Name: isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres
Uploaded: 2016-02-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres at JoVE.com

The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

WT CF株のゼブラフィッシュは、イェール大学施設内動物管理使用委員会（IACUCプロトコル番号2012から11473）によって承認されたプロトコルに従って上昇し、維持しました。全ての実験は、最初の研究目的のための動物の使用に関する遺体を規制するすべての関連する政府や機関の倫理によって承認されなければなりません。 1.準備<ol><li>解剖培地10mlを準備し、DMEM / F12の9.8ミリリットルに100×ペニシリン - ストレプトマイシンの200μlを添加します。 </li><li> L-システイン溶液を調製する：組織培養のための水10ミリリットルに、L-システイン120mgのを追加します。 2週間まで4℃でL-システインソリューションを保存し、または1年まで-20℃でアリコートインチ</li><li>組織培養のための水の1ミリリットルに、DNアーゼIのショップまで2ヶ月間4℃でのDNase I溶液10mgを追加：DNアーゼI溶液を準備します。 </li><li>パパイン溶液を調製する：パパインsolutを準備しますイオンは、DMEM / F12の5ミリリットルに100μlのパパイン（約140台）、100μlのDNアーゼI（1％）と200μlのL-システイン（12 mg / mlで）を追加します。新たにパパイン溶液を毎回調製し、使用前に0.22μmの孔サイズのフィルターを用いて滅菌します。 </li><li>洗浄溶液を調製：93.85 mlのDPBS 1Xに650μlのグルコースを45％、500μLのHEPES、1M、5mlのFBSを追加し、洗浄溶液100mLを調製しました。使用前に0.22μmの孔径のフィルターを有する洗浄溶液を滅菌します。最大2ヶ月間4℃で洗浄液を保管してください。 </li><li>インスリン溶液を調製する：組織培養用の水2mlに10 N NaOHおよび100mgのインスリンの25μlの液滴を追加し、インスリン溶液2mlを調製します。 </li><li> EGFとFGF溶液を調製する：100μg/ mlの濃度でDMEM / F12の両方でマイトジェンを溶かします。 -20℃で10μlのアリコートとして保管してください。 </li><li> 500μlの、1mlのアリコートとして-20℃で保存のB-27およびN-2は、サプリメント、respectiv：B-27、N-2メディアを準備しますエリー。 </li><li> Z-分化条件培地を準備します、Z-分化条件培地の100ミリリットルを準備40μlのインスリン（50 mg / mlで）、500μlのB-27、1ミリリットルN-2、650μlのグルコース45％および1ミリリットルのを追加しますDMEM / F12の97.81ミリリットルに100×ペニシリン - ストレプトマイシン。使用前に、0.22μmの孔サイズのフィルタを有するZ-分化条件培地を滅菌します。 1週間まで4℃でZ-分化状態媒体を保管してください。 </li><li> Z-条件培地を準備します、Z-条件培地の50ミリリットルを準備滅菌Z-分化条件培地の50ミリリットル（20 ngの/ ml）の中にEGFを10μlとFGFの10μlを添加します。 1週間まで4℃でZ-条件媒体に保管してください。 </li><li> 5ミリリットル外塗布液に、DMEM / F12の4.9ミリリットルに細胞外マトリックス溶液（ 例えば 、マトリゲル。）の100μlを添加する：分化培養用の塗布液を準備します。氷の上で4℃で細胞外マトリックス溶液を解凍します。一度解凍し、uのために4℃で維持2週間のp。 </li></ol>大人のゼブラフィッシュの脳の2解剖<ol><li>ゲルアイスパック100ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿を充填することにより解剖ベッドを準備します。その後、シャーレに蓋を置き、ゲルがフリーズするまで、-20℃でインキュベートします。蓋の場所の上にきれいなろ紙の正方形とプラスチックフィルムで濾紙とシャーレの両方をラップします。 </li><li>清潔で、各使用前に70％エタノールまたは熱により、すべての顕微解剖器具を滅菌します。解剖顕微鏡の近くにすべて滅菌解剖器具を置き、右安楽死の前に、光ファイバ照明で顕微鏡下で解剖ベッドを配置します。 </li><li>全脳の神経球の調製のための2大人のゼブラフィッシュを収集。 3〜4ゼブラフィッシュは、解剖脳領域からのニューロスフェアを生成します。 </li><li>施設内動物管理使用委員会により承認されたプロトコルを使用して、大人のゼブラフィッシュ（8-12カ月齢）を安楽死させます。次に、7で魚を浸しますすぐに5％5-10秒間エタノールおよび外科刃を用いて鰓のレベルで断頭続い解剖ベッドに置きます。 <ol><li>動物を安楽死させるために、動物のハートビートが徐々に遅くなり、循環が停止するまでトリカインメタンスルホン酸の過剰摂取（300ミリグラム/ L）を投与し、その後、氷水に浸します。 </li></ol></li><li>ダウンヘッドの背側を回して、ハサミを使って口にカット側から長手方向のカットをします。鉗子を使用すると、頭蓋底を露出させ、隣接するすべての組織を除去します。蓋に向かって脊髄の先頭から頭蓋骨の横方向の壁をカットします。 </li><li>はさみを使用して、視神経を切断して除去した後、蓋のレベルで頭蓋骨の最も外側部の​​両側を削除します。頭部腹側を上に回します。鉗子を使用して、頭蓋骨の最も先端部の残りの部分をはがします。 </li><li>新しい皿のwiに頭蓋骨の残りの部分で脳に沿って転送します解剖培地（1.1）番目。すべてそのまま脳構造を維持し、マイクロナイフのプラスチック製のハンドルを使用して、解剖培地中の脳組織を清掃してください。 </li><li>この点から、全体のゼブラフィッシュの脳を使用してプロトコルを続けます。 <ol><li>あるいは、新鮮なメスで切開し、全体のゼブラフィッシュの脳から、または終脳、蓋/間脳や小脳からのニューロスフェアを生成するために、特定の脳領域に、このプロトコルを適応させます。 図3および参照11によれば、関心の脳領域を分析するために、神経特異的な蛍光ゼブラフィッシュの神経トランスジェニック系統を使用してください。 </li></ol></li></ol>成人の脳の3単一細胞解離<ol><li>生物学的安全キャビネット内の後続のすべての作業を実行します。解剖培地800μlのを含む1.5 mlチューブに脳組織を転送する（ステップ1.1で調製しました）。脳組織に触れることなく、ピペットで解剖媒体を削除します。 </li><li>パパイン溶液（ステップ1.4）の500μlを添加して、10分間37℃で脳組織を消化。それは、細胞生存率を減少させることができたとして、15分以上インキュベートしないでください。 </li><li>インキュベーション後、下から〜0.25インチ1,000μlのピペットチップカットを使用して、15ミリリットルコニカルチューブにパパイン溶液500μlで脳組織を移します。静かにゆっくりと同じチップで上下に10回ピペッティングすることにより脳組織を解離します。アップピペットと15倍以上ダウンし、それが細胞の生存率を変化させる可能性があるので、このステップの間に空気の泡を生成しませんしないでください。 </li><li>ノーカット千μlの定期的なチップを用いてダウン10-13回ピペッティングし、続いて37℃で10分間、再び脳組織をインキュベートします。アップピペットと15回以上ダウンし、細胞死を回避するためにしないでください。 </li><li>室温で5分間（RT）、800×gで洗浄液（ステップ1.5）、遠心2mlの細胞懸濁液を添加することにより酵素消化を停止します。慎重秒をデカントupernatant 1,000μlの定期的な先端でピペッティングすることによっておよびダウン激しく指で、次いでチューブをタップして、残りの溶液中にペレットを再懸濁。次に、洗浄液の2ミリリットルを追加します。 </li><li>この段階では、単一細胞懸濁液が得られたことを顕微​​鏡で確認してください。室温で5分間、800×gで再び細胞懸濁液を遠心します。上清を除去し、新鮮なZ-条件培地（ステップ1.10）の1ミリリットルを使用してペレットを再懸濁。 </li><li>トリパンブルー12とを用いて、染色細胞は青色の死細胞を除くことにより、血球計数器を使用して生細胞を数えます。各ウェルに200μlの細胞懸濁液と新鮮なZ-条件培地300μlで24ウェルプレートを準備します。 〜500細胞/μlの密度でシード細胞。ゼブラフィッシュ脳由来のニューロスフェアは、37℃でよく成長しないので、5％CO 2で30℃のインキュベーターで培養した細胞を維持します。 </li></ol>一次ニューロスフェアの4世代&lt;/ P&gt; <ol><li> in vitroでの 1日（DIV1）した後、顕微鏡下で成人の全脳から得られた単一細胞懸濁液を観察し、破片がウェルの中心部に蓄積されたかどうかに注意してください。慎重に（可能な場合はそれ以下）の媒体のおよそ100μLをピペットで任意の破片を除去します。次に、新鮮なZ-条件培地100μlを追加します。単一細胞懸濁液は、この時点（ 図2A DIV1）で観察されるはずです。 </li><li> in vitroでの 2日間（DIV2）の後、培養細胞を展開します。先端カット1,000μlのピペットを使用して、収集し、よく新しいに各ウェルからの細胞懸濁液の250μlのを転送します。すべてのウェルに新鮮なZ-条件培地250μlのを追加します。培養細胞を拡大する前に、よく全体に上下にピペッティングすることにより、非常に穏やかな懸濁液を均質化します。 </li><li>繰り返しは、 インビトロで 、次の4日間（DIV4）のための4.1と4.2を繰り返します。ニューロスフェアの大きさの漸進的増加は、viのでなければなりませんDIV3及びDIV4（ 図2BおよびC）を中心とウェルの縁部でsible。 注：一次ニューロスフェアは、通路または多分化を評価するための分化のために処理することができます。あるいは、それらは、分化プロセス中の特定の遺伝子の役割を特徴付けるためにヌクレオまたはリポフェクション11のために処理することができます。 </li></ol>一次ニューロスフェアの5継代<ol><li>各ウェルからの組織培養の250μlのを削除し、機械的に1ミリリットルピペットでDIV4のニューロスフェアを解離します。気泡形成が細胞死を増加させ得るような、あまりにも急速に上下にピペットとしないでください。 </li><li>血球計数器で細胞をカウントし、24ウェルプレートの各ウェルに初代培養上清250μlの中に800細胞/μLを配布します。 </li><li>各ウェルにZ-条件培地250μlのを追加します。 </li><li>ステップ4.2で報告されているように、in vitroで 2日（DIV2）の後、培養細胞を拡大D 4.3。 </li></ol>一次ニューロスフェアの6分化<ol><li> 12ウェルプレートの各ウェルにそれらを配置することにより、室温で乾燥したカバーガラスその後、10分間、70％エタノールに浸してカバーガラスを滅菌します。 </li><li>それは広く拡大し、全体のカバーガラスを覆うことができるようにカバーガラスの中央に細胞外コーティング液（ステップ1.11）の300μLを加えます。そして、（加湿細胞培養インキュベーターを使用して）1時間37℃でインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、細胞外のコーティング溶液を除去し、37℃で2時間、カバーガラスを乾燥させます。 </li><li>各ウェルからの組織培養の250μlのを削除します。機械的に上下にピペッティングにより（より広いエンドチップ付き）1ミリリットルピペットでウェル当たりすべてDIV4の一次ニューロスフェアを解離。 </li><li>種子は、（先に調製した細胞外マトリックスでコーティングしたカバーガラス上に4×10 3細胞/ mlの細胞密度でステップ6.1から6のニューロスフィア細胞懸濁液を解離しました。3）基板に付着するまで、5％CO 2中、30℃で、少なくとも30分間保ちます。その後、培地を除去し、迅速に5％CO 2中で30℃で24時間、細胞を培養する前に、予め温めておいた新鮮Z分化条 ​​件培地（ステップ1.9）を1ml加えます。 </li><li> 2日毎に、細胞differentationの時間の間にZ-分化条件培地の半分を交換してください。 </li></ol>一次ニューロスフェアの7遺伝子操作<ol><li> 4℃で80×gで8分間遠心分離することによりDiV3-4一次ニューロスフェア（ステップ4.3）を収集します。 previouly DNAプラスミドベクターの11または核-トランスフェクションに記載されているように商業oligonucleoatidesのリポソームトランスフェクションのために準備します。 </li><li>反応混合物を100μl（82μlのnucleofactor液とサプリメントの18μl）を4×10 3細胞/μlでの細胞密度で再懸濁し、ニューロスフェアのペレット。 </li><li>神経球をミックスsuspensi（1μgの/μlのでプラスミド株）選択肢のDNAプラスミドベクターの5μlを持つ上。 nucleotransfectionのためのNucleofectorキュベットに神経球/ DNA混合物を移し、ヌクレオキットが提供するメーカーの指示に従ってプログラムをヌクレオ選択します。 </li><li>すぐヌクレオ後、細胞を予め温めZ条件培地（1.10）を500mlの容量を追加し、上記のように、それらの細胞の再生および/または分化の特性を研究するためのトランスフェクトされた神経球をプレート。 </li></ol>

<ol>
	<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+isolation+and+characterization.">Neural stem cell isolation and characterization.</a> Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Winter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+stem+cell+segmentation,+tracking+and+lineaging+with+validation+and+editing.">Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing.</a> Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+derived+from+early+zebrafish+embryos+differentiate+in+vitro+into+neurons+and+astrocytes.">Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes.</a> Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio).</a> PloS one. 8, e57539 (2013).</li><li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Ristori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dicer-miR-107+interaction+regulates+biogenesis+of+specific+miRNAs+crucial+for+neurogenesis.">A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis.</a> Dev Cell. 32, 546-560 (2015).</li><li>Louis, S. K., SIegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Analysis+Using+Trypan+Blue:+Manual+and+Automated+Methods.">Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods.</a> Methods Mol Bio. 740, (2011).</li><li>Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+view+of+development.">A CRISPR view of development.</a> Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

このプロトコルの主な目的は、神経幹/前駆細胞の細胞および分子の機能を研究するためにゼブラフィッシュの脳由来の神経球を分離し、培養大人のすることです。ここでは、成人のゼブラフィッシュの脳から、多能性神経細胞を選択し、3神経細胞型、 すなわち 、アストロサイト、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトを生成する方法を報告しています。再現性のニューロスフェア...

哺乳動物の神経幹細胞（NSCは）分裂細胞のクラスターは、神経球1と呼ばれるように自由に浮遊培養物中で成長する能力により、in vitroで特徴づけられています。上皮成長因子（EGF）及び線維芽細胞増殖因子（FGF）の存在下では、NSCは、すなわち 、二つの異なる娘細胞を生成するために、非対称自己再生のNSCを生成するためにいずれかの対称的に分裂し、または、分化前駆細胞および新規NSCを。ニューロスフェア培養物は、したがって、神経幹/前駆細胞とより分化した神経細胞2-4の混合物であるNSCは、しかし、2つの特定の特性によって、他の神経球の細胞型と区別することができます。彼らは自由に長期の自己再生を表示します文化を浮遊し、それらは、細胞外マトリクス基板への成長因子の撤退と、接着以下のすべての神経細胞系統（ すなわち 、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイト）に分化することができます。 mammでALS、神経球培養系は成体脳におけるNSCの存在を示すために使用されるインビトロ系において最初であり、神経幹細胞および前駆細胞の増殖、自己再生能と多分化を分析するための最も一般的に使用されるツールのままです。したがって、球形成アッセイは、いくつかの欠点や限界4苦しむもかかわらず、この培養系は、そのインビボニッチ4から除去され、重要な調節因子を同定することに尽力してきたときに、幹細胞として振る舞うために、細胞の可能性を評価するための価値がありますNSC自己複製と細胞の運命決意5-7の。 成体の神経発生が制限されている哺乳動物とは対照的に、ゼブラフィッシュは、構成的に、その生涯を通じて脳全体軸に沿って、新しいニューロンを産生します。ゼブラフィッシュ成体の脳は、ゼブラフィッシュにトンを理解するための強力なモデル生物を作る神経幹/前駆細胞を保有する複数の神経因性ニッチを表示します彼は、細胞、脳内の活動だけでなく、中枢神経系の再生に必要な分子プログラムを食い止めます。過去17年間で、いくつかの研究グループは、単離およびゼブラフィッシュ神経細胞8,9を培養するための方法論を開発しました。これらの研究は、 インビトロではなく、NSCのを維持し、その特性を調査で胚性神経細胞およびグリア細胞を産生することを目的としました。ニューロスフェアは、大人Apteronotusのleptorhynchus（ブラウンゴーストKnifefish）10で生成されているが、ゼブラフィッシュにおけるニューロスフェア形成アッセイが確立されて残りました。 ここでは、ゼブラフィッシュの神経新生11中のmiR-107の役割を実証するためのニューロスフェア形成アッセイを説明します。プロトコルが可能になります。1）ゼブラフィッシュの全脳から、またはそのような終脳、蓋、および小脳な​​どのいくつかの解剖脳領域からいずれかの成体神経幹細胞/前駆細胞のコレクションです。 FLの2）の生成浮動および成体神経幹/前駆細胞からの自己再生の神経球。 3）ダウンとアップレギュレーションをコードする遺伝子または小さな非コードRNAニューロスフェア中の11の発現のためには、神経幹/前駆細胞の増殖および分化における役割を調査します。

<table><tbody><tr><td>DPBS 1x</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C6852-25g</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2 supplement (100x) liquid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td>1 M</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose 45%&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&amp;nbsp;100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500-50 mg</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DN25-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Papain&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>PFA&amp;nbsp;</td><td>TCI</td><td>P0018</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>AmericanBio</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS-222</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>stock solution of 4 mg/ml.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trycold gel&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>TGP8</td><td>gel pack</td></tr><tr><td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

アダルトゼブラフィッシュ神経球文化の一般的スキームここでは、成人のゼブラフィッシュの脳から行っニューロスフェア形成アッセイのプロトコルのすべての手順を説明します。まず、成体神経幹細胞/前駆細胞は、ゼブラフィッシュの全脳から、またはそのような終脳、蓋および小脳（ 図1A-C）などのいく?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。

大人のゼブラフィッシュ脳由来神経球の単離および培養

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

isolation-and-culture-of-adult-zebrafish-brain-derived-neurospheres

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.9K ビュー.  Yale University. ここでは、全脳から、または終脳、tectalまたは成人のゼブラフィッシュの脳の小脳領域のいずれかに由来する神経球アッセイを使用して、大人の神経新生を調べるために、再現性のある方法を提供します。さらに、我々はゼブラフィッシュの神経球における遺伝子発現を操作するための手順を説明します。 

ビデオ: Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

神経科学

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

発生生物学

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the differentiation and proliferation potential of neural stem cells, as well as to generate cell lines than can be assayed over time. Also, neurospheres can create a niche (in vitro) that allows the modeling of the dynamic changing environment, such as varying growth factors, hormones, neurotransmitters, among others. Microtus ochrogaster (prairie vole) is a unique model for understanding the neurobiological basis of socio-sexual behaviors and social cognition. However, the cellular mechanisms involved in these behaviors are not well known. The protocol aims to obtain neural progenitor cells from the neurogenic niches of the adult prairie vole, which are cultured under non-adherent conditions, to generate neurospheres. The size and number of neurospheres depend on the region (subventricular zone or dentate gyrus) and sex of the prairie vole. This method is a remarkable tool to study sex-dependent differences in neurogenic niches in vitro and the neuroplasticity changes associated with social behaviors such as pair bonding and biparental care. Also, cognitive conditions that entail deficits in social interactions (autism spectrum disorders and schizophrenia) could be examined.

We established the conditions to culture neural progenitor cells from the subventricular zone and dentate gyrus of the adult brain of prairie voles, as a complementary in vitro study, to analyze the sex-dependent differences between neurogenic niches that could be part of functional plastic changes associated with social behaviors.

成人大草原の神経起源ニッチ由来の神経球の培養

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

<meta charset="utf8"></head><body>マウス脳室内領域から単離されたNSCの効率的なヌクレオフェクション

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:マウス脳室下ゾーン由来神経幹細胞培養における高効率遺伝子導入のためのヌクレオフェクションの改善

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Generation and Differentiation of Primary Neurospheres from Zebrafish Neural Stem Cells

Source: Lopez-Ramirez, M. A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53617">Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the generation and differentiation of primary neurospheres. Neural stem cells from zebrafish, in the presence of growth factors, proliferate into free-floating neurospheres with self-renewal capacity, which later differentiate into glial cells and neurons.

ゼブラフィッシュ神経幹細胞からの初代ニューロスフェアの生成と分化

1. Preparations

	Prepare 10 ml of dissection medium, and add 200 &#181;l of 100x penicillin-streptomycin into 9.8 ml of Dulbecco&#39;s Modified Eagle ...

大人のゼブラフィッシュ脳由来神経球の単離および培養

要約

さらに動画を探す

この動画の章

ニューロスフェアのアッセイを使用して成体マウス神経幹細胞の単離と拡大

文化、ゼブラフィッシュ初代培養細胞のトランスフェクション

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

マウス梁下ゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

分離およびゼブラフィッシュ稚魚の脳から神経細胞、大食細胞、ミクログリアの RNA の抽出

成人大草原の神経起源ニッチ由来の神経球の培養

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

ゼブラフィッシュ神経幹細胞からの初代ニューロスフェアの生成と分化