Name: isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres
Uploaded: 2016-02-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
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The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

WT CF 균주의 제브라 피쉬는 예일 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC 프로토콜 번호 2012-11473)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 제기 및 유지 하였다. 모든 실험은 첫 번째 연구 목적으로 동물의 사용과 관련 기관을 규제하는 모든 관련 정부 및 기관 윤리의 승인을 받아야한다. 1. 준비 <ol><li> , 해부 매체 10 ml의 준비의 200 μl를 추가 100X 페니실린 - 스트렙토 마이신 DMEM / F12의 9.8 ml의에. </li><li> , 조직 배양 물 10 ㎖에 L 시스테인 120 mg의 추가 : L 시스테인 솔루션을 준비합니다. 최대 2 주 동안 4 ° C에서 L 시스테인 솔루션을 저장, 또는 최대 1 년 -20 ° C에서 분취한다. </li><li> DNase의에게 내가 솔루션을 준비 : 조직 배양 물 1 ㎖에, DNase의 I. 스토어 최대 2 개월 동안 4 ° C에서의 DNase I 용액 10 mg을 추가합니다. </li><li> 파파인 솔루션을 준비 : 파파인 오디오 솔루션을 준비이온은 DMEM / F12의 5 ㎖로 100 ㎕를 파파인 (약 140 대), 100 μL의 DNase의 I (1 %) 200 μL의 L 시스테인 (12 ㎎ / ㎖)를 추가합니다. 갓 파파인 용액마다 준비하고 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터로 멸균. </li><li> 세척 용액을 제조 :, 세척 용액 100 ㎖를 제조 93.85 ml의 DPBS 1 배에 포도당 45 %, 500 μL HEPES 1 M, 5 ML의 FBS를 650 μl를 추가 할 수 있습니다. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터를 세척 소독 용액. 최대 2 개월 동안 4 ° C에서 세정액을 저장합니다. </li><li> 인슐린 솔루션을 준비 : 인슐린 용액 2 ㎖를 준비, 조직 배양 물 2 ㎖로 10 N 수산화 나트륨 100 mg의 인슐린의 25 μl의 드롭을 추가합니다. </li><li> EGF와 FGF 솔루션을 준비 : 100 μg의 / ml의 농도로 DMEM / F12 모두 분열 촉진 물질을 용해. -20 ° C에서 10 μL 씩과 같은 보관하십시오. </li><li> B-27, N-2 미디어를 준비합니다 저장 B-27 및 N-2 보충제를 500 μL로 -20 ° C 1 ml의 분취, respectiv에서엘리. </li><li> Z 분화 조건 배지를 준비 : Z 분화 조건 배지 100㎖를 준비 40 μL 인슐린 (50 ㎎ / ㎖) 500 ㎕를 B-27 1 ㎖의 N-2, 650 μL의 포도당 45 % 및 1 ㎖를 추가 할 100 × 페니실린 - 스트렙토 마이신 DMEM / F12의 97.81 ml의에. 사용하기 전에 0.22 ㎛의 공극 크기의 필터 Z 분화 조건 배지를 멸균. 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 Z-분화 조건 매체를 저장합니다. </li><li> Z 조건 배지를 제조 : Z-조건 배지 50 ㎖를 준비 EGF 10 ㎕의 멸균 Z 분화 조건 배지 (20 NG / ㎖) 50 ㎖에 FGF의 10 μL를 추가. 최대 1 주일 동안 4 ° C에서 Z-조건 매체를 저장합니다. </li><li> 분화 배양 코팅액을 제조 5 ml의 세포 외 도포 액에 대해, 세포 외 기질 용액 100 ㎕를 추가 DMEM / F12 4.9 ㎖ 중에 (예, 마트 리겔.). 얼음에 4 ℃에서 해동 세포 외 매트릭스 솔루션입니다. 일단 해동, 유 4 ℃에서 보관이주에 페이지. </li></ol> 성인 Zebrafish의 두뇌 2. 해부 <ol><li> 젤 아이스 팩 100mm X 15mm 페트리 접시를 작성하여 침대 절개를 준비합니다. 그런 다음 페트리 접시에 뚜껑을 배치하고 젤이 정지 할 때까지 -20 ° C에서 품어. 뚜껑 장소의 위에 깨끗한 종이 필터의 사각형 필터 종이와 플라스틱 필름 배양 접시를 모두 마무리합니다. </li><li> 깨끗하고 각 사용하기 전에 70 % 에탄올 또는 열에 의해 모든 미세 절제 장비를 소독. 해부 현미경 근처에 모든 멸균 해부 악기를 배치하고, 오른쪽 안락사 전에, 광섬유 조명 현미경 해부 침대를 배치합니다. </li><li> 전체 뇌 neurosphere 준비를위한 2 성인 제브라 피쉬를 수집; 및 3-4 제브라 해부 뇌 영역에서 neurosphere를 생성한다. </li><li> 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 성인 제브라 피쉬 (8~12개월 세)를 안락사. 다음으로, 7 물고기를 담그지5 % ~ 10 초 동안 에탄올 빠르게는 수술 블레이드를 사용하여 아가미의 수준에서 잘린 다음 해부 침대에 배치합니다. <ol><li> 동물의 심장 박동이 점차 둔화 및 순환이 멈출 때까지 과다 복용 tricaine의 메탄 (300 ㎎ / ℓ)를 관리, 동물을 안락사하려면 다음 아이스 물에 담그지. </li></ol></li><li> 아래로 머리 등의 측면을 돌려 가위를 사용하여 입 컷 측면에서 길이 절단을합니다. 집게를 사용하여 두개골의 기반을 노출하고 모든 인접 조직을 제거합니다. tectum으로 척수의 시작 부분에서 두개골의 측면 벽을 잘라. </li><li> 위 사용 절단 시신경을 제거하고 tectum 수준에서 두개골의 가장 외측 부분의 양측을 제거한다. 머리 복부 쪽을 돌립니다. 두개골의 가장 꼭대기 부분의 나머지 부분을 떼어, 집게를 사용. </li><li> 새로운 요리 위스콘신에 두개골의 나머지 부분과 뇌를 따라 이동해부 매체 (1.1) 토륨. 본래 모든 뇌 구조를 유지 마이크로 칼의 플라스틱 손잡이를 사용하여 해부 배지에서 뇌 조직을 청소한다. </li><li> 이 시점에서, 전체 제브라 피쉬의 뇌를 사용하여 프로토콜을 계속합니다. <ol><li> 또는 전체 제브라 피쉬의 뇌에서 또는 신선한 메스로 해부 telencephalon, tectum / 간뇌 나 소뇌에서 neurosphere를 생성하는 특정 뇌 영역이 프로토콜을 적용. 3도 11를 참조 관심있어서의 뇌 영역을 해부 신경 특정 형광 제브라 피쉬의 신경 형질 전환 라인을 사용합니다. </li></ol></li></ol> 성인 뇌의 3 단일 세포 해리 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에 모든 후속 작업을 수행합니다. 해부 배지 800 μl를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 뇌 조직을 전송한다 (단계 1.1에서 제조). 뇌 조직을 건드리지 않고, 피펫 팅에 의해 해부 매체를 제거합니다. </li><li>파파인 용액 (단계 1.4) 500 μL를 첨가하고 10 분 동안 37 ° C에서 뇌 조직 다이제스트. 이 세포 생존 능력을 감소 수 있으므로 15 분 이상을 품어하지 마십시오. </li><li> 배양 후, 바닥으로부터 ~ 0.25 인치 1000 μL 피펫 팁을 사용하여 절삭 15ml의 원뿔형 튜브에 파파인 용액 500 μL와 뇌 조직 옮긴다. 조심스럽게 천천히 동일한 팁 상하 10 회 피펫 팅하여 뇌 조직을 해리. 최대 피펫 이상 15 배 아래로는 세포 생존을 변경할 수 있기 때문에,이 단계에서 공기 방울을 생성하지 마십시오. </li><li> 미가공 1000 μL 정규 팁을 사용하여 10로 pipetting 분 뒤에 아래 10-13 시간 동안 37 ℃에서 다시 뇌 조직을 인큐베이션. 최대 피펫하지 않는 이상 15 배 아래로, 세포 사멸을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 실온 (RT)에서 5 분 800 XG에 세정액 (단계 1.5), 원심 분리 2 ㎖의 세포 현탁액을 첨가하여 효소 분해를 중지. 조심스럽게들 가만히 따르다upernatant 및 1,000 μL 일반 팁와 피펫 팅에 의해 아래로 격렬하게 손가락으로 다음 튜브를 눌러 남아있는 용액에 펠렛을 재현 탁. 이어서, 세척 용액 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 이 단계에서, 단일 세포 현탁액을 수득 한 현미경으로 확인한다. RT에서 5 분 동안 800 × g으로 다시 세포 현탁액을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 신선한 Z-조건 매체 (단계 1.10) 1 ㎖를 사용하여 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 트립 판 블루 (12)를 사용하여 세포를 염색 블루 사균을 제외하여 혈구를 사용하여 살아있는 세포 수를 계산. 세포 현탁액 200 ㎕를 각 웰에 신선한 Z-조건 매체의 300 μL와 24 웰 플레이트를 준비합니다. ~ 500 세포 / μL의 밀도에 씨앗 세포. 제브라 뇌 유래 neurosphere를 37 ℃에서 잘 성장하지 않기 때문에, 5 % CO 2에서 30 ° C에서 항온 배양 된 세포를 유지한다. </li></ol> 기본 neurosphere를의 4 세대 &lt;/ P&gt; <ol><li> 시험 관내 (DiV1)에서 일일 후 현미경 성인 뇌 전체에서 얻은 단일 세포 현탁액을 관찰 파편이 웰의 중심에 축적 여부 참고. 조심스럽게 매체의 약 100 μl를 피펫 팅하여 이물질을 제거 (가능한 경우 이하). 다음 신선한 Z-조건 매체의 100 μl를 추가합니다. 단일 세포 현탁액이 시간 (그림 2A DiV1)에서 관찰해야한다. </li><li> 체외에서 이일 (DIV2) 한 후, 배양 된 세포를 확장합니다. 팁 잘라 1,000 μL 피펫을 사용하여 수집하고 잘 새에 각 우물에서 세포 현탁액 250 μl를 전송합니다. 모든 우물에 신선한 Z-조건 매체의 250 μl를 추가합니다. 배양 된 세포를 확장하기 전에 잘 전반에 걸쳐 최대 피펫 팅에 의해 아래로 아주 부드럽게 정지를 균질화. </li><li> 반복 시험 관내에서 다음 사일 (DiV4) 4.1 및 4.2 단계를 반복합니다. neurosphere를의 크기가 점진적 증가는 VI해야한다DiV3 및 DiV4 (도 2B와 C)의 중심과 가장자리에서 잘 sible. 주 : 기본 neurosphere를이 통로 또는 다 능성 분화를 평가하기 위해 처리 될 수있다. 대안 적으로, 이들은 분화 과정 중 특정 유전자의 역할을 특징 nucleofection 또는 리포 형질 11 처리 될 수있다. </li></ol> 기본 neurosphere를 5.과 Passaging <ol><li> 각 우물에서 조직 배양 250 μl를 제거하고 기계적으로 1 ml를 피펫으로 DiV4의 neurosphere를을 떼어 놓다. 너무 빨리 기포 형성이 세포 사멸을 증가 수 있으므로 아래 피펫하지 마십시오. </li><li> 혈구 세포 수를 계산하고, 24 웰 플레이트의 각 웰에 일차 배양 상등액 250 ㎕의 800 세포 / μL를 배포한다. </li><li> 각 웰에 Z-조건 매체의 250 μl를 추가합니다. </li><li> 단계 4.2에보고 된 체외에서 이일 (DIV2) 한 후, 배양 된 세포를 확장D 4.3. </li></ol> 기본 neurosphere를 6. 차별화 <ol><li> 10 분 동안 70 % 에탄올에 침지하여 커버 유리를 소독, 12 웰 플레이트의 각 웰에 그들을 배치하여 실온에서 건조 후 커버 유리. </li><li> 그것은 넓게 확장하여 전체 커버 유리를 커버 할 수있는 방식으로, 커버 유리의 중앙에 세포 외 코팅액 (단계 1.11) 300 μL를 추가한다. 이어서, (습한 세포 배양기를 사용하여)을 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 배양 후 세포 코팅액을 제거하고 37 ℃에서 2 시간 동안 커버 유리를 건조. </li><li> 각 우물에서 조직 배양 250 μl를 제거합니다. 기계적로 pipetting 아래로 (넓은 엔드 팁) 1 ml를 피펫으로 잘 따라 모든 DiV4 차 neurosphere를을 떼어 놓다. </li><li> 종자는 미리 제조 외 기질 코팅 coverglasses 4 × 103 세포 / ml의 세포 밀도 (6.1-6 단계에서 neurosphere 세포 현탁액 해리.3) 기판에 부착 될 때까지, 5 % CO 2, 30 ℃에서 적어도 30 분 동안 유지한다. 이어서, 배지를 제거하고 빠르게 5 % CO 2에서 30 ° C에서 24 시간 동안 세포를 배양하기 전에 예열 신선한 Z 분화 조건 배지 (단계 1.9) 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 모든 이틀, 세포 분화의 시간 동안 Z-분화 조건 매체의 절반을 교체합니다. </li></ol> 기본 neurosphere를 7. 유전자 조작 <ol><li> 4 ° C에서 80 x g에서 8 분 동안 원심 분리하여 DiV3-4 차 neurosphere를 (단계 4.3)를 수집합니다. 상업 oligonucleoatides의 리포좀 형질 전환 준비는 previouly 11 DNA 플라스미드 벡터의 nucleo - 형질을 설명했다. </li><li> 반응 혼합물의 100 μL (82 μL의 nucleofactor 용액 보충 18 μL)에 4 × 103 세포 / μL의 세포 밀도로 재현 탁의 neurosphere 펠릿. </li><li> neurosphere의 suspensi 믹스(1 μg의 / μL에서 플라스미드 주식) 선택의 DNA 플라스미드 벡터의 5 μL와 함께합니다. nucleotransfection에 대한 nucleofector 큐벳에 neurosphere / DNA 혼합물을 전송하고 nucleofector 키트에서 제공하는 제조업체의 지침에 따라 프로그램을 nucleofector 선택합니다. </li><li> 즉시 nucleofection 후, 균체를 예열 Z 조건 배지 (1.10) 500 ㎖를 추가하고 전술 한 바와 같이, 이들 세포 재생 및 / 또는 분화 특성을 연구 형질 neurosphere를 플레이트. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

이 프로토콜의 주요 목표는 신​​경 줄기 / 전구 세포의 세포 및 분자 기능 연구를위한 분리 및 배양 성인 zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를하는 것입니다. 여기, 우리는 성인 zebrafish의 뇌에서, 다 능성 신경 세포를 선택하고 세 개의 신경 세포 유형, 즉, 성상 세포, 신경 세포 및 희소 돌기 아교 세포를 생성하는 방법을보고합니다. 재현성 neurosphere 형성 분석은 지금까지 제브라 피쉬 년에 설립?...

포유류 신경줄 기세포 (NSCs의)는 neurosphere를 1이라 세포의 클러스터로 분할 부동성 배양에서 성장하는 능력에 의해 시험 관내에서 특성화되었다. 표피 성장 인자 (EGF) 및 섬유 아세포 성장 인자 (FGF)의 존재하에 NSCs의 자기 갱신 NSCs을 생성하기 위해 하나 대칭 분할 또는 비대칭 적으로 서로 다른 두 딸 세포를 생성하는 예., 미분 전구 세포 및 신규 NSC. Neurosphere 문화 따라서 신경 줄기 / 전구 세포보다 분화 된 신경 세포 2-4의 혼합물이다 NSCs을하지만,이 특정 속성에 의해 다른 neurosphere 세포 유형을 구별 할 수 있습니다. 그들은 자유에 장기 자기 갱신을 표시 문화 부동 그들은 세포 외 매트릭스 기판에 성장 인자의 철수 및 부착 다음 모든 신경 세포 계통 (즉, 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포)로 분화 할 수 있습니다. mamm에서ALS, neurosphere 배양 시스템은 성인 뇌 NSCs의 존재를 입증하는 데 사용되는 제 관내 시스템이고 증식자가 재생 능력과 신경 줄기 세포 및 선조 세포의 다 능성을 분석하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 도구가 남아있다. 따라서, 구 형성 분석법 단점과 한계 4 고통에도이 배양 시스템은 생체 내 틈새 (4)로부터 제거되어 키 레귤레이터 식별 쓸모 때 줄기 세포처럼 행동하는 세포의 잠재력을 평가하는데 유용 NSC 자기 갱신과 세포 운명 결정 5-7의. 성인 신경 제한된 포유류 달리 지브라 피쉬는 구조적 그들의 수명 동안 뇌 전체 축을 따라 새로운 뉴런을 생성한다. 제브라 피쉬 성인의 뇌는 t을 이해하기위한 제브라 피쉬에게 강력한 모델 생물을 신경 줄기 / 전구 세포를 품고 여러 신경 인성 틈새를 표시그 세포는 뇌 활동뿐만 아니라 중추 신경계 재생을위한 필요한 분자 프로그램 줄기. 지난 십칠년 동안 여러 연구 그룹은 분리하고 제브라 피쉬의 신경 세포 8,9 배양을위한 방법론을 개발했다. 이 연구는 배아 신경 세포 및 생체 외에서 아교 세포를 생산을 목표로,하지만 NSCs을 유지하고 그들의 특성을 조사하고 있었다. neurosphere를가 성인 Apteronotus의 leptorhynchus (브라운 유령 Knifefish) (10)에서 생성되었지만, 제브라 피쉬의 neurosphere 형성 분석은 설정 될 남아 있었다. 여기에서 우리는 제브라 피쉬의 신경 (11) 동안은 miR-107의 역할을 설명하기 neurosphere 형성 분석을 설명합니다. 프로토콜은 수 1) 지브라 피쉬 뇌 전체에서 또는 telencephalon, tectum 및 소뇌 여러 해부 뇌 영역에서 어느 성인 신경 줄기 / 선조 세포의 수집; FL 2) 생성oating 성인 신경 줄기 / 전구 세포의 자기 갱신 neurosphere를; 3) 하향과 상향 조정 코딩하는 유전자 또는 작은 비 코딩 RNA를 neurosphere를 11의 표현의 순서는 신경 줄기 / 전구 세포의 증식 및 분화에서의 역할을 조사합니다.

<table><tbody><tr><td>DPBS 1x</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C6852-25g</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2 supplement (100x) liquid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td>1 M</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose 45%&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&amp;nbsp;100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500-50 mg</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DN25-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Papain&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>PFA&amp;nbsp;</td><td>TCI</td><td>P0018</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>AmericanBio</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS-222</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>stock solution of 4 mg/ml.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trycold gel&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>TGP8</td><td>gel pack</td></tr><tr><td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

성인 Zebrafish의 Neurosphere 문화 일반 계획 여기에서 우리는 성인 zebrafish의 뇌에서 수행 neurosphere 형성 분석의 프로토콜의 모든 단계를 설명합니다. 첫째, 성인 신경 줄기 / 전구 세포는 제브라 피쉬의 뇌 전체에서 또는 telencephalon, tectum 및 소뇌 (도 1A-C) 등 여러 가지 해부하는 뇌 영역에서 하나 수집하고 있습니다. 성...

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Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.9K 조회수.  Yale University.  여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다. 

비디오: Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

연구

신경과학

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

발생학

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the differentiation and proliferation potential of neural stem cells, as well as to generate cell lines than can be assayed over time. Also, neurospheres can create a niche (in vitro) that allows the modeling of the dynamic changing environment, such as varying growth factors, hormones, neurotransmitters, among others. Microtus ochrogaster (prairie vole) is a unique model for understanding the neurobiological basis of socio-sexual behaviors and social cognition. However, the cellular mechanisms involved in these behaviors are not well known. The protocol aims to obtain neural progenitor cells from the neurogenic niches of the adult prairie vole, which are cultured under non-adherent conditions, to generate neurospheres. The size and number of neurospheres depend on the region (subventricular zone or dentate gyrus) and sex of the prairie vole. This method is a remarkable tool to study sex-dependent differences in neurogenic niches in vitro and the neuroplasticity changes associated with social behaviors such as pair bonding and biparental care. Also, cognitive conditions that entail deficits in social interactions (autism spectrum disorders and schizophrenia) could be examined.

We established the conditions to culture neural progenitor cells from the subventricular zone and dentate gyrus of the adult brain of prairie voles, as a complementary in vitro study, to analyze the sex-dependent differences between neurogenic niches that could be part of functional plastic changes associated with social behaviors.

성인 프레리 볼레스의 신경질성 틈새에서 파생된 신경구 의 문화

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

<meta charset="utf8"></head><body>쥐 뇌실하 영역에서 분리된 NSC의 효율적인 핵 분석

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Improved Nucleofection for High-Efficiency Gene Delivery in Murine Subventricular Zone-Derived Neural Stem Cell Cultures

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Generation and Differentiation of Primary Neurospheres from Zebrafish Neural Stem Cells

Source: Lopez-Ramirez, M. A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53617">Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the generation and differentiation of primary neurospheres. Neural stem cells from zebrafish, in the presence of growth factors, proliferate into free-floating neurospheres with self-renewal capacity, which later differentiate into glial cells and neurons.

Generation and Differentiation of Primary Neurospheres from Zebrafish Neural Stem Cells(제브라피시 신경 줄기세포에서 1차 신경구의 생성과 분화)

1. Preparations

	Prepare 10 ml of dissection medium, and add 200 &#181;l of 100x penicillin-streptomycin into 9.8 ml of Dulbecco&#39;s Modified Eagle ...

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

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절연 및 Neurosphere 어세를 사용하여 성인 마우스 신경 줄기 세포의 확장

문화와 Zebrafish 기본 세포의 Transfection

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

절연 및 애벌레 Zebrafish 두뇌에서 신경 세포, 대 식 세포 및 Microglia RNA 추출

성인 프레리 볼레스의 신경질성 틈새에서 파생된 신경구 의 문화

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Generation and Differentiation of Primary Neurospheres from Zebrafish Neural Stem Cells(제브라피시 신경 줄기세포에서 1차 신경구의 생성과 분화)