Name: whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
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The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

Este protocolo é realizada de acordo com as recomendações contidas no &quot;Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia&quot;. 1. Egg Manuseio e coleção dos olhos <ol><li> Armazenar ovos brancos Leghorn em 12-14 ° C durante não mais de uma semana. Se possível, use um refrigerador de vinho refrigerado para armazenar os ovos fertilizados. Nota: temperaturas mais elevadas armazenar levar ao desenvolvimento anormal dos embriões, enquanto temperaturas mais baixas aumenta a mortalidade. Tempo de armazenamento prolongado aumenta a mortalidade e desenvolvimento anormal. </li><li> Incubar os ovos em uma de 37,5 ° C e 60% incubadora de ovos umidificado com balanço delicado a uma frequência de 5 vezes por 24 horas. </li><li> Remover os ovos incubados na incubadora de ovos com a idade embrionária pretendida. Nota: A idade do embrião de galinha é determinada como o tempo de incubação e é denotado como dia embrionário (E) ou como fases (r), De acordo com a série de estágios de desenvolvimento descritas por Hamburger e Hamilton 12. </li><li> Coloque os ovos selecionados na capela de fluxo laminar. Limpar a casca de ovo com 70% de etanol para evitar a contaminação do embrião. Nota: Realizar todos os procedimentos sob condições assépticas com soluções estéreis <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> e instrumentos. </li><li> Toque no lado do ovo firmemente contra uma superfície dura para rachar o ovo. Coloque o conteúdo em uma placa de Petri de 100 milímetros. Utilize uma pequena colher a transferência do embrião para um prato de 35 mm de Petri contendo pré-aquecido (37 ° C) 1x PBS para evitar que o tecido de secagem. </li><li> Coloque o prato de 35 milímetros Petri contendo o tecido embrionário em um microscópio binocular de dissecação estereovisão na capela de fluxo laminar. Decapitar o embrião por beliscar o pescoço com uma pinça fina e descartar o corpo. </li><li> Use uma pinça fina para fazer uma incisão tháspero boca, ventral para o olho. Começando no local da incisão, rasgar o tecido circundante o olho inteiro. Beliscar fora do nervo óptico e remover o olho intacto de cavidade ocular. Recolha tanto o olho esquerdo e direito do mesmo embrião para o uso como o controle ou o olho tratado. </li><li> Utilize uma pequena colher para transferir os olhos para uma nova placa de Petri 35 mm contendo pré-aquecido (37 ° C) PBS 1x. </li></ol> 2. Preparação de explantes de retina inteiras <ol><li> Use uma pinça fina para remover todo o tecido em volta do olho incluindo a anlage escleral. Nota: O tecido irá separar facilmente deixando a retina no corpo vítreo e a lente com o epitélio pigmentar intacta (Figura 1A-B). </li><li> Utilize uma pinça fina para comprimir uma pequena incisão no epitélio pigmentado na parte dorsal do olho sem danificar a retina neural (Figura 1C). </li><li> Utilize uma pinça fina para rasgar suavemente abrir o epitélio pigmentar starting no local da incisão, deixando a lente e a retina inteira ligada ao corpo vítreo (Figura 1D). Manter o olho em água morna (37 ° C) 1x PBS para facilitar a remoção do epitélio de pigmento. Nota: O epitélio do pigmento podem ser difíceis de remover, em particular ao longo do corpo ciliar em torno da pupila, na região anterior do olho, e ao longo da fissura coróide. Portanto, alguns do epitélio de pigmento pode ser deixada sobre a retina neural (Figura 1E-F). </li></ol> 3. Tratamento de toda retinianas explantes <ol start="1"><li> A electroporação de explantes de retina inteiras Nota: A electroporação de explantes de retina inteiras pode ser realizada directamente após o passo 2. <ol><li> Prepare meio de cultura contendo 1: 1 DMEM: F12 mistura de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, e 2 mM de L-glutamina. </li><li> Cortar um 1,5 ml cuvette de plástico descartável (12,5 mm x 12,5 milímetros x 45 mm) (ou qualquer recipiente pequeno capaz de conter uma solução de 300-400 uL) de aproximadamente 8 mm a partir do fundo usando uma serra de lâminas finas. </li><li> Dilui-se o plasmídeo de ADN de escolha em 1xDPBS a uma concentração final de 0,1 ug / ul. </li><li> Ligue os parâmetros electroporador e definido para 15 V para ST20 - ST25 (E3-E4) retina e 20 V para ST26 - st27 (E5) retina. Defina as Pulso-repetições para 5 pulsos de 50 ms de pulso de comprimento com intervalos de 1 segundo. Usar um gerador de impulsos que pode ser controlada por um pedal de pé sobre o chão, como será necessário duas mãos para segurar os eléctrodos no lugar. </li><li> Conecte dois pá em forma (flat, diam circular. 4 mm) eletrodos de platina (Figura 2A) à tomada de saída no gerador de impulsos. Nota: Os eletrodos de platina utilizados neste protocolo foram feitas pela oficina da universidade. Os eléctrodos foram feitos a partir de 0,1 mm placa de platina &quot;rondelles&quot; (grau de platina: Pt 950 / Cu 5). O conectando 0,8 milímetros wire foi isolada usando tubos de plástico. </li><li> Transferir cuidadosamente todo o explante de retina a partir do passo 2.3 para a tina (ou pequeno recipiente equivalente) usando uma pipeta de Pasteur de polietileno com a ponta cortada para adquirir o tamanho da ponta de abertura certo para o explante de retina. Evite o uso de pontas de pipeta como a retina tende a anexar ao plástico e rasgar. </li><li> Use uma pipeta de 100 mL para remover suavemente toda a 1x PBS em torno do explante retina tomando cuidado para não tocar na retina para evitar rasgar. </li><li> Adicionar 100 ul de solução de plasmídeo para a cuvete para cobrir todo o explante da retina. Pressione cuidadosamente o explante de retina com uma pinça se ele flutua para cima. Use uma pinça ou eléctrodos para posicionar a lente para uma face lateral da cuvete e do nervo óptico qualquer para o fundo da tina. </li><li> Colocar o eléctrodo positivo em frente da lente e o eléctrodo negativo atrás da retina (Figura 2A), sem tocar no tecido. </li><li>Aplique o atual pressionando para baixo o pé-pedal. Verifique se há bolhas nos eletrodos indicando descarga bem sucedido. </li><li> Usar uma pipeta de 100 uL para remover toda a mistura de plasmídeo a partir da cuvete sem danificar a retina. A mistura de plasmídeo pode ser reutilizada de três a cinco vezes. </li><li> Encha-se a cuvete com pré-aquecido (37 ° C) PBS 1x. Utilize uma pinça para separar suavemente o explante da retina a partir da parede da cuvete. Após a electroporação, por vezes, a retina está coberta com bolhas, o que torna aderir à parede da cuvete. </li><li> Utilizar a pipeta de Pasteur de polietileno para transferir toda a retina explante em uma placa de 24 poços contendo 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por poço. Incubar um explante da retina por poço. </li><li> Incubar o explante da retina, a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, no interior de uma célula incubadora com 5% de CO 2 durante 24 horas. A rotação é garantir o máximo de exposição ao meio e prevent adesão da retina para o fundo da placa de 24 poços. </li><li> Vá para a etapa 4. </li></ol></li><li> O tratamento de explantes de retina inteiras com reagentes químicos Nota: O tratamento químico de explantes de retina inteiras pode ser realizada directamente após o passo 2. <ol><li> Prepare meio de cultura contendo 1: 1 DMEM: F12 mistura de nutrientes, 10% de FBS, 10 U / ml de penicilina estreptomicina, 5 ug / ml de insulina, e 2 mM de L-glutamina. </li><li> Utilize uma pequena colher para transferir o explante da retina a partir do passo 2.3 em uma placa de 24 poços contendo 1 ml de pré-aquecido (37 ° C) meio de cultura por poço. Incubar um explante da retina por poço. </li><li> Incubar todo o explante de retina durante 60 minutos a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, no interior de uma célula incubadora com 5% de CO2 antes da adição de um reagente químico ou veículo. </li><li> Preparar a solução química, por exemplo Cdk1 / 2 inibidor III, um inibidor da progressão da fase M 13, no final de umconcentração de 30 uM em DMSO. </li><li> Remova a placa de 24 poços, contendo todo o explante da retina, da incubadora celular. Adicionam-se 10 ul do reagente químico ou o veículo (DMSO) directamente ao meio da retina, o que resulta numa concentração final de 300 nM Cdk1 / 2 inibidor III em 0,01% de DMSO. Rodar manualmente a placa de 24 poços para permitir uma distribuição uniforme do reagente químico ou veículo na solução. </li><li> Incubar os explantes de retina, a 37 ° C num agitador rotor, com uma velocidade constante de 50 rpm, dentro de uma incubadora com 5% de CO 2 durante o tempo desejado (até 24 horas). </li><li> Vá para a etapa 4. </li></ol></li></ol> 4. Fixação e Congelamento de Whole Retinal Eexplants <ol><li> Remova a placa de 24 poços, que contém todo o explante da retina tratadas da incubadora celular. </li><li> Utilize uma pequena colher para transferir o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 ml / poço de gelo frio paraformaldeído a 4% em 1xPBS. Incubate em gelo durante 15 min. </li><li> Utilize uma pequena colher para transferir todo o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 mL / poço 1xPBS geladas para lavar a retina. Incubar em gelo durante 10 min. </li><li> Utilize uma pequena colher para transferir todo o explante da retina para uma placa de 24 poços contendo 1 ml / poço de gelo frio de sacarose a 30% em 1xPBS. Incubar em gelo durante 1-3 horas dependendo do dia embrionário da retina. Para ST20 - ST25 (E3) as retinas, incubar durante 1 hora, as retinas idosos necessitam de mais tempo de incubação em sacarose. </li><li> Use uma colher pequena para transferir todo o explante de retina para uma película de parafina contendo cerca de 500 ul congelamento cryostat meio de montagem. Remover o máximo possível de sacarose como movendo-se delicadamente o explante da retina no meio de congelamento, utilizando a pequena colher. </li><li> Transferir o explante da retina para um molde contendo a incorporação de meio de congelação. Posicione o olho para facilitar futuro seccionamento. Coloque o molde contendo a incorporação de todo o explante de retina no dry gelo até o meio é congelado. Armazenar a -80 ° C. </li></ol>

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	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. 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Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Neste trabalho, um protocolo detalhado para dissecção, eletroporação ou tratamento químico, e cultivo de explantes de retina inteiras de embriões de galinha é apresentado. Este protocolo é fácil, rápido e permite tanto uma elevada taxa de sucesso e reprodutível resultados. A electroporação de explantes de retina inteiros produz grandes áreas de células que expressam a construção de gene de interesse. É fácil de posicionar correctamente os eléctrodos e p...

A retina é parte do sistema nervoso central e é, com a sua relativa simplicidade e arquitetura celular bem caracterizada, um modelo popular para estudar o desenvolvimento do sistema nervoso central. O olho de embrião de galinha é relativamente grande em comparação com o resto do embrião. É, portanto, facilmente acessível in ovo para manipulações experimentais, tais como injecções ou eletroporação, e serve como uma ferramenta excelente para adquirir conhecimento sobre células da retina e biologia do desenvolvimento in vivo. Apesar destas vantagens principais, a sobrevivência dos embriões pode ser baixo quando as experiências são invasivos, como com electroporations, injeções repetidas, ou manipulações experimentais combinados. A electroporação de plasmídeos de ADN para o embrião de galinha in ovo é uma técnica importante e bem estabelecido 1. Ela permite a marcação de neurónios, o rastreio de destino celular, bem como vias neuronais no centro nervous sistema e que permite a expressão ectópica de genes para analisar a função da proteína in vivo. A técnica tem sido utilizada para estudos de tubo neural 2, rombencéfalo 3, 4 e da retina. Eletroporação de retina embrionária in ovo tem algumas dificuldades experimentais que estão relacionados com a situação in vivo. A posição do olho, devido à dobragem cranial do embrião, é relativamente perto do coração. Esta proximidade aumenta o risco de paragem cardíaca após a electroporação, e o risco aumenta com a idade do embrião. Além disso, para aceder ao olho, que é necessário para abrir as membranas embrionárias, aumentando assim o risco de sangramento, malformações e subsequente viabilidade reduzida. Ao testar e otimizar um novo plasmídeo DNA, muitas vezes sem um resultado fenotípico conhecido, as limitações podem diminuir a eficácia e poder do método, mesmo para um experimentalista experiente. Conforme apresentado neste protocolo, a cultura do wfuro explante da retina, definida como toda a retina neural com o epitélio pigmentar removido, é um método eficiente em que complementa a abordagem in ovo. Injecções intra-ocular de reagentes químicos são relativamente fáceis de executar in ovo. No entanto, a concentração eficaz e exacta de reagentes injectados dentro da retina neural pode ser difícil de controlar totalmente. O volume injectado pode variar devido a fugas e o local exacto de injecção podem afetar tanto a distribuição do reagente no interior do olho e a difusão através do corpo vítreo. A variabilidade terá grandes implicações para a interpretação dos resultados, quando isto é, uma curva dose-resposta para um inibidor da enzima é determinada; particularmente se o efeito é pequeno e a janela temporal do efeito é estreita. Além disso, apenas um único olho pode ser usado de cada embrião quando realizando experiências in ovo devido a possíveis efeitos sistémicos através da corrente sanguíneapara o olho contralateral. Combinando a idade é importante quando se estuda o desenvolvimento ea variabilidade individual entre tratados e embriões de controle pode levar a variabilidade experimental adicional. Por estas razões, um ex ovo método baseado em explantes de retina de embriões de galinha foi desenvolvido, em que a retina neural pode ser exposto a uma uniforme e controlada condição experimental in vitro. O presente protocolo foi desenvolvido com base em protocolos anteriores 5-9. Explantes de retina de fase (ST) 20 (dias embrionárias [E] 3) para ST31 (E7) embriões de galinha foram dissecadas, e cultivadas a electroporação com um plasmídeo de ADN definida concentração ou expostos a um meio contendo uma concentração definida de um reagente químico. O protocolo apresentado aqui foi implementado com sucesso em publicações recentes, usando vários reagentes químicos diferentes, incluindo reguladores da via danos no DNA, tais como KU55933, SB 218078, 109555 e NSC ditosylate, e o ciclo celular, tais como Cdk1 / 2 inibidor III 10,11.

<table><tbody><tr><td>1xPBS (tablet)</td><td>Life technologies</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14080-048</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>734-0006</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l pipette tips</td><td>VWR</td><td>613-0798</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml disposable plastic cuvette</td><td>Thomas Scientific</td><td>8495V01</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D7039</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>391-1998</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Solveco</td><td>1054</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/2 inhibitor III</td><td>217714</td><td>Calbiochem</td><td>300 nM in 0.01% DMSO</td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Electrodes</td><td></td><td></td><td>Platina, custom made</td></tr><tr><td>Electro square porator ECM 830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 Nutrient mix</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>AgnThos</td><td>0108-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>Freezing medium NEG50</td><td>Cellab, Sweden</td><td>6502</td><td></td></tr><tr><td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator</td><td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td><td>8204</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>VWR</td><td>291-1214P</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way embedding mold&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6032</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoHistone 3 (PH3)&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Dilution 1/4,000</td></tr><tr><td>Platinum electrodes (custom made from &quot;rondelles&quot;)</td><td>Sargenta</td><td>390-R (rondeller)</td><td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td></tr><tr><td>Platimun electrodes&amp;nbsp;</td><td>Sonidel</td><td>CUY700P4L</td><td>Dia: 4 mm</td></tr><tr><td>Polyethylene pasteur pipette</td><td>VWR</td><td>612-2853</td><td></td></tr><tr><td>Rotator shaker</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>Small spoon</td><td>VWR</td><td>231-2151</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>443815S</td><td></td></tr><tr><td>White Leghorn eggs</td><td></td><td></td><td>Local supplier</td></tr><tr><td>Wine cooler</td><td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

A retina é um bom modelo para o sistema nervoso central em desenvolvimento. O grande tamanho do olho e, mais importante a acessibilidade para manipulações experimentais em ovo / in vivo torna o frango retina embrionária um modelo experimental versátil e muito eficiente. Embora a retina da galinha é fácil de atingir in ovo por injecções intra-oculares ou electroporação, e a concentração eficaz exacta dos reagentes no interior da retina pode ser difícil de controlar totalmente. Isto pode ser devido a variações do local da injecção exacta, vazamento a partir do olho ou difusão desigual das substâncias. Além disso, a frequência de malformações e mortalidade após manipulações invasivos, tais como electroporação é bastante elevada. Este protocolo descreve uma técnica ex ovo para a cultura de explantes de retina inteiras a partir de embriões de galinha e proporciona um método para a exposição controlada da retina para reagentes. O protocol descreve como dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura inteiros a partir de embriões de galinha. Os explantes podem ser cultivados durante cerca de 24 horas e ser submetidos a manipulações diferentes, tais como electroporação. As principais vantagens são que a experiência não é dependente a sobrevivência do embrião e que a concentração do reagente introduzido pode ser variado e controlado, a fim de determinar e optimizar a concentração eficaz. Além disso, a técnica é rápida, barata e juntamente com a sua elevada taxa de sucesso experimental, que garante reprodutível resultados. Deve-se ressaltar que ele serve como um excelente complemento para experimentos realizados in ovo.

Este protocolo descreve a preparação (Figura 1A-M) e a cultura de explantes de retina inteiras a partir de embriões de galinha. Este protocolo foi usado com sucesso para a retina a partir de explantes de embriões inteiros de ST20 (E3) para ST31 (E7). Eletroporação de plasmídeos de DNA em explantes de retina inteiras permite a rotulagem e rastreamento de células progenitoras da retina ou a sobre-expressão de diferentes produtos de genes. Para as experiências de elec...

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Este protocolo descreve um método para dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura completa de embriões de galinha. As culturas de explantes são úteis quando a taxa de sucesso elevada, eficácia e reprodutibilidade são necessários para testar os efeitos de plasmídeos para a electroporação e / ou substâncias de reagentes, isto é, inibidores enzimáticos.

Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K visualizações.  Uppsala University.  Este protocolo descreve um método para dissecar, experimentalmente manipular e explantes de retina cultura completa de embriões de galinha. As culturas de explantes são úteis quando a taxa de sucesso elevada, eficácia e reprodutibilidade são necessários para testar os efeitos de plasmídeos para a electroporação e / ou substâncias de reagentes, isto é, inibidores enzimáticos. 

Vídeo: Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Transferência de Gene eficiente em retinas pintainho para célula primária Estudos de Cultura: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Eletroporação Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Biologia do Desenvolvimento

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

Em Electroporations Ovo de Estágio HH 10 embriões de galinha

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biologia

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neurociência

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

No útero e ex eletroporação in vivo para Expressão Gênica em células ganglionares da retina do rato

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualização da migração celular tangencial no desenvolvimento Tectum óptica de Chick

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

Em Eletroporação Ovo na retina de pinto embrionário

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Transferência de Embriões em Gene de frango por mais velhos<em&gt; Ovo ex</em&gt; Eletroporação

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

Culturas enriquecidas por cone da retina de embriões de frango para estudar rod a interações celulares cone

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and accessibility for visualization and experimental manipulations. However, its major technical limitation had been the lack of robust loss-of-function approaches for gene function analyses. This protocol describes a methodology of gene silencing in the developing chick retina that involves transgenic expression of artificial microRNAs (miRNAs) by using the Tol2 transposon system. In this approach, a Tol2 transposon plasmid that contains an expression cassette for the EmGFP (emerald green fluorescent protein) marker and artificial pre-miRNA sequences against a target gene is introduced into the embryonic chick retina with a Tol2 transposase expression construct by in ovo electroporation. In the transfected retinal cells, the transposase catalyzes the excision of the expression cassette from the transposon vector and its integration into host chromosomes, leading to the stable expression of miRNAs and the EmGFP protein. In our previous study, we have demonstrated that the expression of Nel, a glycoprotein that exerts multiple functions in neural development, can be significantly suppressed in the developing chick retina by using this technique. Our results indicate that this methodology induces a stable and robust suppression of gene expression and thus provides an efficient loss-of-function approach for studies of retinal development.

We have developed a novel loss-of-function approach that involves the introduction and genomic integration of artificial micro-RNA sequences into chick embryos by using in ovo electroporation and the Tol2 transposon system. This technique provides a robust and stable gene knockdown methodology for studies of gene function during development.

Abordagem da Perda de Função na Retina de Pintinhos Embrionários Utilizando a Expressão Transgênica Mediada por Transposon Tol2 de MicroRNAs Artificiais

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Os explantes de retina inteiras de frango embriões para tratamentos de reagentes Eletroporação e Chemical

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