The work was supported by Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), &#246;gonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsn&#228;mnd f&#246;r synskadade, Synfr&#228;mjandets forskningsfond and St Eriks &#246;gonsjukhus forskningsstipendier.

Questo protocollo è eseguita in conformità con le raccomandazioni nella &quot;Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio dell&#39;Associazione per la ricerca in visione e oculistica&quot;. 1. Manipolazione Uovo e la raccolta degli occhi <ol><li> Conservare le uova bianche Livorno a 12-14 ° C per non più di 1 settimana. Se disponibile, utilizzare un dispositivo di raffreddamento di vino refrigerato per conservare le uova fecondate. Nota: temperatura del serbatoio più elevate portano ad uno sviluppo anormale di embrioni, mentre temperature più basse aumentano la mortalità. Tempo di conservazione estesa aumenta sia la mortalità e lo sviluppo anormale. </li><li> Incubare le uova in un 37,5 ° C e 60% uovo incubatore umidificato con leggera oscillazione ad una frequenza di 5 volte per 24 ore. </li><li> Rimuovere le uova incubate dal termostato uovo all&#39;età embrionale desiderato. Nota: L&#39;età dell&#39;embrione di pollo è determinato come il tempo di incubazione e viene indicato come giorno embrionale (E) o come fasi (st), Secondo la serie di stadi di sviluppo descritti da Hamburger e Hamilton 12. </li><li> Collocare le uova selezionati nella cappa a flusso laminare. Pulire il guscio d&#39;uovo con il 70% di etanolo per evitare la contaminazione di un embrione. Nota: Condurre tutte le procedure in condizioni asettiche con soluzioni sterili <url> http://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory&quot;lutions </url> e strumenti. </li><li> Toccare il lato dell&#39;uovo saldamente contro una superficie dura per crack aprire l&#39;uovo. Posizionare il contenuto in una capsula di Petri 100 mm. Utilizzare un cucchiaino per trasferire l&#39;embrione di un piatto Petri 35 mm contenente pre-riscaldato (37 ° C) PBS 1x per evitare che il tessuto si secchi. </li><li> Porre la capsula di Petri 35 millimetri contenente il tessuto embrionale su un microscopio da dissezione stereovisione binocolo nella cappa a flusso laminare. Decapitare il embrione stringendo al collo con una pinza sottile e scartare il corpo. </li><li> Utilizzare una pinza sottile per fare un&#39;incisione °ruvida la bocca, ventrali per l&#39;occhio. Partendo dalla sede dell&#39;incisione, lacerare il tessuto che circonda l&#39;intero occhio. Pinch off il nervo ottico e rimuovere l&#39;occhio intatto dalla cavità oculare. Raccogliere sia l&#39;occhio destro e sinistro dello stesso embrione per uso come sia il controllo o l&#39;occhio trattato. </li><li> Utilizzare un cucchiaino per trasferire gli occhi ad una nuova piastra di Petri 35 mm contenente pre-riscaldato (37 ° C) PBS 1x. </li></ol> 2. Preparazione di intere retina Espianti <ol><li> Utilizzare una pinza sottile per rimuovere tutto il tessuto intorno all&#39;occhio compreso il anlage sclerale. Nota: Il tessuto si stacca facilmente lasciando la retina sul corpo vitreo e lente con dell&#39;epitelio pigmentato intatto (Figura 1A-B). </li><li> Utilizzare una pinza sottile per pizzicare una piccola incisione nel dell&#39;epitelio pigmentato nella parte dorsale della occhio senza danneggiare la retina neurale (Figura 1C). </li><li> Utilizzare una pinza sottile per strappare delicatamente aprire la starti epitelio pigmentatong al sito di incisione, lasciando la lente e l&#39;intera retina attaccata al corpo vitreo (Figura 1D). Mantenere l&#39;occhio in acqua calda (37 ° C) PBS 1x per facilitare la rimozione dell&#39;epitelio pigmentato. Nota: Il dell&#39;epitelio pigmentato può essere difficile da rimuovere, in particolare lungo il corpo ciliare intorno alla pupilla, nella regione anteriore dell&#39;occhio, e lungo la fessura coroide. Pertanto, alcuni dell&#39;epitelio pigmentato può essere lasciato sulla retina neurale (Figura 1E-F). </li></ol> 3. Trattamento di interi retina Espianti <ol start="1"><li> Elettroporazione di intere espianti di retina Nota: elettroporazione di intere espianti di retina può avvenire direttamente dopo la fase 2. <ol><li> Preparare terreno di coltura contenente 1: 1 DMEM: F12 mix di nutrienti, il 10% FBS, 10 U / ml di penicillina streptomicina, 5 mg / ml di insulina, e 2 mM L-glutammina. </li><li> Tagliare un 1,5 ml monouso provetta in plastica (12,5 millimetri x 12,5 millimetri x 45 mm) (o qualsiasi piccolo contenitore in grado di contenere soluzione 300-400 microlitri) di circa 8 mm dal fondo con una sega fine-lama. </li><li> Diluire il DNA plasmidico di scelta in 1xDPBS ad una concentrazione finale di 0,1 mg / mL. </li><li> Accendere i parametri elettroporatore e impostati a 15 V per ST20 - ST25 (E3-E4) retina e 20 V per ST26 - ST27 (E5) retina. Impostare il polso si ripete a 5 impulsi di 50 msec impulso di lunghezza, con intervalli di 1 sec. Utilizzare un generatore di impulsi che può essere controllato da un pedale sul pavimento come saranno necessarie entrambe le mani per tenere gli elettrodi in posizione. </li><li> Collegare due paddle forma (piatta, diametro circolare. 4 mm) elettrodi di platino (Figura 2A) alla presa di uscita sul generatore di impulsi. Nota: Gli elettrodi di platino utilizzati in questo protocollo sono state effettuate dal laboratorio dell&#39;università. Gli elettrodi sono state fatte dalla piastra platino 0,1 millimetri &quot;rondelle&quot; (grado di platino: 950 Pt / 5 Cu). Il collegamento wi 0,8 millimetrire è stato isolato tramite tubi di plastica. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;intero espianto della retina dal punto 2.3 alla cuvetta (o piccolo contenitore equivalente) con un polietilene pipetta Pasteur con la punta tagliata di acquisire la giusta dimensione punta-apertura per l&#39;espianto della retina. Evitare l&#39;uso di punte per pipette come la retina tende a collegare alla plastica e lacerare. </li><li> Utilizzare una pipetta 100 microlitri per rimuovere delicatamente l&#39;intero 1x PBS che circonda la retina espianto facendo attenzione a non toccare la retina per evitare di strappare. </li><li> Aggiungere la soluzione plasmide 100 microlitri alla cuvetta per coprire l&#39;intera espianto della retina. Premere con cautela il espianto della retina con una pinza se galleggia verso l&#39;alto. Usare pinze o elettrodi di posizionare l&#39;obiettivo di affrontare qualsiasi lato della cuvetta e il nervo ottico al fondo della cuvetta. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo positivo di fronte alla lente e l&#39;elettrodo negativo dietro la retina (Figura 2A), senza toccare il tessuto. </li><li>Applicare la corrente premendo il pedale. Verificare la presenza di bolle agli elettrodi che indica scarico di successo. </li><li> Utilizzare una pipetta 100 microlitri per rimuovere tutto il mix plasmide dalla cuvetta senza danneggiare la retina. La miscela plasmide può essere riutilizzato tre a cinque volte. </li><li> Riempire la cuvetta con pre-riscaldato (37 ° C) PBS 1x. Utilizzare pinze per staccare delicatamente l&#39;espianto della retina dalla parete della provetta. Dopo elettroporazione retina è talvolta coperto di bolle, che fa aderire alla parete della provetta. </li><li> Utilizzare la pipetta Pasteur polietilene per trasferire l&#39;intera espianto retina in una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) di coltura per pozzetto. Incubare un espianto di retina per pozzetto. </li><li> Incubare la espianto retinica a 37 ° C su un agitatore rotatore, con una velocità costante di 50 giri al minuto, in un incubatore cella con 5% di CO 2 per 24 ore. La rotazione è quello di garantire la massima esposizione al mezzo e Prevent adesione della retina al fondo della piastra da 24 pozzetti. </li><li> Passare al punto 4. </li></ol></li><li> Trattamento di interi espianti retinici con reagenti chimici Nota: il trattamento chimico di intere espianti di retina può avvenire direttamente dopo la fase 2. <ol><li> Preparare terreno di coltura contenente 1: 1 DMEM: F12 mix di nutrienti, il 10% FBS, 10 U / ml di penicillina streptomicina, 5 mg / ml di insulina, e 2 mM L-glutammina. </li><li> Utilizzare un cucchiaino per trasferire l&#39;espianto retina dal punto 2.3 in una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml preriscaldate (37 ° C) terreno di coltura per pozzetto. Incubare un espianto di retina per pozzetto. </li><li> Incubare tutta espianto retina per 60 min a 37 ° C su un agitatore rotatore, con una velocità costante di 50 giri al minuto, in un incubatore cella con 5% di CO 2 prima di aggiungere un reagente chimico o di un veicolo. </li><li> Preparare la soluzione chimica, per esempio Cdk1 / 2 inibitore III, un inibitore della progressione fase M 13, ad una finaleconcentrazione di 30 mM in DMSO. </li><li> Rimuovere la piastra 24 pozzetti, che contiene tutta la espianto della retina, dal termostato cella. Aggiungere 10 ml di reagente chimico o il veicolo (DMSO) direttamente al mezzo della retina, causando una concentrazione finale di 300 nM Cdk1 / 2 inibitore III 0,01% DMSO. Ruotare manualmente la piastra 24 pozzetti per consentire una distribuzione uniforme del reagente chimico o il veicolo in soluzione. </li><li> Incubare le espianti retinici a 37 ° C su un agitatore rotatore, con una velocità costante di 50 giri al minuto, all&#39;interno di un incubatore con 5% di CO 2 per il tempo desiderato (fino a 24 ore). </li><li> Passare al punto 4. </li></ol></li></ol> 4. Fissazione e congelamento di Whole retina Eexplants <ol><li> Rimuovere la piastra 24 pozzetti contenente tutta espianto della retina trattati dal termostato cella. </li><li> Utilizzare un cucchiaino di trasferire l&#39;espianto della retina di un 24-pozzetti contenenti 1 ml / pozzetto freddo ghiaccio 4% paraformaldeide in 1XPBS. Incubate in ghiaccio per 15 min. </li><li> Utilizzare un cucchiaino per trasferire l&#39;intera espianto retinica ad una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml / pozzetto 1XPBS ghiacciata per lavare la retina. Incubare in ghiaccio per 10 minuti. </li><li> Utilizzare un cucchiaino di trasferire l&#39;intera espianto della retina ad una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml / ben ghiacciata del 30% di saccarosio in 1XPBS. Incubare in ghiaccio per 1-3 ore a seconda del giorno embrionali della retina. Per ST20 - ST25 (E3) retine, incubare per 1 ora, retine anziani hanno bisogno di tempo di incubazione più lungo in saccarosio. </li><li> Utilizzare un cucchiaino per trasferire l&#39;intero espianto retinica su una pellicola di paraffina contenente mezzo di montaggio di circa 500 microlitri criostato congelamento. Rimuovere il più saccarosio possibile spostando delicatamente l&#39;espianto della retina nel mezzo di congelamento con il cucchiaino. </li><li> Trasferire l&#39;espianto della retina di uno stampo embedding terreno contenente congelamento. Posizionare l&#39;occhio per facilitare futuro sezionamento. Mettere lo stampo embedding contenente l&#39;intero espianto della retina su dry ghiaccio finché il terreno è congelato solido. Conservare a -80 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo.">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem Biophys Res Commu. 230, 376-380 (1997).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Method. 24, 43-48 (2001).</li><li>Kohl, A., Hadas, Y., Klar, A., Sela-Donenfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+patterns+and+targets+of+dA1+interneurons+in+the+chick+hindbrain.">Axonal patterns and targets of dA1 interneurons in the chick hindbrain.</a> J Neurosc. 32, 5757-5771 (2012).</li><li>Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+embryonic+chick+retina.">In ovo electroporation in embryonic chick retina.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Sparrow, J. R., Hicks, D., Barnstable, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+commitment+and+differentiation+in+explants+of+embryonic+rat+neural+retina.+Comparison+with+the+developmental+potential+of+dissociated+retina.">Cell commitment and differentiation in explants of embryonic rat neural retina. Comparison with the developmental potential of dissociated retina.</a> Brain res Dev brain re. 51, 69-84 (1990).</li><li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+hairy+and+Enhancer+of+split+homolog+1+regulates+differentiation+of+retinal+neurons+and+is+essential+for+eye+morphogenesis.">Mammalian hairy and Enhancer of split homolog 1 regulates differentiation of retinal neurons and is essential for eye morphogenesis.</a> Neuro. 16, 723-734 (1996).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro.">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Nat Acad Sci US. 101, 16-22 (2004).</li><li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures.">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nature protocol. 1, 2710-2718 (2006).</li><li>Thangaraj, G., Greif, A., Layer, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+explant+culture+of+the+embryonic+chicken+retina+with+long-term+preservation+of+photoreceptors.">Simple explant culture of the embryonic chicken retina with long-term preservation of photoreceptors.</a> Exp eye re. 93, 556-564 (2011).</li><li>Shirazi Fard, S., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heterogenic+final+cell+cycle+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+regulated+by+the+DNA+damage+response+pathway.">The heterogenic final cell cycle of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not regulated by the DNA damage response pathway.</a> Cell Cycl. 13, 408-417 (2014).</li><li>Shirazi Fard, S., Thyselius, M., All-Ericsson, C., Hallbook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+basal+mitosis+of+chicken+retinal+Lim1+horizontal+cells+is+not+sensitive+to+cisplatin-induced+cell+cycle+arrest.">The terminal basal mitosis of chicken retinal Lim1 horizontal cells is not sensitive to cisplatin-induced cell cycle arrest.</a> Cell Cycl. 13, 3698-3706 (2014).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li><li>Gavet, O., Pines, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+cyclin+B1-Cdk1+synchronizes+events+in+the+nucleus+and+the+cytoplasm+at+mitosis.">Activation of cyclin B1-Cdk1 synchronizes events in the nucleus and the cytoplasm at mitosis.</a> J Cell Bio. 189, 247-259 (2010).</li><li>Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+in+the+neural+tube.">Mitosis in the neural tube.</a> J Comp Neurol. 62, 377-405 (1935).</li><li>Baye, L. M., Link, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interkinetic+nuclear+migration+and+the+selection+of+neurogenic+cell+divisions+during+vertebrate+retinogenesis.">Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis.</a> J Neurosc. 27, 10143-10152 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

In questo lavoro viene presentato un protocollo dettagliato per la dissezione, elettroporazione o trattamento chimico, e la coltura di interi espianti di retina di embrioni di pollo. Questo protocollo è facile, veloce e consente sia un alto tasso di successo e riproducibile risultati. Elettroporazione di interi espianti retinici produce grandi aree di cellule che esprimono il costrutto gene di interesse. È facile posizionare correttamente gli elettrodi e di esporre una p...

La retina è parte del sistema nervoso centrale ed è, con la sua relativa semplicità e architettura cellulare ben caratterizzato, un modello popolare per lo studio dello sviluppo del sistema nervoso centrale. L&#39;occhio dell&#39;embrione di pollo è relativamente grande rispetto al resto dell&#39;embrione. E &#39;quindi facilmente accessibile in ovo per manipolazioni sperimentali, come le iniezioni o elettroporazione, e serve come un ottimo strumento per acquisire conoscenze su cellule della retina e biologia dello sviluppo in vivo. Nonostante questi importanti vantaggi, la sopravvivenza degli embrioni può essere basso quando gli esperimenti sono invasivi come ad esempio con electroporations, iniezioni ripetute o manipolazioni sperimentali combinati. Elettroporazione di plasmidi DNA nell&#39;embrione di pollo in ovo è una importante e consolidata tecnica 1. Esso consente per l&#39;etichettatura dei neuroni, tracciando del destino delle cellule, così come tratti neuronali nella NERV centroSistema di unità organizzative e permette per l&#39;espressione genica ectopica di analizzare la funzione delle proteine ​​in vivo. La tecnica è stata utilizzata per gli studi di tubo neurale 2, romboencefalo 3, 4 e della retina. Elettroporazione di retina embrionale in ovo ha qualche difficoltà sperimentali che sono legati alla situazione in vivo. La posizione dell&#39;occhio, a causa della piegatura craniale dell&#39;embrione, è relativamente vicino al cuore. Questa vicinanza aumenta il rischio di arresto cardiaco dopo l&#39;elettroporazione, e il rischio aumenta con l&#39;età dell&#39;embrione. Inoltre, per accedere l&#39;occhio, è necessario aprire le membrane embrionali, aumentando così il rischio di sanguinamento, malformazioni e conseguente ridotta vitalità. Durante il test e l&#39;ottimizzazione di un nuovo plasmide DNA spesso senza un risultato fenotipico noto, queste limitazioni possono diminuire l&#39;efficacia e la potenza del metodo anche per un sperimentalista con esperienza. Come presentato in questo protocollo, la cultura del wespianto foro retina, definito come l&#39;insieme retina neurale con dell&#39;epitelio pigmentato rimosso, è un metodo efficace che completa l&#39;approccio in ovo. Iniezioni intraoculari di reagenti chimici sono relativamente facili da eseguire in ovo. Tuttavia, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti iniettati all&#39;interno della retina neurale può essere difficile controllare completamente. Il volume iniettato può variare a causa delle perdite e il luogo esatto di iniezione può influenzare sia la distribuzione del reagente all&#39;interno dell&#39;occhio e la diffusione attraverso il corpo vitreo. La variabilità avrà importanti implicazioni per l&#39;interpretazione dei risultati, quando cioè una curva dose-risposta per un inibitore viene definito sulla; in particolare se l&#39;effetto è piccola e la finestra temporale dell&#39;effetto è stretta. Inoltre, solo un occhio può essere utilizzato da ogni embrione durante l&#39;esecuzione in esperimenti ovo a causa di potenziali effetti sistemici attraverso il flusso sanguignosul occhio controlaterale. Età matching è importante quando si studia lo sviluppo e la variabilità individuale tra trattati e degli embrioni di controllo possono portare a ulteriore variabilità sperimentale. Per queste ragioni, un ex ovo metodo basato su espianti retinici da embrioni di pollo è stato sviluppato, in cui la retina neurale può essere esposto ad una uniforme e controllato condizione sperimentale in vitro. Il presente protocollo è stato sviluppato sulla base di precedenti protocolli 5-9. Espianti di retina di fase (st) 20 (giorni embrionali [E] 3) a ST31 (E7) embrioni di pollo sono stati sezionati, colto e elettroporate con una concentrazione di DNA plasmidico definita o esposti ad un terreno contenente una concentrazione definita di un reagente chimico. Il protocollo presentato qui è stato implementato con successo in pubblicazioni recenti, utilizzando diversi reagenti chimici diversi, tra cui le autorità di regolamentazione della via danno al DNA, come KU55933, SB 218.078, e NSC 109555 Ditosylate, e il ciclo cellulare, come Cdk1 / 2 inibitore III 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="859">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1xPBS (tablet)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>18912-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10xDPBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14080-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>734-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>613-0798</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL disposable plastic cuvette</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8495V01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D7039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>391-1998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/2 inhibitor III</td>
			<td>217714</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>300nM in 0.01% DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Forma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrodes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Platina, custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro square porator ECM 830</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31331-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>0108-5-PS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium NEG50</td>
			<td>Cellab, Sweden</td>
			<td>6502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP expressing DNA plasmid (pZGs)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified incubator</td>
			<td>Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germany</td>
			<td>8204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I9278-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium ProLong Gold with DAPI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36935</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin film</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1214P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>16005-1KG-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Way embedding mold&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhosphoHistone 3 (PH3)&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>06-570</td>
			<td>Dilution 1/4000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes (custom made from &#34;rondelles&#34;)</td>
			<td>Sargenta</td>
			<td>390-R (rondeller)</td>
			<td>Dia: 4mm, 0.1 mm thickness</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platimun electrodes&#160;</td>
			<td>Sonidel</td>
			<td>CUY700P4L</td>
			<td>Dia: 4 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene pasteur pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>612-2853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-2900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small spoon</td>
			<td>VWR</td>
			<td>231-2151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>443815S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White Leghorn eggs</td>
			<td></td>
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			<td>Local supplier</td>
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			<td>Wine cooler</td>
			<td>WineMaster 24, Caso, Berlin Germany</td>
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whole retinal explants from chicken embryos for electroporation and chemical reagent treatments

La retina è un buon modello per il sistema nervoso centrale di sviluppo. Le grandi dimensioni degli occhi e, soprattutto, l&#39;accessibilità per le manipolazioni sperimentali in ovo / in vivo rende il pollo retina embrionale un modello sperimentale versatile e molto efficiente. Anche se la retina pollo è facile bersaglio in ovo da iniezioni intraoculari o elettroporazione, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti all&#39;interno della retina può essere difficile da completamente il controllo. Ciò può essere dovuto a variazioni del sito di iniezione esatta, fuoriuscita dall&#39;occhio o diffusione uniforme delle sostanze. Inoltre, la frequenza di malformazioni e mortalità dopo manipolazioni invasive come l&#39;elettroporazione è piuttosto elevato. Questo protocollo descrive un ex ovo tecnica per la coltura di espianti retinici interi da embrioni di pollo e fornisce un metodo per esposizione controllata della retina ai reagenti. Il protocol descrive come sezionare, sperimentalmente manipolare, e la cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Gli espianti possono essere coltivate per circa 24 ore ed essere sottoposti a diverse manipolazioni come elettroporazione. I principali vantaggi sono che l&#39;esperimento non dipende la sopravvivenza dell&#39;embrione e che la concentrazione del reagente introdotto può essere variata e controllata al fine di determinare e ottimizzare la concentrazione efficace. Inoltre, la tecnica è rapida, economica e, insieme con il suo alto tasso di successo sperimentale, assicura riproducibile risultati. Va sottolineato che serve come un ottimo complemento per esperimenti eseguiti in ovo.

Questo protocollo descrive la preparazione (Figura 1A-F) e coltura di espianti retinici interi da embrioni di pollo. Questo protocollo è stato usato con successo per interi espianti di retina da embrioni di ST20 (E3) a ST31 (E7). Elettroporazione di plasmidi DNA in tutto espianti di retina permette per l&#39;etichettatura e la tracciabilità delle cellule progenitrici della retina o sovra-espressione di diversi prodotti genici. Per gli esperimenti di elettroporazione, l&#39...

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Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Questo protocollo descrive un metodo per analizzare, sperimentalmente manipolare e cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Le culture espianto sono utili quando alto tasso di successo, l&#39;efficacia e riproducibilità sono necessari per testare gli effetti di plasmidi per elettroporazione e / o di sostanze reagenti, vale a dire, gli inibitori enzimatici.

Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.4K Views.  Uppsala University.  Questo protocollo descrive un metodo per analizzare, sperimentalmente manipolare e cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Le culture espianto sono utili quando alto tasso di successo, l'efficacia e riproducibilità sono necessari per testare gli effetti di plasmidi per elettroporazione e / o di sostanze reagenti, vale a dire, gli inibitori enzimatici. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, fluid and nutrient supply). Consequently both the nervous and vascular systems develop alongside each other and share striking similarities in their branching architecture. Here we report embryonic manipulations that allow us to study the simultaneous development of neural crest-derived nervous tissue (in this case the enteric nervous system), and the vascular system. This is achieved by generating chicken chimeras via transplantation of discrete segments of the neural tube, and associated neural crest, combined with vascular DiI injection in the same embryo. Our method uses transgenic chickGFP embryos for intraspecies grafting, making the transplant technique more powerful than the classical quail-chick interspecies grafting protocol used with great effect since the 1970s. ChickGFP-chick intraspecies grafting facilitates imaging of transplanted cells and their projections in intact tissues, and eliminates any potential bias in cell development linked to species differences. This method takes full advantage of the ease of access of the avian embryo (compared with other vertebrate embryos) to study the co-development of the enteric nervous system and the vascular system.

Dual Labeling of Neural Crest Cells and Blood Vessels Within Chicken Embryos Using ChickGFP Neural Tube Grafting and Carbocyanine Dye DiI Injection

Here we report dual labeling of neural crest cells and blood vessels using chickGFP neural tube intraspecies grafting combined with intra-vascular DiI injection. This experimental technique allows us to simultaneously visualize and study development of the NCC-derived (enteric) nervous system and the vascular system, during organogenesis.

Doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni all'interno degli embrioni di pollo utilizzando l'innesto del tubo neuraleGFP del pulcino e l'iniezione di colorante carbocianina

All developing organs need to be connected to both the nervous system (for sensory and motor control) as well as the vascular system (for gas exchange, ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

Espressione rapida ed efficiente di più proteine negli embrioni aviari utilizzando l'elettroporazione dell'mRNA

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Isolation and Differentiation of Primary Myoblasts from Mouse Skeletal Muscle Explants

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to differentiate into later stages of muscle development. The protocol provided here describes a robust method for the isolation and culture of a highly proliferative population of myoblast cells from young adult mouse skeletal muscle explants. These cells are useful for the study of the metabolic properties of skeletal muscle of different mouse models, as well as in other downstream applications such as transfection with exogenous DNA or transduction with viral expression vectors. The level of differentiation and metabolic profile of these cells depends on the length of exposure, and composition of the media used to induce myoblast differentiation. These methods provide a robust system for the study of mouse muscle cell metabolism ex vivo. Importantly, unlike in vivo models, the methods described here provide a cell population that can be expanded and studied with high levels of reproducibility.

Myoblasts are proliferating precursor cells that differentiate to form polynucleated myotubes and eventually skeletal muscle myofibers. Here, we present a protocol for efficient isolation and culture of primary myoblasts from young adult mouse skeletal muscles. The method enables molecular, genetic, and metabolic studies of muscle cells in culture.

Isolamento e differenziazione dei mioblasti primari dagli esopanti muscolari scheletrici del topo

Primary myoblasts are undifferentiated proliferating precursors of skeletal muscle. They can be cultured and studied as muscle precursors or induced to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...