Name: whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
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The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

Dieses Protokoll wird in Übereinstimmung mit den Empfehlungen in der &quot;Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von der Association for Research in Vision und Augenheilkunde&quot; durchgeführt. 1. Egg Handhabung und Augen Sammlung <ol><li> Bewahren weißen Leghorn Eier bei 12-14 ° C nicht länger als 1 Woche. Falls verfügbar, verwenden Sie einen gekühlten Weinkühler, um die befruchtete Eier zu speichern. Hinweis: Höhere Speichertemperaturen führen zu abnormalen Entwicklung von Embryonen, niedrigere Temperaturen erhöht Sterblichkeit. Erweiterte Speicherzeit erhöht sowohl die Mortalität und abnorme Entwicklung. </li><li> Die Eier in einer 37,5 ° C und 60% befeuchteter Eibrutkasten inkubiere unter leichtem Schütteln bei einer Frequenz von 5 mal pro 24 Stunden. </li><li> Entfernen Sie die eingelegten Bruteier aus dem Eibrutkasten an der gewünschten embryonalen Alter. Hinweis: Das Alter des Hühnerembryo ist als die Zeit der Inkubation bestimmt und als embryonale Tagen (E) oder als Stufen bezeichnet (st) Entsprechend der Reihe der von Hamburger und Hamilton 12 beschriebenen Entwicklungsstadien wirksam. </li><li> Legen Sie die ausgewählten Eier im Laminarströmungshaube. Wischen der Eischale mit 70% Ethanol, um eine Verunreinigung des Embryos zu vermeiden. Hinweis: Führen Sie alle Verfahren unter aseptischen Bedingungen mit sterilen Lösungen <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> und Instrumente. </li><li> Tippen Sie auf die Seite des Eis fest gegen eine harte Oberfläche zu knacken das Ei. Platzieren Sie den Inhalt in einer 100 mm Petrischale. Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um den Embryo auf eine 35 mm Petrischale mit vorgewärmten (37 ° C) 1x PBS, um das Gewebe vor dem Austrocknen zu verhindern, übertragen. </li><li> Legen Sie die 35 mm Petrischale mit den embryonalen Gewebes auf eine binokulare Stereo Binokular in der Sterilbank. Enthaupten den Embryo durch Kneifen der Hals mit feinen Pinzetten und entsorgen Sie den Körper. </li><li> Verwenden feinen Pinzette, um einen Einschnitt th machenGrob der Mund, Bauch für das Auge. Beginnend an der Stelle des Einschnitts, der das gesamte Auge umgebende Gewebe aufzureißen. Kneifen Sie den Sehnerv und aus der Augenhöhle zu entfernen die intakte Auge. Sammeln sowohl das linke und rechte Auge von der gleichen Embryos zur Verwendung als entweder die Kontrolle oder die behandelten Auge. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die Augen zu einem neuen 35-mm-Petrischale mit vorgewärmten (37 ° C) 1x PBS übertragen. </li></ol> 2. Herstellung von Whole Retinal Explantate <ol><li> Verwenden feinen Pinzette, um alle Gewebe um das Auge zu entfernen, einschließlich der skleralen anlage. Hinweis: Das Gewebe wird leicht lösen Verlassen der Netzhaut auf den Glaskörper und die Linse mit dem Pigmentepithel intakt (1A-B). </li><li> Verwenden feinen Pinzette, ein kleiner Schnitt in die Pigmentepithel an der dorsalen Teil des Auges, ohne die neuronale Netzhaut (1C) einklemmen. </li><li> Verwenden feinen Pinzette vorsichtig aufreißen das Pigmentepithel starting an der Stelle des Einschnitts, wobei das Objektiv und die gesamte Netzhaut in den Glaskörper (1D) befestigt ist. Das Auge halten in warmem (37 ° C) 1x PBS, um das Entfernen des Pigmentepithels erleichtern. Anmerkung: Die Pigmentepithel schwierig sein kann, zu entfernen, insbesondere entlang der Ziliarkörper um die Pupille in die vordere Augenbereich, und entlang der Ader Fissur. Daher können einige der Pigmentepithel auf der neuronalen Netzhaut (1E-F) verbleiben. </li></ol> 3. Behandlung von Whole Retinal Explantate <ol start="1"><li> Elektroporation von ganzen Netzhaut-Explantate Anmerkung: Die Elektroporation ganzer retinalen Explantate können direkt nach der Stufe 2 durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereitung Kulturmedium, das 1: 1 DMEM: F12 Nutrient Mix, 10% FBS, 10 U / ml Penicillin-Streptomycin, 5 ug / ml Insulin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Schneiden Sie ein 1,5-ml-Einweg-Kunststoff-Küvetten (12,5 mm x 12,5 mm x 45 mm) (oder einem kleinen Behälter halten können 300-400 &amp; mgr; l Lösung) etwa 8 mm von der Unterseite mit einem feinen Blatt-Säge. </li><li> Verdünnt das DNA-Plasmid der Wahl in 1xDPBS bis zu einer Endkonzentration von 0,1 ug / ul. </li><li> Schalten Sie die Elektroporator und eingestellten Parameter auf 15 V für ST20 - ST25 (E3-E4) Netzhaut und 20 V für ST26 - ST27 (E5) Netzhaut. Stellen Sie die Pulswiederholungen bis 5 Impulsen von 50 ms Pulslänge bei 1 sec Intervallen. Verwenden Sie einen Impulsgenerator, der von einem Fußpedal auf dem Boden gesteuert werden können, da beide Hände benötigt werden, um die Elektroden in Position zu halten sein werden. </li><li> Schließen Sie zwei Paddle-förmig (flach, rund Durchm. 4 mm) von Platinelektroden (2A) an die Ausgangsbuchse des Impulsgenerators. Hinweis: Die Platinelektroden in diesem Protokoll verwendet wurden von der Universität Werkstatt. Die Elektroden wurden aus 0,1 mm Platinplatte &quot;Rondelle&quot; (950 Pt / Cu 5 Platin-grade) hergestellt. Das Verbindungs ​​0,8 mm wire wurde mit Kunststoffschlauch isoliert. </li><li> Die ganze Netzhaut Explantation sorgfältig über aus Schritt 2.3 in die Küvette (oder gleichwertig kleinen Behälter) mit einem Polyethylen Pasteur-Pipette mit der Spitze abgeschnitten, um den richtigen Tipp-Öffnungsgröße für die Netzhaut Explantation zu erwerben. Vermeiden Sie die Verwendung von Pipettenspitzen, wie die Netzhaut neigt dazu, mit dem Kunststoffbringen und zu zerreißen. </li><li> Verwenden Sie ein 100 ul Pipette vorsichtig die gesamte 1x PBS rund um die Netzhaut Explantation die Betreuung der Netzhaut, um nicht zu zerreißen nicht zu berühren. </li><li> 100 l Plasmid-Lösung in die Küvette, die gesamte Netzhaut Explantation zu decken. Drücken Sie vorsichtig den Netzhaut Explantat mit einer Pinzette, wenn es an die Spitze treibt. Verwenden einer Pinzette oder Elektroden, um die Linse zu positionieren, um jede der einen Seite der Küvette und den Sehnerv zum Boden der Küvette zugewandt. </li><li> Platzieren der positiven Elektrode vor der Linse und der negativen Elektrode hinter der Netzhaut (2A), ohne Berührung des Gewebes. </li><li>Übernehmen Sie die aktuelle durch Niederdrücken des Fußpedals. Prüfen Sie, ob Luftblasen an den Elektroden anzeigt erfolgreiche Entlastung. </li><li> Verwenden Sie ein 100 ul-Pipette, um alle, die das Plasmid-Mix aus der Küvette ohne Beschädigung der Netzhaut zu entfernen. Die Plasmid-Mix kann drei bis fünf mal wiederverwendet werden. </li><li> Füllen Sie die Küvette mit vorgewärmten (37 ° C) 1x PBS. Verwenden einer Pinzette vorsichtig entfernen Sie die Netzhaut Explantation von der Wand der Küvette. Nach der Elektroporation der Retina wird manchmal mit Blasen bedeckt ist, die sie an die Wand der Küvette haften lässt. </li><li> Verwenden Sie die Polyethylen Pasteur-Pipette, um die gesamte Netzhaut Explantation in eine 24-Well-Platte mit 1 ml vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium pro Vertiefung übertragen. Inkubieren einer Netzhaut Explantat pro Vertiefung. </li><li> Inkubieren retinalen Explantat bei 37 ° C auf einem Rotator Treuer, mit einer konstanten Geschwindigkeit von 50 UpM in einer Zelle Inkubator mit 5% CO 2 für 24 Std. Die Rotation ist, um maximale Exposition gegenüber dem Medium und preve sicherzustellen,nt Haftung der Netzhaut an der Unterseite der Platte mit 24 Vertiefungen. </li><li> Fahren Sie mit Schritt 4. </li></ol></li><li> Behandlung der gesamten Retina Explantate mit chemischen Reagenzien Hinweis: Die chemische Behandlung der gesamten Netzhaut Explantate können direkt nach der Stufe 2 durchgeführt werden. <ol><li> Vorbereitung Kulturmedium, das 1: 1 DMEM: F12 Nutrient Mix, 10% FBS, 10 U / ml Penicillin-Streptomycin, 5 ug / ml Insulin und 2 mM L-Glutamin. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die Netzhaut Explantation aus Schritt 2.3 in eine 24-Well-Platte mit 1 ml vorgewärmten (37 ° C) Kulturmedium pro Vertiefung übertragen. Inkubieren einer Netzhaut Explantat pro Vertiefung. </li><li> Inkubieren des gesamten Retina Explantat für 60 min bei 37 ° C auf einem Rotator Treuer, mit einer konstanten Geschwindigkeit von 50 UpM in einer Zelle Inkubator mit 5% CO 2 vor der Zugabe eines chemischen Reagens oder Vehikel. </li><li> Vorbereitung der chemischen Lösung, beispielsweise Cdk1 / 2-Inhibitor III, einem Inhibitor der M-Phasenverlauf 13 in einer endgültigenKonzentration von 30 &amp; mgr; M in DMSO. </li><li> Entfernen Sie den 24-Well-Platte, das die gesamte Netzhaut Explantation, aus der Zelle Inkubator. Zugabe von 10 ul des chemischen Reagens oder Vehikel (DMSO) direkt auf die Netzhaut-Medium, was zu einer Endkonzentration von 300 nM Cdk1 / 2-Inhibitor III in 0,01% DMSO. Manuell drehen Sie den 24-Well-Platte, um für eine gleichmäßige Verteilung des chemischen Reagens oder ein Fahrzeug in der Lösung zu ermöglichen. </li><li> Das Retina Explantate bei 37 ° C inkubieren, auf einem Rotator Treuer, mit einer konstanten Geschwindigkeit von 50 Umdrehungen pro Minute, in einer Brutschrank mit 5% CO 2 für die gewünschte Zeit (bis zu 24 h). </li><li> Fahren Sie mit Schritt 4. </li></ol></li></ol> 4. Fixierung und Einfrieren von Whole Retinal Eexplants <ol><li> Entfernen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen, die das behandelte gesamte Netzhaut Explantation aus der Zelle Inkubator. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die Netzhaut Explantation auf eine 24-Well-Platte mit 1 ml / Vertiefung eiskaltem 4% Paraformaldehyd in 1xPBS übertragen. Incubate auf Eis für 15 min. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die gesamte Netzhaut Explantation auf eine 24-Well-Platte mit 1 ml / Vertiefung eiskalt 1xPBS um die Netzhaut zu waschen übertragen. Inkubieren auf Eis für 10 min. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die gesamte Netzhaut Explantation auf eine 24-Well-Platte mit 1 ml / Vertiefung eiskaltem 30% Saccharose in 1xPBS übertragen. Inkubieren auf Eis für 1-3 h in Abhängigkeit von der embryonalen Tag der Retina. Für ST20 - ST25 (E3) der Netzhaut, Inkubation für 1 h, müssen ältere Retina längere Inkubationszeit in Saccharose. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Löffel, um die gesamte Netzhaut Explantation auf eine Paraffinschicht, die etwa 500 &amp; mgr; Kryostaten Einfrieren Montagemedium zu übertragen. Entfernen Sie so viel Saccharose wie möglich durch leichtes Bewegen des retinalen Explantation im Gefriermedium mit dem kleinen Löffel. </li><li> Übertragen Sie die Netzhaut Explantation auf eine Einbettform haltige Gefriermedium. Positionieren Sie den Blick auf künftige Schnitte erleichtern. Legen Sie die Einbettform, das die gesamte Netzhaut Explantation auf dry Eis, bis das Medium fest gefroren. Bei -80 ° C. </li></ol>

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	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. 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Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

In dieser Arbeit wird ein detailliertes Protokoll für die Präparation, Elektroporation oder chemische Behandlung, und das Kultivieren der gesamten Netzhaut Explantaten aus Hühnerembryonen wird vorgestellt. Dieses Protokoll ist einfach, schnell und ermöglicht sowohl eine hohe Erfolgsrate und reproduzierbare Ergebnisse. Elektroporation von ganzen Netzhaut-Explantate produziert große Bereiche der Zellen, die das Gen-Konstrukt von Interesse exprimieren. Es ist leicht, die...

Die Retina ist ein Teil des zentralen Nervensystems, und es ist mit seiner relativen Einfachheit und gut charakterisierte Zellarchitektur, ein beliebtes Modell zum Studium der Entwicklung des zentralen Nervensystems. Das Auge des Hühnerembryo ist im Vergleich zu dem Rest des Embryos relativ groß. Es ist daher in ovo für experimentelle Manipulationen, wie Injektionen oder Elektroporation leicht zugänglich ist, und dient als ein hervorragendes Werkzeug, um das Wissen über Netzhaut Zell- und Entwicklungsbiologie in vivo zu gewinnen. Trotz dieser großen Vorteile, kann das Überleben der Embryonen niedrig sein, wenn Experimente sind invasive, wie mit Elektroporationen, wiederholte Injektionen oder kombinierte experimentelle Manipulationen. Elektroporation von DNA-Plasmiden in den Hühnerembryo in ovo ist ein wichtiges und gut etablierte Technik 1. Es ermöglicht die Kennzeichnung von Neuronen, das Aufspüren des Zellschicksals und neuronalen Bahnen im zentralen nervous System und es ermöglicht die ektopische Genexpression auf Proteinfunktion in vivo zu analysieren. Die Technik hat sich für die Untersuchung der neuronalen Rohr 2 eingesetzt wurde, Rautenhirn 3 und 4 Retina. Elektroporation der embryonalen Retina in ovo hat einige experimentellen Schwierigkeiten, die der Situation in vivo in Zusammenhang stehen. Die Position des Auges, durch den Schädel Faltung des Embryos, relativ nahe an das Herz. Diese Nähe erhöht das Risiko von Herzstillstand nach der Elektroporation und das Risiko steigt mit dem Alter des Embryos. Darüber hinaus, um das Auge gelangen, ist es notwendig, die Eihüllen zu öffnen, wodurch das Risiko für Blutungen, Fehlbildungen und anschließende verminderte Lebensfähigkeit zu. Bei der Prüfung und Optimierung einer neuen DNA-Plasmid, oft ohne bekannte phänotypische Ergebnis können diese Einschränkungen der Wirksamkeit und Leistung des Verfahrens selbst für einen erfahrenen Experimentator zu verringern. Wie in diesem Protokoll der Kultur der w vorgestelltLoch retinalen Explantat, definiert als die gesamte neurale Retina mit Pigmentepithel entfernt wird, ist eine effiziente Methode, die in ovo Ansatz ergänzt. Intraokulare Injektionen von chemischen Reagenzien sind relativ einfach in ovo auszuführen. Jedoch kann die effektive und genaue Konzentration der injizierten Reagenzien innerhalb des neuralen Retina schwierig, vollständig zu steuern. Das injizierte Volumen durch Lecks variieren und die genaue Stelle der Injektion kann sowohl die Verteilung des Reagens in das Auge und die Diffusion durch den Glaskörper zu beeinflussen. Die Variabilität wird erhebliche Auswirkungen auf die Interpretation der Ergebnisse, wenn dh eine Dosis-Antwort-Kurve für einen Enzym-Inhibitor festgestellt haben; Insbesondere, wenn der Effekt klein ist und die Zeitfenster der Effekt ist gering. Darüber hinaus nur ein einziges Auge kann von jedem Embryo bei der Durchführung von in-ovo-Experimente durch, um mögliche systemische Wirkungen über den Blutstrom verwendet werdenauf das andere Auge. Alter Anpassung ist wichtig, wenn das Studium der Entwicklung und die individuelle Variabilität zwischen behandelten und Kontroll Embryonen zu zusätzlichen experimentellen Variabilität führen. Aus diesen Gründen wurde ein ex ovo Verfahren basierend auf retinale Explantaten aus Hühnerembryos entwickelt, bei dem das neurale Retina kann zu einer gleichmäßigen und kontrollierten ausgesetzt experimentellen Bedingungen in vitro werden. Die vorliegende Protokoll wurde auf der Grundlage früherer Protokolle 5-9 entwickelt. Retinal Explantate aus Stufe (St) 20 (embryonalen Tagen [E] 3) bis ST31 (E7) Hühnerembryonen wurden präpariert, kultiviert und Elektroporation mit einer definierten DNA-Plasmid-Konzentration oder zu einem Medium, das eine definierte Konzentration eines chemischen Reagens ausgesetzt wird. Das hier vorgestellte Protokoll wurde erfolgreich in jüngsten Veröffentlichungen implementiert, unter Verwendung mehrerer verschiedener chemischer Reagenzien, einschließlich Regulatoren der DNA-Schaden-Weges, wie KU55933, SB 218.078 und NSC 109555 ditosylate und der Zellzyklus wie Cdk1 / 2-Inhibitor III 10,11.

<table><tbody><tr><td>1xPBS (tablet)</td><td>Life technologies</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14080-048</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>734-0006</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l pipette tips</td><td>VWR</td><td>613-0798</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml disposable plastic cuvette</td><td>Thomas Scientific</td><td>8495V01</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D7039</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>391-1998</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Solveco</td><td>1054</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/2 inhibitor III</td><td>217714</td><td>Calbiochem</td><td>300 nM in 0.01% DMSO</td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Electrodes</td><td></td><td></td><td>Platina, custom made</td></tr><tr><td>Electro square porator ECM 830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 Nutrient mix</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>AgnThos</td><td>0108-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>Freezing medium NEG50</td><td>Cellab, Sweden</td><td>6502</td><td></td></tr><tr><td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator</td><td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td><td>8204</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>VWR</td><td>291-1214P</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way embedding mold&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6032</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoHistone 3 (PH3)&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Dilution 1/4,000</td></tr><tr><td>Platinum electrodes (custom made from &quot;rondelles&quot;)</td><td>Sargenta</td><td>390-R (rondeller)</td><td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td></tr><tr><td>Platimun electrodes&amp;nbsp;</td><td>Sonidel</td><td>CUY700P4L</td><td>Dia: 4 mm</td></tr><tr><td>Polyethylene pasteur pipette</td><td>VWR</td><td>612-2853</td><td></td></tr><tr><td>Rotator shaker</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>Small spoon</td><td>VWR</td><td>231-2151</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>443815S</td><td></td></tr><tr><td>White Leghorn eggs</td><td></td><td></td><td>Local supplier</td></tr><tr><td>Wine cooler</td><td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

Die Retina ist ein gutes Modell für die Entwicklung des zentralen Nervensystems. Die Größe des Auges und vor allem die Zugänglichkeit für experimentelle Manipulationen in ovo / in vivo macht das Huhn embryonalen Netzhaut eine vielseitige und sehr effiziente Versuchsmodell. Obwohl das Huhn Netzhaut ist leicht, in ovo durch intraokulare Injektion oder Elektroporation Ziel kann die effektive und genaue Konzentration der Reagenzien in der Netzhaut schwierig zu voll Kontrolle. Dies kann aufgrund von Abweichungen von der genauen Injektionsstelle, Leckage aus dem Auge oder unebenen Diffusion der Substanzen sein. Ferner wird die Frequenz von Fehlbildungen und Mortalität nach invasive Manipulationen wie Elektroporation ziemlich hoch. Dieses Protokoll beschreibt einen ex ovo Technik zum Züchten gesamte Retina Explantaten aus Hühnerembryonen und liefert ein Verfahren zur kontrollierten Exposition der Retina Reagenzien. Die protocol beschreibt, wie zu zerlegen, experimentell zu manipulieren, und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Die Explantate können die etwa 24 h, kultiviert werden und verschiedene Manipulationen wie Elektroporation unterworfen werden. Die wesentlichen Vorteile sind, dass der Versuch nicht abhängig vom Überleben der Embryos und daß die Konzentration des eingebrachten Reagens kann variieren, und um zu bestimmen und zu optimieren, die effektive Konzentration gesteuert werden. Weiterhin ist die Technik eine schnelle, billige und zusammen mit ihren hohen experimentellen Erfolgsquote, reproduzierbar sichergestellt, Ergebnisse. Es sollte betont werden, dass es als eine ausgezeichnete Ergänzung zum Experiment in ovo ausgeführt dient.

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung (1A-F) und das Kultivieren der gesamten Netzhaut Explantaten aus Hühnerembryonen. Dieses Protokoll wurde erfolgreich für die gesamte Netzhaut Explantaten aus Embryonen von st20 (E3) zu ST31 (E7) verwendet. Elektroporation von DNA-Plasmiden zu ganzen Netzhaut-Explantate ermöglicht die Kennzeichnung und Rückverfolgung von retinalen Vorläuferzellen oder Überexpression von verschiedenen Genprodukten. Zur Elektroporation Experimen...

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um zu sezieren, experimentell zu manipulieren und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Das Explantat-Kulturen sind nützlich, wenn hohe Erfolgsrate, Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit sind notwendig, um die Auswirkungen von Plasmiden für die Elektroporation und / oder Reagenz Substanzen, dh, enzymatischer Inhibitoren zu testen.

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K Aufrufe.  Uppsala University.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um zu sezieren, experimentell zu manipulieren und Kultur ganze Retina-Explantaten aus Hühnerembryonen. Das Explantat-Kulturen sind nützlich, wenn hohe Erfolgsrate, Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit sind notwendig, um die Auswirkungen von Plasmiden für die Elektroporation und / oder Reagenz Substanzen, dh, enzymatischer Inhibitoren zu testen. 

Serie: Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

In Ovo Electroporations von HH Stage 10 Hühnerembryonen

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biologie

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neurowissenschaften

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

In utero und ex vivo Elektroporation für die Genexpression in Maus retinalen Ganglienzellen

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

In ovo Elektroporation in embryonalen Hühnchenretina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Gentransfer in Hühnerembryonen durch Ältere<em&gt; Ex ovo</em&gt; Die Elektroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

Mit Zapfen angereicherte Kulturen von der Netzhaut von Hühnerembryonen zur Untersuchung zellulärer Interaktionen von Stäbchen zu Zapfen

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and accessibility for visualization and experimental manipulations. However, its major technical limitation had been the lack of robust loss-of-function approaches for gene function analyses. This protocol describes a methodology of gene silencing in the developing chick retina that involves transgenic expression of artificial microRNAs (miRNAs) by using the Tol2 transposon system. In this approach, a Tol2 transposon plasmid that contains an expression cassette for the EmGFP (emerald green fluorescent protein) marker and artificial pre-miRNA sequences against a target gene is introduced into the embryonic chick retina with a Tol2 transposase expression construct by in ovo electroporation. In the transfected retinal cells, the transposase catalyzes the excision of the expression cassette from the transposon vector and its integration into host chromosomes, leading to the stable expression of miRNAs and the EmGFP protein. In our previous study, we have demonstrated that the expression of Nel, a glycoprotein that exerts multiple functions in neural development, can be significantly suppressed in the developing chick retina by using this technique. Our results indicate that this methodology induces a stable and robust suppression of gene expression and thus provides an efficient loss-of-function approach for studies of retinal development.

We have developed a novel loss-of-function approach that involves the introduction and genomic integration of artificial micro-RNA sequences into chick embryos by using in ovo electroporation and the Tol2 transposon system. This technique provides a robust and stable gene knockdown methodology for studies of gene function during development.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

Zusammenfassung

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Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine