The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

Peixe-zebra da estirpe WT CF foram criados e mantidos de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê da Universidade Yale Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC número de protocolo 2012-11473). Todos os experimentos deve primeiro ser aprovado por todos ética governamentais e institucionais relevantes órgãos reguladores em relação ao uso de animais para fins de investigação. 1. Preparações <ol><li> Preparar 10 ml de meio de dissecção, adicionar 200 ul de 100x penicilina-estreptomicina em 9,8 ml de DMEM / F12. </li><li> Preparar solução de L-cisteína: a 10 ml de água para cultura de tecidos, adicionar 120 mg de L-cisteína. Guardar a solução de L-cisteína a 4 ° C durante até 2 semanas, ou em alíquotas a -20 ° C durante até 1 ano. </li><li> Preparar solução de ADNase I: a 1 ml de água para cultura de tecidos, adicionam-se 10 mg de ADNase I. loja a solução de ADNase I a 4 ° C durante até 2 meses. </li><li> Preparar solução de papaína: a preparar papaína solutião, adiciona-se 100 ul de papaina (cerca de 140 unidades), 100 ul de DNase I (1%) e 200 ul de L-cisteina (12 mg / ml) em 5 ml de DMEM / F12. Recentemente preparar a solução de papaína de cada vez e esterilizar com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um antes da utilização. </li><li> Preparar a solução de lavagem: para preparar 100 ml de solução de lavagem, adicionar 650 ul de glucose 45%, 500 mL de HEPES 1 M e 5 ml de FBS em 93,85 ml de DPBS 1x. Esterilizar a solução de lavagem com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um antes da utilização. Guardar a solução de lavagem a 4 ° C durante até 2 meses. </li><li> Preparar a solução de insulina: para preparar a 2 ml de solução de insulina, adicionar uma gota de 25 ul de NaOH 10 N e 100 mg de insulina em 2 ml de água para cultura de tecidos. </li><li> Preparar soluções de EGF e FGF: Dissolve-se ambos os agentes mitogénicos em meio DMEM / F12 a 100 ug / ml de concentração. Loja como alíquotas de 10 uL a -20 ° C. </li><li> Prepare meios B-27 e N-2: B-27 e N-2 suplementos armazenar a -20 ° C, tal como 500 ul de aliquotas de 1 mL e, respectivEly. </li><li> Prepare forma condição de Z-diferenciação: para preparar 100 ml de meio condicionado Z-diferenciação, adicionar 40 uL de insulina (50 mg / ml), 500 ul de B-27, 1 ml de N-2, 650 ul de glucose 45% e 1 ml de 100 x penicilina-estreptomicina em 97,81 ml de DMEM / F12. Esteriliza-se o meio condicionado Z-diferenciação com um filtro de tamanho de poro de 0,22 um antes da utilização. Armazenar a forma condição de Z-diferenciação a 4 ° C durante até 1 semana. </li><li> Prepare a forma de Z-condição: para preparar 50 ml de meio de Z-condição, adicionar 10 ul de EGF e 10 ul de FGF-se em 50 ml de meio condicionado-Z diferenciação estéril (20 ng / ml). Armazenar a forma de Z-condição a 4 ° C durante até 1 semana. </li><li> Preparar a solução de revestimento para a cultura de diferenciação: por 5 ml de solução de revestimento extracelular, adicionar 100 ul da solução de matriz extracelular em 4,9 ml de DMEM / F12 (por exemplo, Matrigel.). solução de matriz extracelular Descongelar a 4 ° C em gelo. Uma vez descongelado, manter a 4 ° C para up a 2 semanas. </li></ol> 2. Dissecção do cérebro adulto Zebrafish <ol><li> Prepare uma dissecção cama, preenchendo um 100 milímetros x 15 mm placa de Petri com pacotes de gelo gel. Em seguida, colocar a tampa no prato de petri e incubar à temperatura de -20 ° C até o congelamento de gel. No topo do lugar da tampa de um quadrado de papel de filtro limpo e envolva tanto o papel de filtro e placa de Petri com filme plástico. </li><li> Limpar e esterilizar todos os instrumentos de microdissecção por 70% de etanol ou de calor antes de cada utilização. Coloque todos os instrumentos de dissecção esterilizados perto do microscópio de dissecação e, logo antes da eutanásia, colocar a cama dissecção sob o microscópio com iluminação de fibra óptica. </li><li> Recolha 2 peixe-zebra adulto para uma preparação neurosphere cérebro inteiro; e 3 a 4 para gerar peixes-zebra a partir de neuroesferas regiões cerebrais dissecados. </li><li> Eutanásia peixe-zebra adulto (8-12 meses de idade) usando um protocolo aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal. Em seguida, mergulhe o peixe em 75% de etanol durante 5-10 segundos e rapidamente colocar na cama dissecção seguido por decapitação ao nível das brânquias utilizando uma lâmina cirúrgica. <ol><li> A eutanásia animais, administrar uma dose excessiva (300 mg / L) de metano-sulfonato tricaina até do animal batida de coração desacelera gradualmente para baixo e a circulação pára, em seguida, mergulhar em água gelada. </li></ol></li><li> Vire o lado da cabeça dorsal para baixo, e usando a tesoura fazer um corte longitudinal do lado do corte na boca. Usando fórceps expor a base do crânio e remover todo o tecido adjacente. Corte as paredes laterais do crânio a partir do início da medula espinal para o tectum. </li><li> Usando a tesoura, cortar e remover os nervos ópticos e, em seguida, remover ambos os lados da parte mais lateral do crânio no nível do tectum. Vire a cabeça ventral para cima. Utilizando uma pinça, retire o resto da parte mais apical do crânio. </li><li> Transferir o cérebro, juntamente com a parte restante do crânio para um novo prato with o meio dissecção (1,1). Limpar o tecido cerebral, a médio dissecção usando cabo de plástico no micro da faca, mantendo todas as estruturas do cérebro intacto. </li><li> A partir deste ponto, continuar o protocolo utilizando todo o cérebro de peixe zebra. <ol><li> Alternativamente adaptar este protocolo para regiões específicas do cérebro para gerar neurospheres de toda cérebro de peixe zebra ou do telencéfalo, tectum / diencephalon ou cerebelo dissecados com um bisturi fresco. Use uma linha fluorescente específica neural peixe-zebra transgénicos neural para dissecar a região do cérebro de interesse de acordo com a Figura 3 e referência 11. </li></ol></li></ol> 3. A dissociação de células individuais de cérebro adulto <ol><li> Executar todo o trabalho subsequente em uma cabine de segurança biológica. Transferir o tecido cerebral em um tubo de 1,5 mL contendo 800 uL de meio de dissecção (preparado no passo 1.1). Remover o meio de dissecção por pipetagem, sem tocar no tecido cerebral. </li><li>Adicionar 500 ul de solução de papaína (passo 1.4) e digerir o tecido do cérebro a 37 ° C durante 10 min. Não incubar mais de 15 min, uma vez que pode diminuir a viabilidade celular. </li><li> Após a incubação, a transferência do tecido cerebral com 500 ul da solução de papaína em um tubo de 15 ml usando um 1000 ul corte na ponta da pipeta ~ 0,25 polegadas a partir do fundo. Gentilmente dissociar o tecido cerebral lentamente pipetando para cima e para baixo 10 vezes com a mesma ponta. Não pipetar para cima e para baixo mais de 15 vezes e não gerar bolhas de ar durante esta etapa, uma vez que poderia alterar a viabilidade celular. </li><li> Incubar o tecido cerebral de novo a 37 ° C durante 10 min, seguido por pipetagem para cima e para baixo 10-13 vezes utilizando um sem cortes 1.000 ul ponta regular. Não pipetar cima e para baixo mais de 15 vezes, para evitar a morte celular. </li><li> Parar a digestão enzimática por adição de 2 ml de solução de lavagem (passo 1.5), e centrifuga-se a suspensão de células a 800 xg durante 5 min à temperatura ambiente (TA). Decantar cuidadosamente as supernatant e ressuspender o sedimento na solução remanescente batendo o tubo vigorosamente com um dedo e, em seguida, pipetando para cima e para baixo com um 1.000 ul ponta regular. Em seguida, adicionar 2 ml de solução de lavagem. </li><li> Nesta fase, verificar ao microscópio, que foi obtida uma suspensão de células individuais. Centrifugar novamente a suspensão de células a 800 xg durante 5 min à TA. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet utilizando 1 mL de meio de Z-condição fresca (passo 1.10). </li><li> Células mancha usando azul de tripano 12 e contar as células vivas usando um hemocitômetro por exclusão de células mortas azuis. Prepara-se uma placa de 24 poços com 200 ul de suspensão de células e 300 ul de meio-Z condição fresca em cada poço. Semear as células a uma densidade de ~ 500 células / mL. Manter as células em cultura numa incubadora a 30 ° C em 5% de CO 2, uma vez que neuroesferas derivadas do cérebro de peixe-zebra não crescem bem a 37 ° C. </li></ol> 4. Geração de Primary neuroesferas &lt;/ P&gt; <ol><li> Após 1 dia in vitro (Div1), observar a suspensão de células individuais obtidas a partir de todo o cérebro adulto sob o microscópio e observar se os detritos se acumulou no centro do poço. Cuidadosamente remover quaisquer detritos por pipetagem de aproximadamente 100 ul de meio (menos, se possível). Em seguida, adicione 100 ml de meio de Z-condição fresco. As suspensões de células individuais deve ser observado neste momento (Figura 2A Div1). </li><li> Após 2 dias in vitro (Div2), expandir-se as células em cultura. Usando uma pipeta de 1000 uL com o corte da ponta, recolher e transferir 250 ul de suspensão de células de cada poço para um poço novo. Adicionar 250 mL de meio Z-condição fresco em todos os poços. Antes de expandir as células cultivadas, homogeneizar a suspensão muito suavemente pipetando cima e para baixo durante todo o bem. </li><li> Repita os passos 4.1 e 4.2 para os seguintes 4 dias in vitro (DiV4). Um aumento progressivo do tamanho do neurospheres deve ser visível no centro e nas extremidades do poço a Div3 e DiV4 (Figura 2B e C). Nota: neurospheres primárias podem ser processados ​​para a passagem ou diferenciação para avaliar multipotency. Alternativamente, eles podem ser processados ​​para nucleofection ou lipo-transfecção de 11 a caracterizar o papel de genes específicos durante o processo de diferenciação. </li></ol> 5. Passaging da Primária neuroesferas <ol><li> Retirar 250 ul de cultura de tecidos de cada poço e mecanicamente dissociar DiV4 neuroesferas com uma pipeta de 1 ml. Não pipetar cima e para baixo muito rapidamente como a formação de bolhas de ar podem aumento da morte celular. </li><li> Contar as células com um hemocitómetro e distribuir 800 células / uL em 250 uL de sobrenadante de cultura primária em cada poço de uma placa de 24 poços. </li><li> Adicionar 250 ul de meio de Z-condição para cada poço. </li><li> Após 2 dias in vitro (Div2), expandir-se as células em cultura como relatado no passo 4.2 umad 4.3. </li></ol> 6. Diferenciação de neuroesferas primária <ol><li> Esterilizar vidros de cobertura por imersão em etanol a 70% durante 10 min, vidros de cobertura, em seguida, seco à temperatura ambiente, colocando-os em cada poço de uma placa de 12 poços. </li><li> Adicionar 300 ul de solução de revestimento extracelular (passo 1.11) no centro da tampa de vidro, de tal maneira que possa expandir amplamente e abrange todo o vidro de cobertura. Em seguida, incuba-se a 37 ° C durante 1 h (utilizando a cultura de células incubadora humidi ficada). </li><li> Remover a solução de revestimento extracelular após a incubação, e seca-se a tampa de vidro durante 2 horas a 37 ° C. </li><li> Retirar 250 ul de cultura de tecido a partir de cada poço. Mecanicamente dissociar todos os DiV4 neurospheres primários por poço com uma pipeta de 1 ml (com ponta mais larga-end) por pipetagem cima e para baixo. </li><li> Semente dissociado suspensões de células de neuroesferas com uma densidade celular de 4 x 10 células / 3 mL em esfregaços revestidos de matriz extracelulares previamente preparados (passo 6,1-6.3) e manter durante pelo menos 30 min, a 30 ° C em 5% de CO2, até ligada ao substrato. Em seguida, remover o meio de cultura e adiciona-se rapidamente 1 ml de meio fresco condição de Z-diferenciação de pré-aquecido (passo 1.9), antes da cultura das células durante 24 h a 30 ° C em 5% de CO 2. </li><li> De dois em dois dias, substituir metade do meio condição de Z-diferenciação durante o tempo de diferenciação celular. </li></ol> 7. Gene Manipulação de Primary neuroesferas <ol><li> Recolhe DiV3-4 neuroesferas primárias (Passo 4.3) por centrifugação durante 8 min a 80 x g a 4 ° C. Prepare-se para transfecção de lipossomas de oligonucleoatides comerciais como previouly descrito 11 ou nucleo-transfecção de vectores de plasmídeo de DNA. </li><li> Ressuspender o granulado neuroesfera a uma densidade celular de 4 x 10 3 células / uL em 100 uL de uma mistura reaccional (solução nucleofactor 82 ul e 18 ul de complemento). </li><li> Misture a suspensi neuroesferacom 5 ul de plasmídeo de ADN dos vectores de escolha (stocks de plasmídeo a 1 ug / uL). Transferir a mistura neuroesfera / ADN numa cuvete para Nucleofector nucleotransfection e seleccionar Nucleofector programa de acordo com as instruções do fabricante fornecidas pelo kit Nucleofector. </li><li> Imediatamente após nucleofection, adicionar um volume de 500 ml de meio de Z-condição pré-aquecido (1,10) às células e as neuroesferas placa transfectadas para estudar a sua renovação celular e / ou propriedades de diferenciação, tal como descrito acima. </li></ol>

<ol>
	<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+isolation+and+characterization.">Neural stem cell isolation and characterization.</a> Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Winter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+stem+cell+segmentation,+tracking+and+lineaging+with+validation+and+editing.">Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing.</a> Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+derived+from+early+zebrafish+embryos+differentiate+in+vitro+into+neurons+and+astrocytes.">Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes.</a> Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio).</a> PloS one. 8, e57539 (2013).</li><li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Ristori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dicer-miR-107+interaction+regulates+biogenesis+of+specific+miRNAs+crucial+for+neurogenesis.">A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis.</a> Dev Cell. 32, 546-560 (2015).</li><li>Louis, S. K., SIegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Analysis+Using+Trypan+Blue:+Manual+and+Automated+Methods.">Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods.</a> Methods Mol Bio. 740, (2011).</li><li>Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+view+of+development.">A CRISPR view of development.</a> Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

O principal objectivo deste protocolo é o de isolar e cultivar peixe-zebra adulto neurospheres derivado do cérebro para estudar as características celulares e moleculares de células estaminais / progenitoras neurais. Aqui, nós relatamos como selecionar células neurais multipotentes e gerar os três tipos de células neurais, ou seja, astrócitos, neurônios e oligodendrócitos, a partir do cérebro de peixe zebra adulta. O protocolo é altamente significativo uma vez que um ensaio de formação de neurosp...

As células estaminais neurais de mamífero (NCCC) foram caracterizados in vitro pela sua capacidade para crescer em culturas de livre flutuação como aglomerados de células neuroesferas 1 denominadas dividindo. Na presença de factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), NSC dividir quer simetricamente para gerar NSC auto-renovação, ou assimetricamente para gerar duas células filhas diferentes, ie., Uma célula progenitora de diferenciação e um romance NSC. Culturas de neuroesferas são, portanto, uma mistura de células estaminais / progenitoras neuronais e células neurais diferenciadas mais 2-4 NSC pode, contudo, ser distinguido de outros tipos de células de neuroesferas por duas propriedades específicas:. Eles exibem a longo prazo de auto-renovação em LIVRE culturas flutuante e que podem se diferenciar em todas as linhagens de células neurais (isto é, neurónios, astrócitos, oligodendrócitos e seguintes) retirada de factores de crescimento e adesão a substratos de matriz extracelulares. em mammALS, o sistema de cultura de neuroesferas foi o primeiro sistema in vitro utilizado para demonstrar a presença de NSC no cérebro adulto e mantém-se o instrumento mais vulgarmente utilizado para analisar a proliferação, capacidade de auto-renovação e multipotência de células estaminais e progenitoras neurais. Portanto, embora os ensaios de formação de esfera sofrem de algumas desvantagens e limitações 4, este sistema de cultura é valiosa para a avaliação do potencial de uma célula a comportar-se como uma célula estaminal quando removido do seu nicho in vivo 4 e tem contribuído para identificar reguladores chaves de NSC de auto-renovação e destino celular determinação 5-7. Em contraste com os mamíferos que a neurogênese adulta limitados, peixe-zebra constitutivamente produzir novos neurônios ao longo de todo o eixo cérebro durante toda a sua vida. O cérebro de peixe zebra adulto exibe vários nichos neurogênicos abrigar células estaminais neuronais / progenitoras que fazem zebrafish um modelo poderoso organismo para a compreensão tEle stem a actividade de células no cérebro, bem como os programas molecular necessários para a regeneração do sistema nervoso central. Ao longo dos últimos 17 anos, vários grupos de pesquisa desenvolvida metodologias para o isolamento e cultura de células neurais zebrafish 8,9. Esses estudos tiveram como objetivo produzir neuronal embrionário e células gliais in vitro, mas não a manutenção NSCs e investigar suas propriedades. Embora neuroesferas foram gerados no adulto Apteronotus leptorhynchus (Brown fantasma knifefish) 10, um ensaio de formação de neuroesfera no peixe-zebra manteve-se a ser estabelecida. Descrevemos aqui um ensaio de formação de neuroesfera para demonstrar o papel de miR-107 durante 11 neurogénese peixe-zebra. O protocolo permite que: 1) a coleta de células-tronco / progenitoras neurais adultas quer a partir do cérebro inteiro peixe-zebra ou de várias regiões cerebrais dissecados como o telencéfalo, a tectum, eo cerebelo; 2) a produção de FLflutuante e neurospheres auto-renovação das células-tronco / progenitoras neurais adultas; 3) a jusante e a sobre-regulação da expressão de genes que codificam ou pequenos RNAs não-codificantes nas neuroesferas 11, a fim de investigar o seu papel na proliferação e diferenciação de células estaminais / progenitoras neurais.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 supplement (100x) liquid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose 45%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500-50 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA&#160;</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB11072-04000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td>stock solution of 4 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trycold gel&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TGP8</td>
			<td>gel pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPI-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Esquema geral da Neurosphere Cultura Zebrafish Adulto Descrevemos aqui todos os passos do protocolo de um ensaio de formação de neuroesfera realizada a partir do cérebro de peixe zebra adultos. Primeiro, as células estaminais / progenitoras neuronais adultas foram recolhidos quer a partir de cérebro inteiro de peixe-zebra ou a partir de várias regiões do cérebro tais como o dissecados telencéfalo, tectum e o cerebelo ...

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Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Aqui é proporcionado um método reprodutível para estudar a neurogénese adulto utilizando um ensaio neuroesfera derivado de todo o cérebro ou a partir de qualquer telencefálicos tectal ou regiões do cerebelo do cérebro adulto peixe-zebra. Além disso, descreve-se o procedimento para manipular a expressão de genes em neuroesferas de peixe-zebra.

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K visualizações.  Yale University.  Aqui é proporcionado um método reprodutível para estudar a neurogénese adulto utilizando um ensaio neuroesfera derivado de todo o cérebro ou a partir de qualquer telencefálicos tectal ou regiões do cerebelo do cérebro adulto peixe-zebra. Além disso, descreve-se o procedimento para manipular a expressão de genes em neuroesferas de peixe-zebra. 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Biologia do Desenvolvimento

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

Isolamento e Expansão da mediana Canino hipocampo Neurais Precursores

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Preparação e cultivo de células precursoras Miogênica / mioblastos primárias de músculo esquelético de Adulto e Idoso Humanos

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Isolamento, cultura e diferenciação de células do estroma da medula óssea e osteoclasto progenitores dos ratos

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

O isolamento e a cultura de células primárias de Epicárdica derivado de espécimes de coração adulto e Fetal humano

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

SiRNA Nanoparticle-mediada-silenciamento no coração de Zebrafish adulto

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...