Name: whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments
Uploaded: 2015-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments at JoVE.com

The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

Questo protocollo è eseguita in conformità con le raccomandazioni nella &quot;Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio dell&#39;Associazione per la ricerca in visione e oculistica&quot;. 1. Manipolazione Uovo e la raccolta degli occhi <ol><li> Conservare le uova bianche Livorno a 12-14 ° C per non più di 1 settimana. Se disponibile, utilizzare un dispositivo di raffreddamento di vino refrigerato per conservare le uova fecondate. Nota: temperatura del serbatoio più elevate portano ad uno sviluppo anormale di embrioni, mentre temperature più basse aumentano la mortalità. Tempo di conservazione estesa aumenta sia la mortalità e lo sviluppo anormale. </li><li> Incubare le uova in un 37,5 ° C e 60% uovo incubatore umidificato con leggera oscillazione ad una frequenza di 5 volte per 24 ore. </li><li> Rimuovere le uova incubate dal termostato uovo all&#39;età embrionale desiderato. Nota: L&#39;età dell&#39;embrione di pollo è determinato come il tempo di incubazione e viene indicato come giorno embrionale (E) o come fasi (st), Secondo la serie di stadi di sviluppo descritti da Hamburger e Hamilton 12. </li><li> Collocare le uova selezionati nella cappa a flusso laminare. Pulire il guscio d&#39;uovo con il 70% di etanolo per evitare la contaminazione di un embrione. Nota: Condurre tutte le procedure in condizioni asettiche con soluzioni sterili <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> e strumenti. </li><li> Toccare il lato dell&#39;uovo saldamente contro una superficie dura per crack aprire l&#39;uovo. Posizionare il contenuto in una capsula di Petri 100 mm. Utilizzare un cucchiaino per trasferire l&#39;embrione di un piatto Petri 35 mm contenente pre-riscaldato (37 ° C) PBS 1x per evitare che il tessuto si secchi. </li><li> Porre la capsula di Petri 35 millimetri contenente il tessuto embrionale su un microscopio da dissezione stereovisione binocolo nella cappa a flusso laminare. Decapitare il embrione stringendo al collo con una pinza sottile e scartare il corpo. </li><li> Utilizzare una pinza sottile per fare un&#39;incisione °ruvida la bocca, ventrali per l&#39;occhio. Partendo dalla sede dell&#39;incisione, lacerare il tessuto che circonda l&#39;intero occhio. Pinch off il nervo ottico e rimuovere l&#39;occhio intatto dalla cavità oculare. Raccogliere sia l&#39;occhio destro e sinistro dello stesso embrione per uso come sia il controllo o l&#39;occhio trattato. </li><li> Utilizzare un cucchiaino per trasferire gli occhi ad una nuova piastra di Petri 35 mm contenente pre-riscaldato (37 ° C) PBS 1x. </li></ol> 2. Preparazione di intere retina Espianti <ol><li> Utilizzare una pinza sottile per rimuovere tutto il tessuto intorno all&#39;occhio compreso il anlage sclerale. Nota: Il tessuto si stacca facilmente lasciando la retina sul corpo vitreo e lente con dell&#39;epitelio pigmentato intatto (Figura 1A-B). </li><li> Utilizzare una pinza sottile per pizzicare una piccola incisione nel dell&#39;epitelio pigmentato nella parte dorsale della occhio senza danneggiare la retina neurale (Figura 1C). </li><li> Utilizzare una pinza sottile per strappare delicatamente aprire la starti epitelio pigmentatong al sito di incisione, lasciando la lente e l&#39;intera retina attaccata al corpo vitreo (Figura 1D). Mantenere l&#39;occhio in acqua calda (37 ° C) PBS 1x per facilitare la rimozione dell&#39;epitelio pigmentato. Nota: Il dell&#39;epitelio pigmentato può essere difficile da rimuovere, in particolare lungo il corpo ciliare intorno alla pupilla, nella regione anteriore dell&#39;occhio, e lungo la fessura coroide. Pertanto, alcuni dell&#39;epitelio pigmentato può essere lasciato sulla retina neurale (Figura 1E-F). </li></ol> 3. Trattamento di interi retina Espianti <ol start="1"><li> Elettroporazione di intere espianti di retina Nota: elettroporazione di intere espianti di retina può avvenire direttamente dopo la fase 2. <ol><li> Preparare terreno di coltura contenente 1: 1 DMEM: F12 mix di nutrienti, il 10% FBS, 10 U / ml di penicillina streptomicina, 5 mg / ml di insulina, e 2 mM L-glutammina. </li><li> Tagliare un 1,5 ml monouso provetta in plastica (12,5 millimetri x 12,5 millimetri x 45 mm) (o qualsiasi piccolo contenitore in grado di contenere soluzione 300-400 microlitri) di circa 8 mm dal fondo con una sega fine-lama. </li><li> Diluire il DNA plasmidico di scelta in 1xDPBS ad una concentrazione finale di 0,1 mg / mL. </li><li> Accendere i parametri elettroporatore e impostati a 15 V per ST20 - ST25 (E3-E4) retina e 20 V per ST26 - ST27 (E5) retina. Impostare il polso si ripete a 5 impulsi di 50 msec impulso di lunghezza, con intervalli di 1 sec. Utilizzare un generatore di impulsi che può essere controllato da un pedale sul pavimento come saranno necessarie entrambe le mani per tenere gli elettrodi in posizione. </li><li> Collegare due paddle forma (piatta, diametro circolare. 4 mm) elettrodi di platino (Figura 2A) alla presa di uscita sul generatore di impulsi. Nota: Gli elettrodi di platino utilizzati in questo protocollo sono state effettuate dal laboratorio dell&#39;università. Gli elettrodi sono state fatte dalla piastra platino 0,1 millimetri &quot;rondelle&quot; (grado di platino: 950 Pt / 5 Cu). Il collegamento wi 0,8 millimetrire è stato isolato tramite tubi di plastica. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;intero espianto della retina dal punto 2.3 alla cuvetta (o piccolo contenitore equivalente) con un polietilene pipetta Pasteur con la punta tagliata di acquisire la giusta dimensione punta-apertura per l&#39;espianto della retina. Evitare l&#39;uso di punte per pipette come la retina tende a collegare alla plastica e lacerare. </li><li> Utilizzare una pipetta 100 microlitri per rimuovere delicatamente l&#39;intero 1x PBS che circonda la retina espianto facendo attenzione a non toccare la retina per evitare di strappare. </li><li> Aggiungere la soluzione plasmide 100 microlitri alla cuvetta per coprire l&#39;intera espianto della retina. Premere con cautela il espianto della retina con una pinza se galleggia verso l&#39;alto. Usare pinze o elettrodi di posizionare l&#39;obiettivo di affrontare qualsiasi lato della cuvetta e il nervo ottico al fondo della cuvetta. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo positivo di fronte alla lente e l&#39;elettrodo negativo dietro la retina (Figura 2A), senza toccare il tessuto. </li><li>Applicare la corrente premendo il pedale. Verificare la presenza di bolle agli elettrodi che indica scarico di successo. </li><li> Utilizzare una pipetta 100 microlitri per rimuovere tutto il mix plasmide dalla cuvetta senza danneggiare la retina. La miscela plasmide può essere riutilizzato tre a cinque volte. </li><li> Riempire la cuvetta con pre-riscaldato (37 ° C) PBS 1x. Utilizzare pinze per staccare delicatamente l&#39;espianto della retina dalla parete della provetta. Dopo elettroporazione retina è talvolta coperto di bolle, che fa aderire alla parete della provetta. </li><li> Utilizzare la pipetta Pasteur polietilene per trasferire l&#39;intera espianto retina in una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) di coltura per pozzetto. Incubare un espianto di retina per pozzetto. </li><li> Incubare la espianto retinica a 37 ° C su un agitatore rotatore, con una velocità costante di 50 giri al minuto, in un incubatore cella con 5% di CO 2 per 24 ore. La rotazione è quello di garantire la massima esposizione al mezzo e Prevent adesione della retina al fondo della piastra da 24 pozzetti. </li><li> Passare al punto 4. </li></ol></li><li> Trattamento di interi espianti retinici con reagenti chimici Nota: il trattamento chimico di intere espianti di retina può avvenire direttamente dopo la fase 2. <ol><li> Preparare terreno di coltura contenente 1: 1 DMEM: F12 mix di nutrienti, il 10% FBS, 10 U / ml di penicillina streptomicina, 5 mg / ml di insulina, e 2 mM L-glutammina. </li><li> Utilizzare un cucchiaino per trasferire l&#39;espianto retina dal punto 2.3 in una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml preriscaldate (37 ° C) terreno di coltura per pozzetto. Incubare un espianto di retina per pozzetto. </li><li> Incubare tutta espianto retina per 60 min a 37 ° C su un agitatore rotatore, con una velocità costante di 50 giri al minuto, in un incubatore cella con 5% di CO 2 prima di aggiungere un reagente chimico o di un veicolo. </li><li> Preparare la soluzione chimica, per esempio Cdk1 / 2 inibitore III, un inibitore della progressione fase M 13, ad una finaleconcentrazione di 30 mM in DMSO. </li><li> Rimuovere la piastra 24 pozzetti, che contiene tutta la espianto della retina, dal termostato cella. Aggiungere 10 ml di reagente chimico o il veicolo (DMSO) direttamente al mezzo della retina, causando una concentrazione finale di 300 nM Cdk1 / 2 inibitore III 0,01% DMSO. Ruotare manualmente la piastra 24 pozzetti per consentire una distribuzione uniforme del reagente chimico o il veicolo in soluzione. </li><li> Incubare le espianti retinici a 37 ° C su un agitatore rotatore, con una velocità costante di 50 giri al minuto, all&#39;interno di un incubatore con 5% di CO 2 per il tempo desiderato (fino a 24 ore). </li><li> Passare al punto 4. </li></ol></li></ol> 4. Fissazione e congelamento di Whole retina Eexplants <ol><li> Rimuovere la piastra 24 pozzetti contenente tutta espianto della retina trattati dal termostato cella. </li><li> Utilizzare un cucchiaino di trasferire l&#39;espianto della retina di un 24-pozzetti contenenti 1 ml / pozzetto freddo ghiaccio 4% paraformaldeide in 1XPBS. Incubate in ghiaccio per 15 min. </li><li> Utilizzare un cucchiaino per trasferire l&#39;intera espianto retinica ad una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml / pozzetto 1XPBS ghiacciata per lavare la retina. Incubare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Utilizzare un cucchiaino di trasferire l&#39;intera espianto della retina ad una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml / ben ghiacciata del 30% di saccarosio in 1XPBS. Incubare in ghiaccio per 1-3 ore a seconda del giorno embrionali della retina. Per ST20 - ST25 (E3) retine, incubare per 1 ora, retine anziani hanno bisogno di tempo di incubazione più lungo in saccarosio. </li><li> Utilizzare un cucchiaino per trasferire l&#39;intero espianto retinica su una pellicola di paraffina contenente mezzo di montaggio di circa 500 microlitri criostato congelamento. Rimuovere il più saccarosio possibile spostando delicatamente l&#39;espianto della retina nel mezzo di congelamento con il cucchiaino. </li><li> Trasferire l&#39;espianto della retina di uno stampo embedding terreno contenente congelamento. Posizionare l&#39;occhio per facilitare futuro sezionamento. Mettere lo stampo embedding contenente l&#39;intero espianto della retina su dry ghiaccio finché il terreno è congelato solido. Conservare a -80 ° C. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

In questo lavoro viene presentato un protocollo dettagliato per la dissezione, elettroporazione o trattamento chimico, e la coltura di interi espianti di retina di embrioni di pollo. Questo protocollo è facile, veloce e consente sia un alto tasso di successo e riproducibile risultati. Elettroporazione di interi espianti retinici produce grandi aree di cellule che esprimono il costrutto gene di interesse. È facile posizionare correttamente gli elettrodi e di esporre una p...

La retina è parte del sistema nervoso centrale ed è, con la sua relativa semplicità e architettura cellulare ben caratterizzato, un modello popolare per lo studio dello sviluppo del sistema nervoso centrale. L&#39;occhio dell&#39;embrione di pollo è relativamente grande rispetto al resto dell&#39;embrione. E &#39;quindi facilmente accessibile in ovo per manipolazioni sperimentali, come le iniezioni o elettroporazione, e serve come un ottimo strumento per acquisire conoscenze su cellule della retina e biologia dello sviluppo in vivo. Nonostante questi importanti vantaggi, la sopravvivenza degli embrioni può essere basso quando gli esperimenti sono invasivi come ad esempio con electroporations, iniezioni ripetute o manipolazioni sperimentali combinati. Elettroporazione di plasmidi DNA nell&#39;embrione di pollo in ovo è una importante e consolidata tecnica 1. Esso consente per l&#39;etichettatura dei neuroni, tracciando del destino delle cellule, così come tratti neuronali nella NERV centroSistema di unità organizzative e permette per l&#39;espressione genica ectopica di analizzare la funzione delle proteine ​​in vivo. La tecnica è stata utilizzata per gli studi di tubo neurale 2, romboencefalo 3, 4 e della retina. Elettroporazione di retina embrionale in ovo ha qualche difficoltà sperimentali che sono legati alla situazione in vivo. La posizione dell&#39;occhio, a causa della piegatura craniale dell&#39;embrione, è relativamente vicino al cuore. Questa vicinanza aumenta il rischio di arresto cardiaco dopo l&#39;elettroporazione, e il rischio aumenta con l&#39;età dell&#39;embrione. Inoltre, per accedere l&#39;occhio, è necessario aprire le membrane embrionali, aumentando così il rischio di sanguinamento, malformazioni e conseguente ridotta vitalità. Durante il test e l&#39;ottimizzazione di un nuovo plasmide DNA spesso senza un risultato fenotipico noto, queste limitazioni possono diminuire l&#39;efficacia e la potenza del metodo anche per un sperimentalista con esperienza. Come presentato in questo protocollo, la cultura del wespianto foro retina, definito come l&#39;insieme retina neurale con dell&#39;epitelio pigmentato rimosso, è un metodo efficace che completa l&#39;approccio in ovo. Iniezioni intraoculari di reagenti chimici sono relativamente facili da eseguire in ovo. Tuttavia, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti iniettati all&#39;interno della retina neurale può essere difficile controllare completamente. Il volume iniettato può variare a causa delle perdite e il luogo esatto di iniezione può influenzare sia la distribuzione del reagente all&#39;interno dell&#39;occhio e la diffusione attraverso il corpo vitreo. La variabilità avrà importanti implicazioni per l&#39;interpretazione dei risultati, quando cioè una curva dose-risposta per un inibitore viene definito sulla; in particolare se l&#39;effetto è piccola e la finestra temporale dell&#39;effetto è stretta. Inoltre, solo un occhio può essere utilizzato da ogni embrione durante l&#39;esecuzione in esperimenti ovo a causa di potenziali effetti sistemici attraverso il flusso sanguignosul occhio controlaterale. Età matching è importante quando si studia lo sviluppo e la variabilità individuale tra trattati e degli embrioni di controllo possono portare a ulteriore variabilità sperimentale. Per queste ragioni, un ex ovo metodo basato su espianti retinici da embrioni di pollo è stato sviluppato, in cui la retina neurale può essere esposto ad una uniforme e controllato condizione sperimentale in vitro. Il presente protocollo è stato sviluppato sulla base di precedenti protocolli 5-9. Espianti di retina di fase (st) 20 (giorni embrionali [E] 3) a ST31 (E7) embrioni di pollo sono stati sezionati, colto e elettroporate con una concentrazione di DNA plasmidico definita o esposti ad un terreno contenente una concentrazione definita di un reagente chimico. Il protocollo presentato qui è stato implementato con successo in pubblicazioni recenti, utilizzando diversi reagenti chimici diversi, tra cui le autorità di regolamentazione della via danno al DNA, come KU55933, SB 218.078, e NSC 109555 Ditosylate, e il ciclo cellulare, come Cdk1 / 2 inibitore III 10,11.

<table><tbody><tr><td>1xPBS (tablet)</td><td>Life technologies</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>10x DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14080-048</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>734-0006</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l pipette tips</td><td>VWR</td><td>613-0798</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml disposable plastic cuvette</td><td>Thomas Scientific</td><td>8495V01</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D7039</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri dish</td><td>VWR</td><td>391-1998</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Solveco</td><td>1054</td><td></td></tr><tr><td>Cdk1/2 inhibitor III</td><td>217714</td><td>Calbiochem</td><td>300 nM in 0.01% DMSO</td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Forma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Electrodes</td><td></td><td></td><td>Platina, custom made</td></tr><tr><td>Electro square porator ECM 830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F12 Nutrient mix</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>AgnThos</td><td>0108-5-PS</td><td></td></tr><tr><td>Freezing medium NEG50</td><td>Cellab, Sweden</td><td>6502</td><td></td></tr><tr><td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidified incubator</td><td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td><td>8204</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>VWR</td><td>291-1214P</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way embedding mold&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6032</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PhosphoHistone 3 (PH3)&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Dilution 1/4,000</td></tr><tr><td>Platinum electrodes (custom made from &quot;rondelles&quot;)</td><td>Sargenta</td><td>390-R (rondeller)</td><td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td></tr><tr><td>Platimun electrodes&amp;nbsp;</td><td>Sonidel</td><td>CUY700P4L</td><td>Dia: 4 mm</td></tr><tr><td>Polyethylene pasteur pipette</td><td>VWR</td><td>612-2853</td><td></td></tr><tr><td>Rotator shaker</td><td>VWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr><tr><td>Small spoon</td><td>VWR</td><td>231-2151</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>443815S</td><td></td></tr><tr><td>White Leghorn eggs</td><td></td><td></td><td>Local supplier</td></tr><tr><td>Wine cooler</td><td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

La retina è un buon modello per il sistema nervoso centrale di sviluppo. Le grandi dimensioni degli occhi e, soprattutto, l&#39;accessibilità per le manipolazioni sperimentali in ovo / in vivo rende il pollo retina embrionale un modello sperimentale versatile e molto efficiente. Anche se la retina pollo è facile bersaglio in ovo da iniezioni intraoculari o elettroporazione, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti all&#39;interno della retina può essere difficile da completamente il controllo. Ciò può essere dovuto a variazioni del sito di iniezione esatta, fuoriuscita dall&#39;occhio o diffusione uniforme delle sostanze. Inoltre, la frequenza di malformazioni e mortalità dopo manipolazioni invasive come l&#39;elettroporazione è piuttosto elevato. Questo protocollo descrive un ex ovo tecnica per la coltura di espianti retinici interi da embrioni di pollo e fornisce un metodo per esposizione controllata della retina ai reagenti. Il protocol descrive come sezionare, sperimentalmente manipolare, e la cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Gli espianti possono essere coltivate per circa 24 ore ed essere sottoposti a diverse manipolazioni come elettroporazione. I principali vantaggi sono che l&#39;esperimento non dipende la sopravvivenza dell&#39;embrione e che la concentrazione del reagente introdotto può essere variata e controllata al fine di determinare e ottimizzare la concentrazione efficace. Inoltre, la tecnica è rapida, economica e, insieme con il suo alto tasso di successo sperimentale, assicura riproducibile risultati. Va sottolineato che serve come un ottimo complemento per esperimenti eseguiti in ovo.

Questo protocollo descrive la preparazione (Figura 1A-F) e coltura di espianti retinici interi da embrioni di pollo. Questo protocollo è stato usato con successo per interi espianti di retina da embrioni di ST20 (E3) a ST31 (E7). Elettroporazione di plasmidi DNA in tutto espianti di retina permette per l&#39;etichettatura e la tracciabilità delle cellule progenitrici della retina o sovra-espressione di diversi prodotti genici. Per gli esperimenti di elettroporazione, l&#39...

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Questo protocollo descrive un metodo per analizzare, sperimentalmente manipolare e cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Le culture espianto sono utili quando alto tasso di successo, l&#39;efficacia e riproducibilità sono necessari per testare gli effetti di plasmidi per elettroporazione e / o di sostanze reagenti, vale a dire, gli inibitori enzimatici.

Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K Views.  Uppsala University.  Questo protocollo descrive un metodo per analizzare, sperimentalmente manipolare e cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Le culture espianto sono utili quando alto tasso di successo, l'efficacia e riproducibilità sono necessari per testare gli effetti di plasmidi per elettroporazione e / o di sostanze reagenti, vale a dire, gli inibitori enzimatici. 

Video: Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elettroporazione Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

In Electroporations Ovo della Fase HH 10 embrioni di pollo

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biologia

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Neuroscienze

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell differentiation, axon guidance, retinotopic organization and synapse formation[1]. One drawback is the inability to efficiently and reliably manipulate gene expression in RGCs in vivo, especially in the otherwise accessible murine visual pathways. Transgenic mice can be used to manipulate gene expression, but this approach is often expensive, time consuming, and can produce unwanted side effects. In chick, in ovo electroporation is used to manipulate gene expression in RGCs for examining retina and RGC development. Although similar electroporation techniques have been developed in neonatal mouse pups[2], adult rats[3], and embryonic murine retinae in vitro[4], none of these strategies allow full characterization of RGC development and axon projections in vivo. To this end, we have developed two applications of electroporation, one in utero and the other ex vivo, to specifically target embryonic murine RGCs[5, 6]. 
With in utero retinal electroporation, we can misexpress or downregulate specific genes in RGCs and follow their axon projections through the visual pathways in vivo, allowing examination of guidance decisions at intermediate targets, such as the optic chiasm, or at target regions, such as the lateral geniculate nucleus. Perturbing gene expression in a subset of RGCs in an otherwise wild-type background facilitates an understanding of gene function throughout the retinal pathway. Additionally, we have developed a companion technique for analyzing RGC axon growth in vitro. We electroporate embryonic heads ex vivo, collect and incubate the whole retina, then prepare explants from these retinae several days later. Retinal explants can be used in a variety of in vitro assays in order to examine the response of electroporated RGC axons to guidance cues or other factors. In sum, this set of techniques enhances our ability to misexpress or downregulate genes in RGCs and should greatly aid studies examining RGC development and axon projections.

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

Here we present two techniques for manipulating gene expression in murine retinal ganglion cells (RGCs) by in utero and ex vivo electroporation. These techniques enable one to examine how alterations in gene expression affect RGC development, axon guidance, and functional properties.

In elettroporazione in vivo ed ex utero per l&#39;espressione genica in cellule gangliari della retina del mouse

The retina and its sole output neuron, the retinal ganglion cell (RGC), comprise an excellent model in which to examine biological questions such as cell ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

In elettroporazione Ovo in Retina Chick Embryonic

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elettroporazione

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

Culture arricchite di coni dalla retina degli embrioni di pollo per studiare le interazioni cellulari tra bastone e cono

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and accessibility for visualization and experimental manipulations. However, its major technical limitation had been the lack of robust loss-of-function approaches for gene function analyses. This protocol describes a methodology of gene silencing in the developing chick retina that involves transgenic expression of artificial microRNAs (miRNAs) by using the Tol2 transposon system. In this approach, a Tol2 transposon plasmid that contains an expression cassette for the EmGFP (emerald green fluorescent protein) marker and artificial pre-miRNA sequences against a target gene is introduced into the embryonic chick retina with a Tol2 transposase expression construct by in ovo electroporation. In the transfected retinal cells, the transposase catalyzes the excision of the expression cassette from the transposon vector and its integration into host chromosomes, leading to the stable expression of miRNAs and the EmGFP protein. In our previous study, we have demonstrated that the expression of Nel, a glycoprotein that exerts multiple functions in neural development, can be significantly suppressed in the developing chick retina by using this technique. Our results indicate that this methodology induces a stable and robust suppression of gene expression and thus provides an efficient loss-of-function approach for studies of retinal development.

We have developed a novel loss-of-function approach that involves the introduction and genomic integration of artificial micro-RNA sequences into chick embryos by using in ovo electroporation and the Tol2 transposon system. This technique provides a robust and stable gene knockdown methodology for studies of gene function during development.

Approccio alla perdita di funzione nella retina embrionale del pulcino utilizzando l'espressione transgenica mediata dal trasposone Tol2 di microRNA artificiali

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

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Trasferimento efficiente Gene in Chick retine per cellulari primarie Cultura Studies: An