The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

Zebrafish del ceppo WT CF sono state sollevate e mantenuto secondo protocolli approvati dal Comitato Yale University Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC numero di protocollo 2.012-11.473). Tutti gli esperimenti devono essere prima approvati da ogni etica governativi e istituzionali applicabili in materia organi per quanto riguarda l&#39;uso di animali per scopi di ricerca. 1. preparati <ol><li> Preparare 10 ml di terreno dissezione, aggiungere 200 ml di 100x penicillina-streptomicina in 9,8 ml di DMEM / F12. </li><li> Preparare la soluzione L-cisteina: a 10 ml di acqua per colture di tessuti, aggiungere 120 mg di L-cisteina. Conservare la soluzione L-cisteina a 4 ° C per 2 settimane, o in aliquote a -20 ° C fino a 1 anno. </li><li> Preparare DNasi soluzione: 1 ml di acqua per colture di tessuti, aggiungere 10 mg di DNasi I. Conservare la soluzione che DNasi a 4 ° C per un massimo di 2 mesi. </li><li> Preparare la soluzione papaina: per preparare papaina solution, aggiungere 100 microlitri papaina (circa 140 unità), 100 microlitri DNasi I (1%) e 200 microlitri L-cisteina (12 mg / ml) in 5 ml di DMEM / F12. Appena preparare la soluzione papaina ogni volta e sterilizzare con un filtro con pori di 0,22 micron prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio: preparare 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 650 ml di glucosio al 45%, 500 microlitri HEPES 1 M e 5 ml FBS in 93.85 ml DPBS 1x. Sterilizzare la soluzione di lavaggio con un filtro con pori di 0,22 micron prima dell&#39;uso. Conservare la soluzione di lavaggio a 4 ° C per 2 mesi. </li><li> Preparare la soluzione di insulina: per preparare 2 ml di soluzione di insulina, aggiungere una goccia 25 ml di NaOH 10 N e 100 mg di insulina in 2 ml di acqua per coltura di tessuti. </li><li> Preparare soluzioni EGF e FGF: sciogliere due mitogeni in DMEM / F12 a 100 mg di concentrazione / ml. Store come 10 aliquote microlitri a -20 ° C. </li><li> Preparare supporti B-27 e N-2: negozio B-27 e N-2 integratori a -20 ° C in 500 microlitri e 1 ml aliquote, respectively. </li><li> Preparare Z-differenziazione condizioni medie: per preparare 100 ml di Z-differenziazione condizioni medie, aggiungere 40 ml di insulina (50 mg / ml), 500 microlitri B-27, 1 ml N-2, 650 microlitri di glucosio 45% e 1 ml di 100 x penicillina-streptomicina in 97.81 ml di DMEM / F12. Sterilizzare medio condizione di Z-differenziazione con un filtro con pori di 0,22 micron prima dell&#39;uso. Conservare il supporto di condizione di Z-differenziazione a 4 ° C per un massimo di 1 settimana. </li><li> Preparare Z-condizioni medie: per preparare 50 ml di Z-condizione media, aggiungere 10 ml di EGF e 10 ml di FGF in 50 ml di sterile condizione di Z-differenziazione di media (20 ng / ml). Conservare il supporto di Z-condizione a 4 ° C per un massimo di 1 settimana. </li><li> Preparare la soluzione di rivestimento per cultura differenziazione: per 5 ml di soluzione di rivestimento extracellulare, aggiungere 100 microlitri della soluzione di matrice extracellulare in 4,9 ml di DMEM / F12 (ad esempio, Matrigel.). Scongelare soluzione matrice extracellulare a 4 ° C su ghiaccio. Una volta scongelato, mantenere a 4 ° C per up per 2 settimane. </li></ol> 2. La dissezione del cervello adulto Zebrafish <ol><li> Preparare una dissezione letto riempiendo da 100 mm x 15 mm piastra di Petri con confezioni di gel di ghiaccio. Poi posto il coperchio sulla capsula di Petri e incubare a -20 ° C fino congela gel. In cima al posto coperchio un quadrato di carta filtro pulito e avvolgere sia il filtro con capsula di Petri con film plastico. </li><li> Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti di microdissezione del 70% di etanolo o di calore prima di ogni utilizzo. Mettere tutti gli strumenti di dissezione sterilizzati vicino al microscopio da dissezione e, appena prima l&#39;eutanasia, posizionare il letto dissezione al microscopio con illuminazione a fibre ottiche. </li><li> Raccogliere 2 zebrafish adulto per tutta la preparazione neurosfere cervello; e da 3 a 4 zebrafish per generare neurosfere da regioni del cervello sezionati. </li><li> Euthanize zebrafish adulti (8-12 mesi) utilizzando un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale cura e l&#39;uso di animali. Avanti, immergere il pesce in 75% di etanolo per 5-10 secondi e rapidamente pongono nel letto dissezione seguita da decapitazione a livello delle branchie con una lama chirurgica. <ol><li> Per l&#39;eutanasia degli animali, somministrare una dose eccessiva (300 mg / L) di tricaine metanosolfonato fino battito cardiaco dell&#39;animale rallenta gradualmente e la circolazione si ferma, poi immergere in acqua ghiacciata. </li></ol></li><li> Ruotare lato testa dorsali giù, e utilizzando le forbici un taglio longitudinale dal lato tagliato alla bocca. Utilizzando la pinza esporre la base del cranio e rimuovere tutto il tessuto adiacente. Tagliare le pareti laterali del cranio dall&#39;inizio del midollo spinale verso il tectum. </li><li> Utilizzando le forbici, tagliare e rimuovere i nervi ottici e quindi rimuovere entrambi i lati della parte più laterale del cranio a livello della tectum. Girare la testa ventrale verso l&#39;alto. Utilizzando pinze, staccare il resto della parte apicale del cranio. </li><li> Trasferire il cervello insieme alla parte rimanente del cranio in un nuovo piatto with medio dissezione (1.1). Pulire il tessuto cerebrale nel medio dissezione con manico in plastica micro del coltello, mantenendo intatte tutte le strutture del cervello. </li><li> Da questo punto, continuare il protocollo utilizzando l&#39;intero cervello zebrafish. <ol><li> In alternativa adattare questo protocollo a regioni specifiche del cervello per generare neurosfere da tutto il cervello zebrafish o dal telencefalo, tectum / diencefalo o cervelletto sezionato con un bisturi fresca. Utilizzare una fluorescente zebrafish linea transgenica neurale specifica neurale per sezionare la regione del cervello di interesse secondo la figura 3 e riferimento 11. </li></ol></li></ol> 3. cellulare dissociazione unico del cervello adulto <ol><li> Eseguire tutti i successivi lavori in un armadio di sicurezza biologica. Trasferire il tessuto cerebrale in una provetta da 1,5 ml contenente 800 ml di media dissezione (preparata al punto 1.1). Rimuovere il mezzo di dissezione pipettando, senza toccare il tessuto cerebrale. </li><li>Aggiungere 500 ml di soluzione di papaina (passo 1.4) e digerire il tessuto cerebrale a 37 ° C per 10 min. Non incubare più di 15 min come potrebbe diminuire la vitalità cellulare. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, trasferire il tessuto cerebrale con 500 microlitri della soluzione di papaina in un tubo da 15 ml con un taglio puntale 1.000 microlitri a ~ 0,25 pollici dal fondo. dissociarsi delicatamente il tessuto cerebrale pipettando lentamente su e giù per 10 volte con la stessa punta. Non pipettare su e giù più di 15 volte e non generano bolle d&#39;aria durante questa fase, in quanto potrebbe alterare la vitalità cellulare. </li><li> Incubare nuovamente il tessuto cerebrale a 37 ° C per 10 minuti seguiti da pipettando su e giù 10-13 volte utilizzando un uncut 1.000 microlitri punta regolare. Non pipettare su e giù per più di 15 volte, per evitare la morte delle cellule. </li><li> Arrestare la digestione enzimatica aggiungendo 2 ml di soluzione di lavaggio (passo 1.5), e centrifugare la sospensione cellulare a 800 xg per 5 min a temperatura ambiente (RT). decantare attentamente le supernatant e risospendere il pellet in soluzione rimanente toccando il tubo energicamente con un dito e poi pipettando su e giù con un 1.000 microlitri punta regolare. Successivamente, aggiungere 2 ml di soluzione di lavaggio. </li><li> In questa fase, controllare sotto il microscopio che una singola sospensione cellulare è stata ottenuta. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 800 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 1 ml di fresco Z-condizione media (passo 1.10). </li><li> Cellule Stain utilizzando trypan blu 12 e contare le cellule viventi utilizzando un emocitometro escludendo le cellule morte blu. Preparare un 24-pozzetti con 200 ml di sospensione cellulare e 300 ml di fresco Z-condizione di media in ciascun pozzetto. cellule seme ad una densità di ~ 500 cellule / ml. Mantenere cellule coltivate in un incubatore a 30 ° C in 5% di CO 2, dal momento che zebrafish neurosfere cervello-derivato non crescono bene a 37 ° C. </li></ol> 4. Generazione di primaria Neurosfere &lt;/ P&gt; <ol><li> Dopo 1 giorno in vitro (Div1), osservare la sospensione di cellule singole ottenuti dall&#39;intero cervello adulto al microscopio e osservare se detriti ha accumulato nel centro del pozzo. Rimuovere con cautela eventuali detriti pipettando circa 100 ml di media (meno se possibile). Successivamente aggiungere 100 ml di fresco Z-condizioni medie. Sospensioni singola cella devono essere osservate in questo momento (Figura 2A Div1). </li><li> Dopo 2 giorni in vitro (div2), espandere le cellule in coltura. Usando una pipetta 1000 ml con il taglio punta, raccogliere e trasferire 250 microlitri di sospensione cellulare da ogni pozzetto in un nuovo pozzo. Aggiungere 250 ml di fresco Z-condizione media in tutti i pozzetti. Prima espandendo le cellule coltivate, omogeneizzare la sospensione molto delicatamente pipettando su e giù durante il pozzo. </li><li> Ripetere i punti 4.1 e 4.2 per i seguenti 4 giorni in vitro (DIV4). Un progressivo aumento delle dimensioni del neurosfere dovrebbe essere vibile al centro e bordi del bene div3 e DIV4 (Figura 2B e C). Nota: neurosfere primarie possono essere trattati per il passaggio o la differenziazione di valutare multipotenza. In alternativa, possono essere trattati per nucleofection o lipo-trasfezione 11 per caratterizzare il ruolo di geni specifici durante il processo di differenziazione. </li></ol> 5. Passaging di primaria Neurosfere <ol><li> Togliere 250 ml di coltura di tessuti da ciascun pozzetto e dissociarsi meccanicamente neurosfere DIV4 con una pipetta 1 ml. Non pipettare su e giù troppo rapidamente, come la formazione di bolle d&#39;aria può aumento della morte cellulare. </li><li> Contare le cellule con un emocitometro e distribuire 800 cellule / ml in 250 ml di surnatante coltura primaria in ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Aggiungere 250 ml di Z-condizione media in ciascun pozzetto. </li><li> Dopo 2 giorni in vitro (div2), espandere le cellule coltivate come riportato al passo 4.2 und 4.3. </li></ol> 6. La differenziazione di primaria Neurosfere <ol><li> Sterilizzare vetrini per immersione in etanolo al 70% per 10 min, vetrini coprioggetto poi essiccare a RT ponendoli in ciascun pozzetto di una piastra 12 pozzetti. </li><li> Aggiungere 300 ml di soluzione di rivestimento extracellulare (passo 1.11) al centro del vetro di copertura in modo tale che si può allargare ampiamente e coprire l&#39;intero vetro di copertura. Poi, incubare a 37 ° C per 1 h (utilizzando la umidificato coltura incubatore cellulare). </li><li> Rimuovere la soluzione di rivestimento extracellulare dopo incubazione, e asciugare il vetro di copertura per 2 ore a 37 ° C. </li><li> Togliere 250 ml di coltura di tessuti da ogni pozzetto. Meccanicamente dissociarsi tutti i principali neurosfere DIV4 per bene con una pipetta 1 ml (con punta più ampio-end) pipettando su e giù. </li><li> Seed dissociato sospensioni cellulari neurosfere ad una densità cellulare di 4 x 10 3 cellule / ml su vetrini matrice extracellulare rivestite precedentemente preparati (passo 6.1-6.3) e mantenere per almeno 30 minuti, a 30 ° C in 5% CO 2, fino attaccata al substrato. Poi, rimuovere il terreno di coltura e rapidamente aggiungere 1 ml di fresco Z-differenziazione condizione medio pre-riscaldato (passo 1,9) prima coltivando le cellule per 24 ore a 30 ° C in 5% CO 2. </li><li> Ogni due giorni, sostituire la metà della condizione medio Z-differenziazione durante il tempo di differenziazione cellulare. </li></ol> 7. manipolazione genetica di primaria Neurosfere <ol><li> Raccogliere DiV3-4 neurosfere primarie (passo 4,3) per centrifugazione per 8 minuti a 80 x g a 4 ° C. Preparati per liposomi trasfezione di oligonucleoatides commerciali previouly descritto 11 o nucleo-trasfezione di vettori plasmidici DNA. </li><li> Risospendere neurosfere pellet ad una densità cellulare di 4 x 10 3 cellule / ml in 100 ml di una miscela di reazione (soluzione nucleofactor 82 microlitri e 18 ml di supplemento). </li><li> Mescolare il suspensi neurosferesu con 5 ml di vettori plasmide DNA di scelta (scorte plasmidi a 1 mg / mL). Trasferire il composto neurosfere / DNA in una provetta Nucleofector per nucleotransfection e selezionare Nucleofector programma in base alle istruzioni del costruttore fornite dal kit Nucleofector. </li><li> Subito dopo nucleofection, aggiungere un volume di 500 ml di pre-riscaldato Z-condizioni del supporto (1,10) alle cellule e piastra le neurosfere trasfettate per studiare il rinnovo cellulare e / o differenziazione, come descritto sopra. </li></ol>

<ol>
	<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+isolation+and+characterization.">Neural stem cell isolation and characterization.</a> Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Analysis+Using+Trypan+Blue:+Manual+and+Automated+Methods.">Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods.</a> Methods Mol Bio. 740, (2011).</li><li>Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+view+of+development.">A CRISPR view of development.</a> Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

L&#39;obiettivo principale di questo protocollo è quello di isolare e cultura Zebrafish adulti neurosfere cervello-derivato per studiare le caratteristiche cellulari e molecolari delle cellule staminali / progenitrici neurali. Qui, si segnala come selezionare le cellule neurali multipotenti e generare tre tipi di cellule neurali, cioè, astrociti, oligodendrociti e neuroni, dal cervello zebrafish adulto. Il protocollo è altamente significativo dal momento che un saggio neurosfere di formazione riproducibile n...

Le cellule staminali neurali (NSC) di mammiferi sono stati caratterizzati in vitro per la loro capacità di crescere in colture libero di fluttuare come gruppi di cellule in divisione neurosfere 1 chiamati. In presenza di fattore di crescita epidermico (EGF) e del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF), NSC dividono sia simmetricamente per generare NSCs auto-rinnovamento, o asimmetrico per generare due differenti cellule figlie, vale a dire., Una differenziazione delle cellule progenitrici e un romanzo NSC. Culture neurosfere sono quindi una miscela di cellule staminali / progenitrici neurali e cellule neurali più differenziati 2-4 NSC possono, tuttavia, essere distinti da altri tipi di cellule neurosfere da due proprietà specifiche:. Visualizzano a lungo termine di auto-rinnovamento free- culture galleggiante e possono differenziarsi in tutte le linee cellulari neuronali (ad esempio, neuroni, astrociti, oligodendrociti e) dopo il ritiro di fattori di crescita e di adesione a substrati della matrice extracellulare. in Mammals, il sistema di coltura neurosfere è stato il primo sistema in vitro utilizzato per dimostrare la presenza di cellule staminali neurali nel cervello adulto e rimane lo strumento più comunemente usato per analizzare la proliferazione, la capacità di auto-rinnovamento e multipotenza delle cellule staminali e progenitrici neurali. Pertanto, anche se saggi sfera formante soffrono di alcuni inconvenienti e limitazioni 4, questo sistema di coltura è utile per valutare il potenziale di una cella a comportarsi come una cellula staminale quando viene rimosso dalla sua nicchia in vivo 4 ed è stato determinante nell&#39;identificare regolatori chiave di NSC auto-rinnovamento e il destino delle cellule determinazione 5-7. A differenza di mammiferi che hanno limitato neurogenesi adulta, zebrafish costitutivamente produrre nuovi neuroni lungo l&#39;asse del cervello intero per tutta la loro vita. Il cervello zebrafish adulti visualizza più nicchie neurogena ospitare staminali neurali / cellule progenitrici rendendo zebrafish un potente organismo modello per la comprensione tegli staminali attività delle cellule del cervello e dei programmi molecolari necessari per la rigenerazione del sistema nervoso centrale. Nel corso degli ultimi 17 anni, diversi gruppi di ricerca hanno sviluppato metodologie per l&#39;isolamento e la coltura di cellule neurali zebrafish 8,9. Questi studi avevano lo scopo di produrre neuroni embrionali e le cellule gliali in vitro, ma non a mantenere le cellule staminali neurali e lo studio delle loro proprietà. Anche se neurosfere sono stati generati nell&#39;adulto apteronotus Leptorhynchus (Brown fantasma Knifefish) 10, un saggio neurosfere di formazione nel zebrafish è rimasto da stabilire. Qui si descrive un saggio neurosfere di formazione per dimostrare il ruolo di miR-107 durante la neurogenesi zebrafish 11. Il protocollo consente: 1) la raccolta di cellule staminali / progenitrici neurali adulte sia da zebrafish intero cervello o provenienti da diverse regioni del cervello sezionati come il telencefalo, il tectum, e il cervelletto; 2) la generazione di flottante e neurosfere di auto-rinnovamento da cellule staminali / progenitrici neurali adulte; 3) il down e up-regolazione dell&#39;espressione dei geni codificanti o piccoli RNA non codificanti 11 in neurosfere, al fine di indagare il loro ruolo nella proliferazione e differenziazione delle cellule staminali / progenitrici neurali.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 supplement (100x) liquid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose 45%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500-50 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA&#160;</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB11072-04000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td>stock solution of 4 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trycold gel&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TGP8</td>
			<td>gel pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPI-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Schema generale del Zebrafish adulti neurosfere Cultura Qui si descrivono tutte le fasi del protocollo di un test neurosfere di formazione svolto dal cervello zebrafish adulto. In primo luogo, per adulti cellule staminali / progenitrici neurali sono stati raccolti sia da zebrafish intero cervello o da diverse regioni del cervello sezionati come il telencefalo, il tectum e il cervelletto (Figure 1A-C). Sospensi...

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Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Qui forniamo un metodo riproducibile per esaminare neurogenesi adulta usando un test neurosfere derivato dal cervello intero o sia dal telencefalica, tectal o nelle regioni del cervelletto del cervello zebrafish adulto. Inoltre, si descrive la procedura per manipolare l&#39;espressione genica in neurosfere zebrafish.

Isolamento e la coltura di Neurosfere Zebrafish adulti Brain-derived

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K Views.  Yale University.  Qui forniamo un metodo riproducibile per esaminare neurogenesi adulta usando un test neurosfere derivato dal cervello intero o sia dal telencefalica, tectal o nelle regioni del cervelletto del cervello zebrafish adulto. Inoltre, si descrive la procedura per manipolare l'espressione genica in neurosfere zebrafish. 

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Rene Rigenerazione in Zebrafish adulti da Gentamicina Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

Isolamento ed espansione di Canine Adult Hippocampal neurali Precursori

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Preparazione e la cultura di cellule miogeniche Precursore / mioblasti primari dal muscolo scheletrico di adulti e esseri umani invecchiati

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Cultura di adulti transgenici Zebrafish retina espianti per live-cell imaging per Multiphoton Microscopia

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Isolamento, la cultura e la differenziazione delle cellule stromali del midollo osseo e dei progenitori degli osteoclasti dai topi

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Cultura e transfezione di cellule primarie di Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

Nanoparticelle-mediata siRNA silenziamento genico nel cuore di Zebrafish adulto

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...