The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

WT CF 균주의 제브라 피쉬는 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC 프로토콜 번호 2012-11473)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 제기 및 유지 하였다. 모든 실험은 첫 번째 연구 목적으로 동물의 사용과 관련 기관을 규제하는 모든 관련 정부 및 기관 윤리의 승인을 받아야한다. 1. 준비 <ol><li> , 해부 매체 10 ml의 준비의 200 μl를 추가 100X 페니실린 - 스트렙토 마이신 DMEM / F12의 9.8 ml의에. </li><li> , 조직 배양 물 10 ㎖에 L 시스테인 120 mg의 추가 : L 시스테인 솔루션을 준비합니다. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 L 시스테인 솔루션을 저장, 또는 최대 1 년 -20 ° C에서 분취한다. </li><li> DNase의에게 내가 솔루션을 준비 : 조직 배양 물 1 ㎖에, DNase의 I. 스토어 최대 2 개월 동안 4 ° C에서의 DNase I 용액 10 mg을 추가합니다. </li><li> 파파인 솔루션을 준비 : 파파인 오디오 솔루션을 준비이온은 DMEM / F12의 5 ㎖로 100 ㎕를 파파인 (약 140 대), 100 μL의 DNase의 I (1 %) 200 μL의 L 시스테인 (12 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 갓 파파인 용액마다 준비하고 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터로 멸균. </li><li> 세척 용액을 제조 :, 세척 용액 100 ㎖를 제조 93.85 ml의 DPBS 1 배에 포도당 45 %, 500 μL HEPES 1 M, 5 ML의 FBS를 650 μl를 추가 할 수 있습니다. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 세척 소독 용액. 최대 2 개월 동안 4 ° C에서 세정액을 저장합니다. </li><li> 인슐린 솔루션을 준비 : 인슐린 용액 2 ㎖를 준비, 조직 배양 물 2 ㎖로 10 N 수산화 나트륨 100 mg의 인슐린의 25 μl의 드롭을 추가합니다. </li><li> EGF와 FGF 솔루션을 준비 : 100 μg의 / ml의 농도로 DMEM / F12 모두 분열 촉진 물질을 용해. -20 ° C에서 10 μL 씩과 같은 보관하십시오. </li><li> B-27, N-2 미디어를 준비합니다 저장 B-27 및 N-2 보충제를 500 μL로 -20 ° C 1 ml의 분취, respectiv에서엘리. </li><li> Z 분화 조건 배지를 준비 : Z 분화 조건 배지 100㎖를 준비 40 μL 인슐린 (50 ㎎ / ㎖) 500 ㎕를 B-27 1 ㎖의 N-2, 650 μL의 포도당 45 % 및 1 ㎖를 추가 할 100 × 페니실린 - 스트렙토 마이신 DMEM / F12의 97.81 ml의에. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터 Z 분화 조건 배지를 멸균. 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 Z-분화 조건 매체를 저장합니다. </li><li> Z 조건 배지를 제조 : Z-조건 배지 50 ㎖를 준비 EGF 10 ㎕의 멸균 Z 분화 조건 배지 (20 NG / ㎖) 50 ㎖에 FGF의 10 μL를 추가. 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 Z-조건 매체를 저장합니다. </li><li> 분화 배양 코팅액을 제조 5 ml의 세포 외 도포 액에 대해, 세포 외 기질 용액 100 ㎕를 추가 DMEM / F12 4.9 ㎖ 중에 (예, 마트 리겔.). 얼음에 4 ℃에서 해동 세포 외 매트릭스 솔루션입니다. 일단 해동, 유 4 ℃에서 보관이주에 페이지. </li></ol> 성인 Zebrafish의 두뇌 2. 해부 <ol><li> 젤 아이스 팩 100mm X 15mm 페트리 접시를 작성하여 침대 절개를 준비합니다. 그런 다음 페트리 접시에 뚜껑을 배치하고 젤이 정지 할 때까지 -20 ° C에서 품어. 뚜껑 장소의 위에 깨끗한 종이 필터의 사각형 필터 종이와 플라스틱 필름 배양 접시를 모두 마무리합니다. </li><li> 깨끗하고 각 사용하기 전에 70 % 에탄올 또는 열에 의해 모든 미세 절제 장비를 소독. 해부 현미경 근처에 모든 멸균 해부 악기를 배치하고, 오른쪽 안락사 전에, 광섬유 조명 현미경 해부 침대를 배치합니다. </li><li> 전체 뇌 neurosphere 준비를위한 2 성인 제브라 피쉬를 수집; 및 3-4 제브라 해부 뇌 영역에서 neurosphere를 생성한다. </li><li> 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 성인 제브라 피쉬 (8~12개월 세)를 안락사. 다음으로, 7 물고기를 담그지5 % ~ 10 초 동안 에탄올 빠르게는 수술 블레이드를 사용하여 아가미의 수준에서 잘린 다음 해부 침대에 배치합니다. <ol><li> 동물의 심장 박동이 점차 둔화 및 순환이 멈출 때까지 과다 복용 tricaine의 메탄 (300 ㎎ / ℓ)를 관리, 동물을 안락사하려면 다음 아이스 물에 담그지. </li></ol></li><li> 아래로 머리 등의 측면을 돌려 가위를 사용하여 입 컷 측면에서 길이 절단을합니다. 집게를 사용하여 두개골의 기반을 노출하고 모든 인접 조직을 제거합니다. tectum으로 척수의 시작 부분에서 두개골의 측면 벽을 잘라. </li><li> 위 사용 절단 시신경을 제거하고 tectum 수준에서 두개골의 가장 외측 부분의 양측을 제거한다. 머리 복부 쪽을 돌립니다. 두개골의 가장 꼭대기 부분의 나머지 부분을 떼어, 집게를 사용. </li><li> 새로운 요리 위스콘신에 두개골의 나머지 부분과 뇌를 따라 이동해부 매체 (1.1) 토륨. 본래 모든 뇌 구조를 유지 마이크로 칼의 플라스틱 손잡이를 사용하여 해부 배지에서 뇌 조직을 청소한다. </li><li> 이 시점에서, 전체 제브라 피쉬의 뇌를 사용하여 프로토콜을 계속합니다. <ol><li> 또는 전체 제브라 피쉬의 뇌에서 또는 신선한 메스로 해부 telencephalon, tectum / 간뇌 나 소뇌에서 neurosphere를 생성하는 특정 뇌 영역이 프로토콜을 적용. 3도 11를 참조 관심있어서의 뇌 영역을 해부 신경 특정 형광 제브라 피쉬의 신경 형질 전환 라인을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 성인 뇌의 3 단일 세포 해리 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에 모든 후속 작업을 수행합니다. 해부 배지 800 μl를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 뇌 조직을 전송한다 (단계 1.1에서 제조). 뇌 조직을 건드리지 않고, 피펫 팅에 의해 해부 매체를 제거합니다. </li><li>파파인 용액 (단계 1.4) 500 μL를 첨가하고 10 분 동안 37 ° C에서 뇌 조직 다이제스트. 이 세포 생존 능력을 감소 수 있으므로 15 분 이상을 품어하지 마십시오. </li><li> 배양 후, 바닥으로부터 ~ 0.25 인치 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 절삭 15ml의 원뿔형 튜브에 파파인 용액 500 μL와 뇌 조직 옮긴다. 조심스럽게 천천히 동일한 팁 상하 10 회 피펫 팅하여 뇌 조직을 해리. 최대 피펫 이상 15 배 아래로는 세포 생존을 변경할 수 있기 때문에,이 단계에서 공기 방울을 생성하지 마십시오. </li><li> 미가공 1000 μL 정규 팁을 사용하여 10로 pipetting 분 뒤에 아래 10-13 시간 동안 37 ℃에서 다시 뇌 조직을 인큐베이션. 최대 피펫하지 않는 이상 15 배 아래로, 세포 사멸을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 실온 (RT)에서 5 분 800 XG에 세정액 (단계 1.5), 원심 분리 2 ㎖의 세포 현탁액을 첨가하여 효소 분해를 중지. 조심스럽게들 가만히 따르다upernatant 및 1,000 μL 일반 팁와 피펫 팅에 의해 아래로 격렬하게 손가락으로 다음 튜브를 눌러 남아있는 용액에 펠렛을 재현 탁. 이어서, 세척 용액 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 이 단계에서, 단일 세포 현탁액을 수득 한 현미경으로 확인한다. RT에서 5 분 동안 800 × g으로 다시 세포 현탁액을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 신선한 Z-조건 매체 (단계 1.10) 1 ㎖를 사용하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 트립 판 블루 (12)를 사용하여 세포를 염색 블루 사균을 제외하여 혈구를 사용하여 살아있는 세포 수를 계산. 세포 현탁액 200 ㎕를 각 웰에 신선한 Z-조건 매체의 300 μL와 24 웰 플레이트를 준비합니다. ~ 500 세포 / μL의 밀도에 씨앗 세포. 제브라 뇌 유래 neurosphere를 37 ℃에서 잘 성장하지 않기 때문에, 5 % CO 2에서 30 ° C에서 항온 배양 된 세포를 유지한다. </li></ol> 기본 neurosphere를의 4 세대 &lt;/ P&gt; <ol><li> 시험 관내 (DiV1)에서 일일 후 현미경 성인 뇌 전체에서 얻은 단일 세포 현탁액을 관찰 파편이 웰의 중심에 축적 여부 참고. 조심스럽게 매체의 약 100 μl를 피펫 팅하여 이물질을 제거 (가능한 경우 이하). 다음 신선한 Z-조건 매체의 100 μl를 추가합니다. 단일 세포 현탁액이 시간 (그림 2A DiV1)에서 관찰해야한다. </li><li> 체외에서 이일 (DIV2) 한 후, 배양 된 세포를 확장합니다. 팁 잘라 1,000 μL 피펫을 사용하여 수집하고 잘 새에 각 우물에서 세포 현탁액 250 μl를 전송합니다. 모든 우물에 신선한 Z-조건 매체의 250 μl를 추가합니다. 배양 된 세포를 확장하기 전에 잘 전반에 걸쳐 최대 피펫 팅에 의해 아래로 아주 부드럽게 정지를 균질화. </li><li> 반복 시험 관내에서 다음 사일 (DiV4) 4.1 및 4.2 단계를 반복합니다. neurosphere를의 크기가 점진적 증가는 VI해야한다DiV3 및 DiV4 (도 2B와 C)의 중심과 가장자리에서 잘 sible. 주 : 기본 neurosphere를이 통로 또는 다 능성 분화를 평가하기 위해 처리 될 수있다. 대안 적으로, 이들은 분화 과정 중 특정 유전자의 역할을 특징 nucleofection 또는 리포 형질 11 처리 될 수있다. </li></ol> 기본 neurosphere를 5.과 Passaging <ol><li> 각 우물에서 조직 배양 250 μl를 제거하고 기계적으로 1 ml를 피펫으로 DiV4의 neurosphere를을 떼어 놓다. 너무 빨리 기포 형성이 세포 사멸을 증가 수 있으므로 아래 피펫하지 마십시오. </li><li> 혈구 세포 수를 계산하고, 24 웰 플레이트의 각 웰에 일차 배양 상등액 250 ㎕의 800 세포 / μL를 배포한다. </li><li> 각 웰에 Z-조건 매체의 250 μl를 추가합니다. </li><li> 단계 4.2에보고 된 체외에서 이일 (DIV2) 한 후, 배양 된 세포를 확장D 4.3. </li></ol> 기본 neurosphere를 6. 차별화 <ol><li> 10 분 동안 70 % 에탄올에 침지하여 커버 유리를 소독, 12 웰 플레이트의 각 웰에 그들을 배치하여 실온에서 건조 후 커버 유리. </li><li> 그것은 넓게 확장하여 전체 커버 유리를 커버 할 수있는 방식으로, 커버 유리의 중앙에 세포 외 코팅액 (단계 1.11) 300 μL를 추가한다. 이어서, (습한 세포 배양기를 사용하여)을 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 배양 후 세포 코팅액을 제거하고 37 ℃에서 2 시간 동안 커버 유리를 건조. </li><li> 각 우물에서 조직 배양 250 μl를 제거합니다. 기계적로 pipetting 아래로 (넓은 엔드 팁) 1 ml를 피펫으로 잘 따라 모든 DiV4 차 neurosphere를을 떼어 놓다. </li><li> 종자는 미리 제조 외 기질 코팅 coverglasses 4 × 103 세포 / ml의 세포 밀도 (6.1-6 단계에서 neurosphere 세포 현탁액 해리.3) 기판에 부착 될 때까지, 5 % CO 2, 30 ℃에서 적어도 30 분 동안 유지한다. 이어서, 배지를 제거하고 빠르게 5 % CO 2에서 30 ° C에서 24 시간 동안 세포를 배양하기 전에 예열 신선한 Z 분화 조건 배지 (단계 1.9) 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 모든 이틀, 세포 분화의 시간 동안 Z-분화 조건 매체의 절반을 교체합니다. </li></ol> 기본 neurosphere를 7. 유전자 조작 <ol><li> 4 ° C에서 80 x g에서 8 분 동안 원심 분리하여 DiV3-4 차 neurosphere를 (단계 4.3)를 수집합니다. 상업 oligonucleoatides의 리포좀 형질 전환 준비는 previouly 11 DNA 플라스미드 벡터의 nucleo - 형질을 설명했다. </li><li> 반응 혼합물의 100 μL (82 μL의 nucleofactor 용액 보충 18 μL)에 4 × 103 세포 / μL의 세포 밀도로 재현 탁의 neurosphere 펠릿. </li><li> neurosphere의 suspensi 믹스(1 μg의 / μL에서 플라스미드 주식) 선택의 DNA 플라스미드 벡터의 5 μL와 함께합니다. nucleotransfection에 대한 nucleofector 큐벳에 neurosphere / DNA 혼합물을 전송하고 nucleofector 키트에서 제공하는 제조업체의 지침에 따라 프로그램을 nucleofector 선택합니다. </li><li> 즉시 nucleofection 후, 균체를 예열 Z 조건 배지 (1.10) 500 ㎖를 추가하고 전술 한 바와 같이, 이들 세포 재생 및 / 또는 분화 특성을 연구 형질 neurosphere를 플레이트. </li></ol>

<ol>
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The authors declare no competing financial interests.

이 프로토콜의 주요 목표는 신​​경 줄기 / 전구 세포의 세포 및 분자 기능 연구를위한 분리 및 배양 성인 zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를하는 것입니다. 여기, 우리는 성인 zebrafish의 뇌에서, 다 능성 신경 세포를 선택하고 세 개의 신경 세포 유형, 즉, 성상 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포를 생성하는 방법을보고합니다. 재현성 neurosphere 형성 분석은 지금까지 제브라 피쉬 년에 설립?...

포유류 신경줄 기세포 (NSCs의)는 neurosphere를 1이라 세포의 클러스터로 분할 부동성 배양에서 성장하는 능력에 의해 시험 관내에서 특성화되었다. 표피 성장 인자 (EGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 존재하에 NSCs의 자기 갱신 NSCs을 생성하기 위해 하나 대칭 분할 또는 비대칭 적으로 서로 다른 두 딸 세포를 생성하는 예., 미분 전구 세포 및 신규 NSC. Neurosphere 문화 따라서 신경 줄기 / 전구 세포보다 분화 된 신경 세포 2-4의 혼합물이다 NSCs을하지만,이 특정 속성에 의해 다른 neurosphere 세포 유형을 구별 할 수 있습니다. 그들은 자유에 장기 자기 갱신을 표시 문화 부동 그들은 세포 외 매트릭스 기판에 성장 인자의 철수 및 부착 다음 모든 신경 세포 계통 (즉, 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포)로 분화 할 수 있습니다. mamm에서ALS, neurosphere 배양 시스템은 성인 뇌 NSCs의 존재를 입증하는 데 사용되는 제 관내 시스템이고 증식자가 재생 능력과 신경 줄기 세포 및 선조 세포의 다 능성을 분석하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 도구가 남아있다. 따라서, 구 형성 분석법 단점과 한계 4 고통에도이 배양 시스템은 생체 내 틈새 (4)로부터 제거되어 키 레귤레이터 식별 쓸모 때 줄기 세포처럼 행동하는 세포의 잠재력을 평가하는데 유용 NSC 자기 갱신과 세포 운명 결정 5-7의. 성인 신경 제한된 포유류 달리 지브라 피쉬는 구조적 그들의 수명 동안 뇌 전체 축을 따라 새로운 뉴런을 생성한다. 제브라 피쉬 성인의 뇌는 t을 이해하기위한 제브라 피쉬에게 강력한 모델 생물을 신경 줄기 / 전구 세포를 품고 여러 신경 인성 틈새를 표시그 세포는 뇌 활동뿐만 아니라 중추 신경계 재생을위한 필요한 분자 프로그램 줄기. 지난 십칠년 동안 여러 연구 그룹은 분리하고 제브라 피쉬의 신경 세포 8,9 배양을위한 방법론을 개발했다. 이 연구는 배아 신경 세포 및 생체 외에서 아교 세포를 생산을 목표로,하지만 NSCs을 유지하고 그들의 특성을 조사하고 있었다. neurosphere를가 성인 Apteronotus의 leptorhynchus (브라운 유령 Knifefish) (10)에서 생성되었지만, 제브라 피쉬의 neurosphere 형성 분석은 설정 될 남아 있었다. 여기에서 우리는 제브라 피쉬의 신경 (11) 동안은 miR-107의 역할을 설명하기 neurosphere 형성 분석을 설명합니다. 프로토콜은 수 1) 지브라 피쉬 뇌 전체에서 또는 telencephalon, tectum 및 소뇌 여러 해부 뇌 영역에서 어느 성인 신경 줄기 / 선조 세포의 수집; FL 2) 생성oating 성인 신경 줄기 / 전구 세포의 자기 갱신 neurosphere를; 3) 하향과 상향 조정 코딩하는 유전자 또는 작은 비 코딩 RNA를 neurosphere를 11의 표현의 순서는 신경 줄기 / 전구 세포의 증식 및 분화에서의 역할을 조사합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 supplement (100x) liquid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose 45%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500-50 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA&#160;</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB11072-04000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td>stock solution of 4 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trycold gel&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TGP8</td>
			<td>gel pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPI-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

성인 Zebrafish의 Neurosphere 문화 일반 계획 여기에서 우리는 성인 zebrafish의 뇌에서 수행 neurosphere 형성 분석의 프로토콜의 모든 단계를 설명합니다. 첫째, 성인 신경 줄기 / 전구 세포는 제브라 피쉬의 뇌 전체에서 또는 telencephalon, tectum 및 소뇌 (도 1A-C) 등 여러 가지 해부하는 뇌 영역에서 하나 수집하고 있습니다. 성...

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Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K 조회수.  Yale University.  여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다. 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

연구

발생학

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

분리 및 성인 개 해마 신경 전구체의 확장

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

성인 및 노인 인간의 골격 근육에서 근육 조직 전구체 세포 / 차 근육 아세포의 준비 및 문화

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

다중 광자 현미경으로 라이브 셀 이미징을위한 성인 형질 전환 Zebrafish의 망막의 Explants의 문화

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

나노-중재 siRNA 유전자 입을 성인 Zebrafish 마음에

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...