Name: whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
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The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

이 프로토콜은 &quot;비전과 안과 연구 협회의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 가이드&quot;의 권장 사항에 따라 수행된다. 1. 계란 취급과 눈 모음 <ol><li> 일주보다 더 이상에 대해 12 ~ 14 ℃에서 흰색 레그혼 계란을 저장합니다. 가능한 경우, 수정란을 저장하는 냉장 와인 쿨러를 사용한다. 참고 : 낮은 온도가 사망률을 증가하면서 높은 저장 온도, 태아의 이상 개발로 이어집니다. 확장 된 저장 시간은 사망률과 이상 발생시 모두 증가. </li><li> 부드러운은 24 시간 당 5 배의 주파수에서 락으로 37.5 ° C 계란 60 % 가습 계란 인큐베이터를 품어. </li><li> 원하는 배아 나이에 계란 인큐베이터에서 배양 알을 제거합니다. 주 : 닭 배아의 연령은 인큐베이션 시간으로 결정되고, 배아 일 (E) 또는 단계로 표시된다 (세인트을), 햄버거 해밀턴 (12)에 의해 설명 된 발달 단계의 일련의 제조 방법. </li><li> 층류 후드에서 선택한 알을 놓습니다. 배아의 오염을 방지하기 위해 70 %의 에탄올로 달걀 껍질을 닦습니다. 참고 : 멸균 솔루션을 무균 상태에서 모든 절차를 실시 <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> 및 악기. </li><li> 계란을 개방 균열 단단히 하드 표면에 계란의 측면을 누릅니다. 100mm 페트리 접시의 콘텐츠를 배치합니다. 마르지 않도록 조직 예열 (37 ° C) 1X PBS를 함유하는 35mm 페트리 접시에 배아를 전송할 작은 스푼을 사용한다. </li><li> 층류 후드에서 양안 스테레오 비젼 해부 현미경에 배아 조직을 포함하는 35mm 페트리 접시를 놓습니다. 미세 집게로 목을 곤란하게하여 배아를 참살하고 시신을 버리십시오. </li><li> 번째 절개를 만들기 위해 미세 집게를 사용하여눈에 복부 거친 입,. 절개 부위부터 전체 눈 주변 조직을 오픈 찢어. 시신경을 조이고 눈 소켓에서 그대로 눈을 제거합니다. 제어 또는 처리 중 눈으로 사용하기 위해 동일한 배아로부터 좌측 및 우측 눈 모두 모아서. </li><li> 예열 (37 ° C) 1X PBS를 함유하는 새로운 35mm 페트리 접시에 눈을 전송할 작은 스푼을 사용한다. </li></ol> 전체 망막의 Explants 2. 준비 <ol><li> 공막 anlage을 포함하여 눈 주위의 모든 조직을 제거하는 미세 집게를 사용합니다. 주 : 조직은 쉽게 색소 상피 손상 (도 1A-B)와 유리체 및 망막에 렌즈를두고 분리된다. </li><li> 신경 망막 (그림 1C)을 손상시키지 않고 눈의 지느러미 부분에 색소 상피 세포에 작은 절개를 끼지 미세 집게를 사용합니다. </li><li> 부드럽게 색소 상피의 starti을 열고 눈물 미세 집게를 사용하여절개 부위에 겨 렌즈와 유리체 (도 1D)에 연결된 전체 망막을 떠나. 색소 상피 세포의 제거를 용이하게 따뜻한 (37 ℃)에서 1X PBS 주시. 색소 상피 세포는 눈의 전방 영역, 동공 주위 모양체 따라, 특히 분리하기가 어려울 수 있고, 맥락막 열창 따라 참고. 따라서, 색소 상피 세포의 일부가 망막 신경 (도 1E-F)에 남아있을 수있다. </li></ol> 전체 망막의 Explants 3. 치료 <ol start="1"><li> 전체 망막 외식의 전기 참고 : 전체 망막 외식의 일렉트로는 2 단계 후 직접 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 1 DMEM : F12 영양소 혼합물, 10 % FBS, 10 U / ml의 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 및 2 mM L- 글루타민을 함유 한 배양 배지를 준비한다. </li><li> 1.5 ml의 일회용 플라스틱 큐벳을 잘라 (12.5 mm X 12.5 mm X 45mM) (또는 미세 블레이드 톱을 사용하여 바닥에서) 약 8mm를 300 ~ 400 μL 솔루션을 보유 할 수있는 작은 용기. </li><li> 0.1 μg의 / μL의 최종 농도 1xDPBS 선택의 DNA 플라스미드를 희석. </li><li> ST20 15 V에 electroporator 및 설정 매개 변수를 켜십시오 - ST25 (E3-E4) 망막 및 ST26 20 V - ST27 (E5) 망막. 1 초 간격으로 50 밀리 초 펄스 길이의 5 펄스 펄스 반복을 설정합니다. 양손 곳에 전극을 유지하는 데 필요한 것 같이 바닥에 발 페달에 의해 제어 될 수있는 펄스 발생기를 사용한다. </li><li> 두 개의 패들 형 (평면, 원형 DIAM을. 4mm) 연결 백금 전극 (그림 2A)를 펄스 발생기의 출력 소켓에. 참고 :이 프로토콜에 사용되는 백금 전극 대학 워크샵에 의해 만들어졌다. 전극은 0.1 mm의 백금 판 &quot;rondelles&quot;(: 950 편 / 5 구리 백금 등급)에서 만들어졌다. 연결 0.8 mm 위스콘신재는 플라스틱 배관을 이용하여 절연 하였다. </li><li> 조심스럽게 망막 절편에 맞는 팁 개방 크기를 취득 잘라 끝 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용하여 큐벳 (또는 이에 상응하는 작은 용기) 단계 2.3에서 전체 망막 절편을 전송합니다. 망막은 플라스틱에 부착 떨어져 눈물 경향이 피펫 팁을 사용하지 마십시오. </li><li> 부드럽게 찢어지지 않도록 망막을 만지지 않도록 망막 절편 돌보는 주변 전체 1X PBS를 제거하기 위해 100 μL 피펫을 사용합니다. </li><li> 전체 망막 절편을 충당하기 위해 큐벳에 100 μL 플라스미드 솔루션을 추가합니다. 그것은 정상에 수레 경우 부드럽게 집게로 망막 절편을 누릅니다. 큐벳의 바닥 큐벳 및 시신경의 어느 한 쪽을 향하도록 렌즈를 위치 시키거나 집게 전극을 사용한다. </li><li> 조직을 건드리지 않고, 렌즈와 망막 (도 2A) 뒤에 부극 앞에 정극을 배치. </li><li>발 페달을 눌러 전류를 적용합니다. 성공적인 방전을 나타내는 전극에 거품이 있는지 확인합니다. </li><li> 망막을 손상시키지 않고, 큐벳 모든 플라스미드를 제거하기 위해 믹스 100 ㎕를 피펫을 사용한다. 플라스미드 믹스 3-5 번 재사용 할 수 있습니다. </li><li> 사전 예열 (37 ° C) 1X PBS로 큐벳을 입력합니다. 부드럽게 큐벳의 벽에서 망막 절편을 분리 집게를 사용합니다. 전기 천공 후 망막은 때때로 큐벳의 벽에 부착하게하는 거품으로 덮여있다. </li><li> 웰 당 1ml를 예열 된 (37 ℃) 배양 배지를 함유하는 24- 웰 플레이트에 전체 망막 이식편을 전송 폴리에틸렌 파스퇴르 피펫을 사용한다. 물론 당 하나의 망막 절편을 품어. </li><li> 24 시간 동안 5 % CO 2 세포 배양기 안에, 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ° C에서 배양 한 망막 이식편. 회전 매체와 preve에 노출을 최대화하는 것이다24- 웰 플레이트의 바닥에 망막의 NT 밀착성. </li><li> 4 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 화학 시약 전체 망막 외식의 치료 주 : 전체 망막 이식편의 화학적 처리는 2 단계 후 직접 수행 될 수있다. <ol><li> 1 DMEM : F12 영양소 혼합물, 10 % FBS, 10 U / ml의 페니실린 스트렙토 마이신, 5 μg의 / ㎖ 인슐린, 및 2 mM L- 글루타민을 함유 한 배양 배지를 준비한다. </li><li> 물론 당 (37 ° C를) 배지 예열 1 ml에 포함 된 24 웰 플레이트로 단계 2.3에서 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 물론 당 하나의 망막 절편을 품어. </li><li> 화학 반응물 또는 비히클을 첨가하기 전에 5 % CO 2 세포 배양기 안에 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ℃에서 60 분 동안 전 배양 한 망막 이식편. </li><li> 예를 들면, 화학 용액을 제조는 Cdk1 / 2 억제제 III, 최종 단계에서 M (13)의 진행 억제제,DMSO 30 μM의 농도. </li><li> 세포 배양기에서, 전체 망막 절편을 포함, 24 웰 플레이트를 제거합니다. 0.01 % DMSO에서 300nm의는 Cdk1 / 2 억제제 III의 최종 농도 결과 망막 매체에 직접 화학 반응물 또는 비히클 (DMSO)의 10 μL를 추가한다. 수동 용액에서 화학 시약 또는 비히클의 균일 한 분포를 허용하도록, 24 웰 플레이트를 회전한다. </li><li> 소정 시간 (최대 24 시간) 5 % CO 2 인큐베이터 안에 50 RPM의 일정한 속도로, 회전 진탕 기에서 37 ° C에서 배양 한 망막 이식편. </li><li> 4 단계로 진행합니다. </li></ol></li></ol> 4. 고정 및 전체 망막 Eexplants의 동결 <ol><li> 세포 배양기에서 처리 된 전체 망막 절편을 포함하는 24 웰 플레이트를 제거합니다. </li><li> 1 x PBS를 1 mL의 IN / 웰 빙냉 4 % 파라 포름 알데히드를 함유하는 24 웰 플레이트에 망막 이식편을 전송할 작은 스푼을 사용한다. Incuba15 분 동안 얼음에 테. </li><li> 망막을 씻어 1 ㎖ / 잘 차가운 얼음 x PBS를 포함 된 24 웰 플레이트에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 10 분 동안 얼음 위에서 배양한다. </li><li> 1 ㎖ / x PBS를 잘 차가운 얼음 30 % 자당을 포함하는 24 웰 플레이트에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 1-3 시간이 망막의 배아 일에 따라 얼음 위에서 배양한다. ST20은 - ST25 (E3) 망막은, 1 시간 동안 품어, 이전 망막은 자당에 이상 배양 시간이 필요합니다. </li><li> 약 500 μL 저온 유지 동결 설치 매체를 포함하는 파라핀 필름에 전체 망막 절편을 전송하는 작은 숟가락을 사용합니다. 부드럽게 작은 스푼을 사용하여 동결 배지에서 망막 이식편을 이동시킴으로써만큼 수크로오스 최대한 제거한다. </li><li> 동결 배지를 함유하는 주형에 매립 망막 이식편 옮긴다. 미래의 단면을 용이하게하기 위해 눈을 놓습니다. DR에 전체 망막 이식편을 함유하는 틀 매립 넣어매체까지 Y 얼음이 얼어있다. -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol>

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	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 작품에서 해부, 전기 또는 화학 처리, 닭 배아에서 전체 망막 외식의 배양을위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 빠르고 용이하고 모두 높은 성공률을 허용하고 재현성 결과. 전체 망막 이식편의 전기 천공은 관심 유전자 구조를 발현하는 세포의 큰 영역을 생성한다. 올바르게 전극을 배치하고, 정의 된 플라스미드 DNA 농도 망막의 특정 부분을 ?...

망막은 중추 신경계의 일부이며 그 단순함과 잘 특성화 셀룰러 아키텍처, 중추 신경계 발달을 연구하기위한 인기있는 모델이다. 닭 배아의 눈은 배아의 나머지 부분에 비해 상대적으로 크다. 따라서 이러한 주사 또는 전기로 실험 조작에 대한 OVO에 쉽게 접근 할 수 있으며, 망막 세포와 생체 내에서 발생 생물학에 대한 지식을 얻을 수있는 훌륭한 도구 역할을한다. 실험 electroporations, 반복 주사, 또는 결합 된 실험 조작과 같은 침략 때 이러한 주요 장점에도 불구하고, 배아의 생존율이 낮을 수있다. OVO에서 닭 배아에 DNA 플라스미드의 전기가 중요하고 잘 확립 된 기술 1입니다. 그것은 중앙 NERV에서 세포의 운명뿐만 아니라 신경 책자의 추적, 뉴런의 표시를 허용시스템의 OU하며 생체 내에서 단백질의 기능 분석 이소성 유전자 발현을 허용한다. 이 기술은 3 후뇌, 4 망막 신경 튜브 (2)의 연구에 사용되었다. OVO의 배아 망막의 전기는 생체 내 상황에 관련된 몇 가지 실험적인 어려움이있다. 태아의 뇌 폴딩으로 인한 눈의 위치, 중심에 비교적 가깝다. 이 근접 전기 다음 심장 마비의 위험 및 배아의 나이와 위험 증가를 증가시킨다. 또한, 눈에 액세스하기 위해서는 이에 출혈, 기형 및 후속 감소 가능성에 대한 위험을 증가 배아 멤브레인을 열 필요가있다. 테스트 및 공지 표현형 결과없이 종종 새로운 DNA 플라스미드를 최적화 할 때, 이러한 한계는 심지어 숙련 된 실험자 방법의 효능 및 전력을 감소시킬 수있다. 이 프로토콜, W의 문화에 제시된 바와 같이제거 색소 상피 세포와 전체 신경 망막으로 정의 구멍 망막 이식편은 비켜 접근 방식을 보완하는 효율적인 방법이다. 화학 시약의 안구 내 주사는 비켜에서 수행하기가 비교적 쉽다. 그러나, 신경 망막 내 시약의 주입 효과적이고 정확한 농도는 완전히 제어하기 어려울 수있다. 주입 된 부피는 누설에 따라 다를 수 있으며, 주사의 정확한 위치는 눈 내부의 시약의 유통 및 유리체를 통해 확산 모두에 영향을 미칠 수 있습니다. 가변성 즉, 효소 억제제에 대한 투여 량 반응 곡선을 결정 결과의 해석에 중요한 의미를 가질 것이다; 효과는 적고, 효과의 시간 창이 좁 경우 특히. 오보 실험에서 또한 수행 할 때, 단일 눈 인한 혈류를 통한 전신 효과 전위 각 배아에서 사용될 수있다반대편 눈 위에. 개발 및 처리 및 제어 배아 추가 실험 변동 될 수 있습니다 사이의 개별 변동을 연구 할 때 나이 일치가 중요하다. 이러한 이유로, 닭 배아 망막 이식편에 기초한 방법 오보 EX가되는 신경 망막을 균일하게 노출 될 수 있으며, 시험 관내에서의 실험 조건을 제어, 개발되었다. 본 프로토콜은 이전 프로토콜 5-9를 기반으로 개발되었다. 스테이지로부터 망막 이식편 (세인트) ST31 20 (3 배아 일 [E])을 (E7)는 닭 배아는 배양 해부 및 일렉트로 정의 DNA 플라스미드 농도 또는 화학 시약의 규정 농도를 함유하는 배지에 노출시켰다. 여기에 제시된 프로토콜은 성공적 KU55933, SB 218,078 및 109,555 NSC dito 같은 DNA 손상 경로의 레귤레이터를 포함하여 여러 가지 화학 시약을 사용하여, 최근의 간행물에서 구현 된이러한는 Cdk1 / 2 10,11 III 억제제로서 sylate 및 세포주기.

<table><tbody><tr><td>1xPBS (tablet)</td><td>Life technologies</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14080-048</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>734-0006</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l pipette tips</td><td>VWR</td><td>613-0798</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml disposable plastic cuvette</td><td>Thomas Scientific</td><td>8495V01</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D7039</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>391-1998</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Solveco</td><td>1054</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/2 inhibitor III</td><td>217714</td><td>Calbiochem</td><td>300 nM in 0.01% DMSO</td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Electrodes</td><td></td><td></td><td>Platina, custom made</td></tr><tr><td>Electro square porator ECM 830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 Nutrient mix</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>AgnThos</td><td>0108-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>Freezing medium NEG50</td><td>Cellab, Sweden</td><td>6502</td><td></td></tr><tr><td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator</td><td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td><td>8204</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>VWR</td><td>291-1214P</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way embedding mold&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6032</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoHistone 3 (PH3)&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Dilution 1/4,000</td></tr><tr><td>Platinum electrodes (custom made from &quot;rondelles&quot;)</td><td>Sargenta</td><td>390-R (rondeller)</td><td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td></tr><tr><td>Platimun electrodes&amp;nbsp;</td><td>Sonidel</td><td>CUY700P4L</td><td>Dia: 4 mm</td></tr><tr><td>Polyethylene pasteur pipette</td><td>VWR</td><td>612-2853</td><td></td></tr><tr><td>Rotator shaker</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>Small spoon</td><td>VWR</td><td>231-2151</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>443815S</td><td></td></tr><tr><td>White Leghorn eggs</td><td></td><td></td><td>Local supplier</td></tr><tr><td>Wine cooler</td><td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

망막은 개발 중추 신경계에 대한 좋은 모델입니다. OVO / 생체 내에서 실험 조작에 대한 눈의 큰 규모와 가장 중요한 것은 접근성은 닭 배아 망막 다양하고 매우 효율적인 실험 모델을 만든다. 닭 인공 망막은 주사 또는 일렉트로 포 레이션에 의한 오보 타겟팅하기 쉽지만, 망막 내의 시약의 정확한 농도 및 효과가 충분히 제어하는 것이 어려울 수있다. 이것은 눈 또는 물질의 요철 확산에서 정확한 주사 부위, 누설의 변화에​​ 기인 할 수있다. 또한, 이러한 전기 천공 등 침습적 조작 후 기형 및 사망률의 주파수는 다소 높다. 이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식을 배양하기위한 기술 비켜 예를 설명하고 시약에 망막의 제어 노출하는 방법을 제공한다. 프로토COL은 실험적으로, 해부 조작하고, 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법에 대해 설명합니다. 이식편은 약 24 시간 동안 배양 될 수 있으며, 이러한 전기 천공과 같은 다른 조작을 실시한다. 주요 장점은 실험 배아의 생존 및 도입 시약의 농도가 다양하고 효과적인 농도를 결정하고 최적화하기 위해 제어 될 수 의존하지 않는 것이있다. 또한, 기술은 높은 실험 성공률과 함께 신속한 저렴하고, 그것을 재현 보장 결과. 그것은 비켜에서 수행 실험에 훌륭한 보완의 역할을 강조한다.

이 프로토콜은 닭의 배아에서 전체 망막 외식의 준비 (그림 1A-F)과 배양에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 ST31에 ST20 (E3)의 배아에서 전체 망막 외식 (E7) 사용되어왔다. 전체 망막 이식편으로 플라스미드 DNA의 전기 망막 전구 세포의 표지 및 추적 또는 과발현 다른 유전자 생성물의 허용한다. 전기 실험의 경우, 색소 상피 신중 ST25 (E4 ½) 배아의 세포핵...

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다.

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K 조회수.  Uppsala University.  이 프로토콜은, 해부 실험 조작과 닭의 배아에서 문화 전체 망막 외식하는 방법을 설명합니다. 높은 성공률, 효능 및 재현성은 전기 및 / 또는 시약의 물질, 즉, 효소 억제제 플라스미드의 효과를 테스트하기 위해 필요할 때 이식편 배양 물은 유용하다. 

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Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

연구

발생학

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HH 스테이지 10 치킨 태아의 비켜 Electroporations에서

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

생물학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

신경과학

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Dopaminergic 신경 세포 개발에서 유전자 기능을 유학 칙의 Midbrain에서 비켜 Electroporation에

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

배아 칙의 망막에서 비켜 Electroporation에

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

에 의한 이전 치킨 태아에 유전자 이체<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

닭 배아망막에서 콘 세포 상호 작용에 로드를 연구하는 원뿔 농축 배양

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and accessibility for visualization and experimental manipulations. However, its major technical limitation had been the lack of robust loss-of-function approaches for gene function analyses. This protocol describes a methodology of gene silencing in the developing chick retina that involves transgenic expression of artificial microRNAs (miRNAs) by using the Tol2 transposon system. In this approach, a Tol2 transposon plasmid that contains an expression cassette for the EmGFP (emerald green fluorescent protein) marker and artificial pre-miRNA sequences against a target gene is introduced into the embryonic chick retina with a Tol2 transposase expression construct by in ovo electroporation. In the transfected retinal cells, the transposase catalyzes the excision of the expression cassette from the transposon vector and its integration into host chromosomes, leading to the stable expression of miRNAs and the EmGFP protein. In our previous study, we have demonstrated that the expression of Nel, a glycoprotein that exerts multiple functions in neural development, can be significantly suppressed in the developing chick retina by using this technique. Our results indicate that this methodology induces a stable and robust suppression of gene expression and thus provides an efficient loss-of-function approach for studies of retinal development.

We have developed a novel loss-of-function approach that involves the introduction and genomic integration of artificial micro-RNA sequences into chick embryos by using in ovo electroporation and the Tol2 transposon system. This technique provides a robust and stable gene knockdown methodology for studies of gene function during development.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

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차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :