستخدام الفرخGFP تطعيم الأنبوب العصبي وكاروتشيانين صبغ DiI حقن

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها<em&gt; في البيضة</em&gt; الصغرى Electroporation لل

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

في أوفو إليكتروبوراتيون في الدماغ الدماغ السمعي

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

التعبير السريع والفعال عن البروتينات المتعددة في أجنة الطيور باستخدام الكهربة mRNA

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

العزلة والتمايز من المقاطع الاساسيه من الماوس الهيكل العظمي العضلات الشرح

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Generation of Na&#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. However, because of the complexity and redundancy of embryonic signals, it can be challenging to discern the complete role of any single signal during early embryogenesis. By explanting the animal region of the zebrafish blastoderm, relatively na&#239;ve clusters of embryonic cells are generated that can be easily cultured and manipulated ex vivo. By introducing a gene of interest by RNA injection before explantation, one can assess the effect of this molecule on gene expression, cell behaviors, and other developmental processes in relative isolation. Furthermore, cells from embryos of different genotypes or conditions can be combined in a single chimeric explant to examine cell/tissue interactions and tissue-specific gene functions. This article provides instructions for generating zebrafish blastoderm explants and demonstrates that a single signaling molecule - a Nodal ligand - is sufficient to induce germ layer formation and extension morphogenesis in otherwise na&#239;ve embryonic tissues. Due to their ability to recapitulate embryonic cell behaviors, morphogen gradients, and gene expression patterns in a simplified ex vivo system, these explants are anticipated to be of great utility to many zebrafish researchers.

Generation of Na&amp;#239;ve Blastoderm Explants from Zebrafish Embryos

Zebrafish blastoderm explants are generated by isolating embryonic cells from endogenous signaling centers within the early embryo, producing relatively na&#239;ve cell clusters easily manipulated and cultured ex vivo. This article provides instructions for making such explants and demonstrates their utility by interrogating roles for Nodal signaling during gastrulation.

جيل من الساذج Blastoderm Explants من أجنة زيبرافيش

Due to their optical clarity and rapid development, zebrafish embryos are an excellent system for examining cell behaviors and developmental processes. ...