The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

Zebrabärbling des Stammes WT CF wurden erhöht und konstant gehalten gemäß Protokollen , die von der Animal Care und Use Committee Institutional Yale University genehmigt (IACUC Protokollnummer 2012-11473). Alle Versuche sollten zunächst von allen relevanten staatlichen und institutionellen Ethik Regulierungsbehörden in Bezug auf die Verwendung von Tieren zu Forschungszwecken zugelassen werden. 1. Vorbereitungen <ol><li> Bereiten Sie 10 ml Dissektion Medium, 200 &amp; mgr; l von 100x Penicillin-Streptomycin in 9,8 ml DMEM / F12. </li><li> Bereiten L-Cystein-Lösung: 10 ml Wasser für die Gewebekultur, fügen 120 mg L-Cystein. Speichern die L-Cystein-Lösung bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen oder in Aliquots bei -20 ° C für bis zu 1 Jahr. </li><li> Bereiten Sie DNase I-Lösung: 1 ml Wasser für die Gewebekultur, mit 10 mg DNase I. Lagern Sie die DNase I-Lösung bei 4 ° C für bis zu 2 Monate. </li><li> Bereiten Sie Papain Lösung: Papain solut vorbereiten100 &amp; mgr; l Papain (etwa 140 Einheiten), 100 &amp; mgr; l DNase I (1%) und 200 &amp; mgr; l L-Cystein (12 mg / ml) in 5 ml DMEM / F12-Ion, hinzuzufügen. Frisch vorbereiten mit einem 0,22 &amp; mgr; m Porengröße Filter vor dem Gebrauch jedes Mal, wenn der Papain-Lösung und sterilisieren. </li><li> Bereiten Waschlösung: 100 ml Waschlösung herzustellen, fügen Sie 650 ul Glucose 45%, 500 ul HEPES 1 M und 5 ml FBS in 93,85 ml DPBS 1x. Sterilisieren Sie die Waschlösung mit einem 0,22 &amp; mgr; m Porengröße Filter vor dem Gebrauch. Speichern die Waschlösung bei 4 ° C für bis zu 2 Monate. </li><li> Bereiten Insulinlösung: 2 ml Insulinlösung herzustellen, fügen einen 25 ul Tropfen 10 N NaOH und 100 mg Insulin in 2 ml Wasser für die Gewebekultur. </li><li> Bereiten EGF und FGF-Lösungen: Man löst beide Mitogene in DMEM / F12 mit 100 ug / ml-Konzentration. Store als 10 &amp; mgr; l Aliquots bei -20 ° C. </li><li> Bereiten B-27 und N-2-Medien: Shop B-27 und N-2 ergänzt bei -20 ° C bis zu 500 &amp; mgr; l und 1 ml Aliquots, JEWEILIGENely. </li><li> Bereiten Z-Differenzierung Zustand Medium: 100 ml Z-Differenzierung Zustand Medium herzustellen, dann werden 40 &amp; mgr; l Insulin (50 mg / ml), 500 ul B-27, 1 ml N-2, 650 &amp; mgr; l Glucose 45% und 1 ml 100 x Penicillin-Streptomycin in 97,81 ml DMEM / F12. Sterilisieren Sie die Z-Differenzierung Zustand Medium mit einem 0,22 &amp; mgr; m Porengröße Filter vor dem Gebrauch. Lagern Sie die Z-Differenzierung Zustand Medium bei 4 ° C für bis zu 1 Woche. </li><li> Bereiten Z-Zustand Medium: 50 ml Z-Zustand Medien vorzubereiten, fügen Sie 10 ul EGF und 10 ul FGF in 50 ml sterile Z-Differenzierung Zustand Medium (20 ng / ml). Lagern Sie den Z-Zustand Medium bei 4 ° C für bis zu 1 Woche. </li><li> Bereiten Sie Beschichtungslösung für die Differenzierung Kultur: 5 ml extrazelluläre Beschichtungslösung, 100 &amp; mgr; l der extrazellulären Matrix - Lösung in 4,9 ml DMEM / F12 (zB Matrigel.). Thaw extrazelluläre Matrix-Lösung bei 4 ° C auf Eis. Einmal aufgetaute halten bei 4 ° C für up bis 2 Wochen. </li></ol> 2. Dissection des Adult cerebra- <ol><li> Bereiten Sie ein, indem ein 100 mm x 15 mm Petrischale mit Gel Eisbeutel Bett Dissektion. Dann legen Sie den Deckel auf die Petrischale und Inkubation bei -20 ° C, bis das Gel gefriert. Auf der Oberseite des Deckels Platz ein Quadrat von sauberen Filterpapier und wickeln sowohl das Filterpapier und Petrischale mit Plastikfolie. </li><li> Reinigen und Sterilisieren alle microdissection Instrumente um 70% Ethanol oder Wärme vor jedem Gebrauch. Legen Sie alle sterilisierten Dissektionsinstrumente in der Nähe des Binokular und direkt vor Euthanasie, legen Sie das Sezieren Bett unter dem Mikroskop mit einer optischen Faserbeleuchtung. </li><li> Sammeln Sie 2 erwachsenen Zebrafisch für ein ganzes Gehirn Neurosphere Vorbereitung; und 3 bis 4 Zebrabärbling Neurosphären aus sezierten Hirnregionen zu erzeugen. </li><li> Euthanize Erwachsenen Zebrabärbling (8-12 Monate alt) ein Protokoll, das von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt werden. Als nächstes tauchen die Fische in 75% Ethanol für 5-10 sec und legen schnell in der Dissektion Bett durch Enthauptung auf der Ebene der Kiemen folgte eine chirurgische Klinge. <ol><li> Um Tiere einschläfern, zu verwalten eine Überdosis (300 mg / l) von Tricaine Methansulfonat, bis der Herzschlag des Tieres allmählich verlangsamt und die Zirkulation stoppt, tauchen dann in Eiswasser. </li></ol></li><li> Drehen Sie den Kopf Rückenseite nach unten und mit der Schere machen einen Längsschnitt von der Schnittseite bis zur Mündung. Mit Hilfe der Zange setzen die Basis des Schädels und entfernen Sie alle angrenzenden Gewebe. Geschnitten, um die Seitenwände des Schädels vom Anfang des Rückenmarks in Richtung des Tectum. </li><li> Mit der Schere, schneiden und die Sehnerven zu entfernen, und entfernen Sie dann beide Seiten der meisten seitlichen Teil des Schädels auf der Ebene des Tectum. Drehen Sie den Kopf Bauchseite nach oben. Mit einer Pinzette, um den Rest der apikalsten Teil des Schädels abzulösen. </li><li> Übertragen, das Gehirn zusammen mit dem restlichen Teil des Schädels in eine neue Schale with die Dissektion Medium (1.1). Reinigen Sie das Hirngewebe in der Dissektion Medium der Mikromesser Kunststoffgriff, wobei alle Hirnstrukturen intakt. </li><li> Von diesem Punkt weiterhin das Protokoll, das die ganze cerebra- verwenden. <ol><li> Alternativ anpassen dieses Protokoll spezifischen Hirnregionen Neurosphären aus ganzen cerebra- oder aus Telenzephalon, Tectum / Dienzephalon oder Cerebellum mit einem frischen Skalpell seziert zu erzeugen. Verwenden Sie ein neuronales spezifische fluoreszierende Zebrabärbling neuronale transgene Linie die Hirnregion von Interesse nach sezieren auf Figur 3 und 11 verweisen. </li></ol></li></ol> 3. Single Cell Dissoziation von adulten Gehirn <ol><li> Führen Sie alle nachfolgenden Arbeiten in einem biologischen Sicherheitsschrank. Übertragen, das Hirngewebe in ein 1,5 ml Röhrchen mit 800 ul Dissektion Medium (hergestellt in Schritt 1.1). Entfernen Sie die Dissektion Medium durch Pipettieren, ohne das Hirngewebe zu berühren. </li><li>Hinzufügen 500 ul Papain-Lösung (Schritt 1.4) und zu verdauen das Hirngewebe bei 37 ° C für 10 min. Nicht brüten mehr als 15 Minuten, da sie die Lebensfähigkeit der Zellen verringern könnte. </li><li> Nach der Inkubation übertragen das Hirngewebe mit 500 ul der Papain-Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen ein 1000 ul Pipettenspitze Schnitt bei ~ 0,25 Zoll vom Boden verwendet wird. auf und ab pipettieren 10 Mal mit der gleichen Spitze vorsichtig distanzieren, indem Sie langsam das Hirngewebe. Pipettieren nicht nach oben und unten mehr als das 15-fache und nicht Luftblasen bei diesem Schritt erzeugen, wie es die Lebensfähigkeit der Zellen verändern könnten. </li><li> Inkubieren wieder das Hirngewebe bei 37 ° C für 10 min, gefolgt von Auf- und Abpipettieren 10-13 mal eine ungeschnittene 1000 ul regelmäßige Spitze verwenden. Pipettieren nicht nach oben und unten mehr als 15 Mal, um zu verhindern Zelltod. </li><li> Stoppt den enzymatischen Verdau durch Zugabe von 2 ml Waschlösung (Schritt 1.5), und die Zellsuspension Zentrifuge bei 800 × g für 5 min bei Raumtemperatur (RT). Vorsichtig umfüllen supernatant und das Pellet in der verbleibenden Lösung resuspendieren durch das Rohr kräftig mit einem Finger tippen und dann durch Auf- und Abpipettieren mit einem 1000 ul regelmäßigen Spitze. Als nächstes wurden 2 ml Waschlösung hinzufügen. </li><li> In diesem Stadium prüfen unter dem Mikroskop, das eine einzige Zellsuspension erhalten wurde. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wieder bei 800 g für 5 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml frischem Z-Zustand Medium (Schritt 1.10). </li><li> Stain Zellen durch Trypanblau-12 mit und zählen die lebenden Zellen mit einem Hämozytometer unter Ausschluss blauen toten Zellen. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte mit 200 ul Zellsuspension und 300 ml frisches Z-Zustand Medium in jeder Vertiefung. Samenzellen in einer Dichte von ~ 500 Zellen / &amp; mgr; l. Pflegen kultivierten Zellen in einem Inkubator bei 30 ° C in 5% CO 2, da Zebrabärbling Gehirn stammNeuroSphären wachsen nicht gut bei 37 ° C. </li></ol> 4. Erzeugung von Primärneurosphären &lt;/ P&gt; <ol><li> Nach 1 Tag in vitro (div1), beachten Sie die einzelnen Zellsuspension aus dem erwachsenen ganze Gehirn unter dem Mikroskop erhalten und beachten Sie, ob Ablagerungen in der Mitte des gut angesammelt hat. Entfernen Sie vorsichtig alle Ablagerungen von etwa 100 ul Medium Pipettieren (weniger wenn möglich). Als nächstes fügen Sie 100 ml frisches Z-Zustand Medium. Einzelzellsuspensionen sollten zu diesem Zeitpunkt (2A div1) beobachtet werden. </li><li> Nach 2 Tagen in vitro (div2), die kultivierten Zellen erweitern. Mit einem 1000 ul Pipette mit der Spitze schneiden, zu sammeln und übertragen 250 ul Zellsuspension aus jeder Vertiefung in einen Brunnen neu. In 250 ml frisches Z-Zustand Medium in alle Vertiefungen. Bevor die kultivierten Zellen expandiert, homogenisieren der Suspension sehr sanft durch Pipettieren nach oben und unten im ganzen gut. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2 für den folgenden 4 Tagen in vitro (DIV4). Eine progressive Zunahme der Größe von Neurosphären sollte vi seinlich in der Mitte und die Kanten des Bohrloches bei DIV3 und DIV4 (2B und C). Hinweis: Primäre Neurosphären können für den Durchgang oder die Differenzierung verarbeitet werden Multipotenz zu beurteilen. Alternativ können sie für Nukleofektion oder Lipo-Transfektion 11 werden verarbeitet , um die Rolle spezifischer Gene während des Differenzierungsprozesses zu charakterisieren. </li></ol> 5. Passagierung der primären Neurosphären <ol><li> Entfernen 250 ul Gewebekultur aus jeder Vertiefung und mechanisch DIV4 Neurosphären mit einer 1 ml Pipette distanzieren. Nicht pipettieren nach oben und unten zu schnell als Luftblasenbildung Zelltod erhöht werden. </li><li> Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und verteilen 800 Zellen / ul in 250 ul primären Kulturüberstand in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte. </li><li> In 250 ul Z-Zustand Medium zu jeder Vertiefung. </li><li> Nach 2 Tagen in vitro (div2), erweitern die kultivierten Zellen , wie in Schritt 4.2 eine berichtetd 4.3. </li></ol> 6. Differenzierung von primären Neurosphären <ol><li> Sterilisieren Deckgläser durch Eintauchen in 70% Ethanol für 10 min, dann trocken Deckgläser bei RT, indem sie in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte platzieren. </li><li> Hinzufügen von 300 &amp; mgr; l von extrazellulärem Beschichtungslösung (Schritt 1.11) in der Mitte des Deckglases in der Weise, dass es weit verbreitet und decken die gesamte Deckglas erweitern. Dann wird für 1 h bei 37 ° C inkubieren (der befeuchteten Zellkulturbrutschrank verwendet wird). </li><li> Entfernen Sie die extrazelluläre Beschichtungslösung nach der Inkubation und trockne das Deckglas für 2 h bei 37 ° C. </li><li> Entfernen 250 ul Gewebekultur aus jeder Vertiefung. Mechanisch distanzieren alle DIV4 primären Neurosphären pro Vertiefung mit einer 1 ml Pipette (mit breiteren-Endrohr) durch Pipettieren von oben und unten. </li><li> Seed dissoziierten Neurosphären Zellsuspensionen bei einer Zelldichte von 4 x 10 3 Zellen / ml auf zuvor hergestellte extrazelluläre Matrix beschichteten Deckgläsern (Schritt 6.1-6.3) und Halten für mindestens 30 min bei 30 ° C in 5% CO 2, bis an dem Substrat befestigt. Dann entfernen Sie das Kulturmedium und schnell 1 ml vorgewärmter Frisch Z-Differenzierung Zustand Medium (Schritt 1.9) , bevor die Zellen 24 Stunden lang bei 30 ° C in 5% CO 2 kultiviert werden . </li><li> Alle zwei Tage ersetzen die Hälfte der Z-Differenzierung Zustand Medium während der Zeit der Zelldifferenzierung. </li></ol> 7. Genmanipulation von primären Neurosphären <ol><li> Sammeln DiV3-4 primären Neurosphären (Schritt 4.3) von 8 Minuten bei 80 x g zentrifugiert bei 4 ° C. Bereiten Sie sich auf Liposom - Transfektion von kommerziellen oligonucleoatides wie previouly 11 oder Nucleo-Transfektion von DNA - Plasmid - Vektoren. </li><li> Resuspendieren Neurosphärenpellet mit einer Zelldichte von 4 x 10 3 Zellen / ul in 100 ul einer Reaktionsmischung (82 ul Nucleofactor Lösung und 18 &amp; mgr; l zu ergänzen). </li><li> Mischen Sie die Neurosphere Schutzsperreauf mit 5 ul der DNA-Plasmid-Vektoren der Wahl (Plasmid-Aktien bei 1 ug / ul). Übertragen Sie die Neurosphere / DNA-Mischung in eine Nucleofector Küvette für nucleotransfection und wählen Sie Nucleofector Programm gemäß der von der Nucleofector Kit enthaltenen Anweisungen des Herstellers. </li><li> Unmittelbar nach Nukleofektion ein Volumen von 500 ml vorgewärmten Z-Zustand Medien (1.10) zu den Zellen und die Platte der transfizierten Neurosphären für das Studium ihrer Zellerneuerung und / oder Differenzierung Eigenschaften hinzufügen, wie oben beschrieben. </li></ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Analysis+Using+Trypan+Blue:+Manual+and+Automated+Methods.">Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods.</a> Methods Mol Bio. 740, (2011).</li><li>Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+view+of+development.">A CRISPR view of development.</a> Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Das Hauptziel dieses Protokoll ist zur Isolierung und Kultur adult Zebrabärbling Gehirn stammNeuroSphären für die zellulären und molekularen Eigenschaften von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen zu studieren. Hier berichten wir , wie multipotenten neuralen Zellen auszuwählen und erzeugen die drei neuronalen Zelltypen, das heißt, Astrozyten, Neuronen und Oligodendrozyten, vom erwachsenen Zebrafischgehirn. Das Protokoll ist sehr bedeutsam, da eine reproduzierbare Neurosphäre bildenden Assays bislang ni...

Mammalian neurale Stammzellen (NSC) wurden in freischwimmenden Kulturen als Cluster von sich teilende Zellen genannt Neurospheres 1 in vitro durch ihre Fähigkeit , zu wachsen charakterisiert. In Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), NSC dividieren entweder symmetrisch selbst erneuernden NSC zu erzeugen, oder asymmetrisch zwei verschiedenen Tochterzellen zu erzeugen, dh., Eine differenzierende Vorläuferzelle und eine neuartige NSC. Neurosphere Kulturen sind daher eine Mischung aus neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen und differenzierten neuralen Zellen 2-4 NSC kann jedoch aus anderen Neurosphäre Zelltypen von zwei spezifischen Eigenschaften unterscheiden:. Sie in Freilangfristigen Selbsterneuerungs anzuzeigen Floating - Kulturen und sie können in allen neuralen Zelllinien (dh Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten) nach Entzug der Wachstumsfaktoren und Adhäsion an extrazelluläre Matrixsubstraten unterscheiden. in mammals die Neurosphärenkultur - System war das erste in - vitro - System verwendet , um die Anwesenheit von NSC im erwachsenen Gehirn zu zeigen , und ist die am häufigsten verwendeten Werkzeug Proliferation, Selbsterneuerungskapazität und Multipotenz von neuralen Stamm- und Vorläuferzellen zu analysieren. Deshalb, auch wenn Kugel bildenden Tests von einigen Nachteilen und Einschränkungen 4 ist dieses Kultursystem ist wertvoll für das Potential einer Zelle Auswertung als Stammzelle zu verhalten , wenn sie 4 aus seiner in vivo Nische entfernt und hat bei der Identifizierung von Schlüsselregulatoren instrumental von NSC Selbsterneuerung und Zellschicksal Bestimmung 5-7. Im Gegensatz zu den Säugetieren, die adulte Neurogenese beschränkt haben, Zebrabärbling produzieren konstitutiv neue Neuronen entlang der gesamten Gehirns Achse während ihrer gesamten Lebensdauer. Der Zebrabärbling erwachsenen Gehirn zeigt mehrere neurogenen Nischen neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen beherbergen ein leistungsfähiges Modellorganismus machen Zebrabärbling t für das Verständniser Stammzellaktivität im Gehirn sowie die molekularen Programme für das zentrale Nervensystem die Regeneration erforderlich. In den letzten 17 Jahren entwickelte sich mehrere Arbeitsgruppen Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Zebrabärbling neuralen Zellen 8,9. Diese Studien wurden bei der Herstellung embryonalen neuronalen und Glia - Zellen , in vitro gerichtet, aber nicht auf NSC Aufrechterhaltung und Untersuchung ihrer Eigenschaften. Obwohl Neurosphären haben im erwachsenen Apteronotus leptorhynchus (Brown - Geist Messerfisch) 10, ein Neurosphären-Bildungstest in der Zebrabärbling blieb etabliert werden generiert. Hier beschreiben wir eine Neurosphere-Bildungstest die Rolle der miR-107 während der Zebrabärbling Neurogenese 11 zu demonstrieren. Das Protokoll ermöglicht: 1) die Sammlung von adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen entweder von Zebrabärbling gesamte Gehirn oder aus mehreren seziert Hirnregionen wie das Telencephalon, Tectum und Cerebellum; 2) die Erzeugung von flFlie und selbst erneuernden Neurosphären von adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen; 3) die Down- und Hochregulation der Expression von kodierenden Genen oder kleine nicht-kodierenden RNAs 11 in Neurosphären, um ihre Rollen bei der Proliferation und Differenzierung von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DPBS 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 1X</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6852-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 supplement (100x) liquid&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td>1M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose 45%&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>&#160;100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5500-50 mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA&#160;</td>
			<td>TCI</td>
			<td>P0018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>AmericanBio</td>
			<td>AB11072-04000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine MS-222</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5040</td>
			<td>stock solution of 4 mg/ml.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trycold gel&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TGP8</td>
			<td>gel pack</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPI-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Allgemeine Schema des Adult Zebrabärblinge Neurosphäre Kultur Hier beschreiben wir alle Schritte des Protokolls eines Neurosphere-Bildungstest von den Erwachsenen cerebra- durchgeführt. Zunächst adulten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen entweder von Zebrabärbling gesamte Gehirn oder aus mehreren seziert Hirnregionen wie das Telencephalon gesammelt worden ist , Tectum und Cerebellum (1A-C). Einzelzel...

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Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Hier stellen wir ein reproduzierbares Verfahren adulte Neurogenese zu untersuchen, aus dem gesamten Gehirn stamm eine Neurosphäre Assay verwendet oder von entweder dem telencephalic, tectal oder cerebellar Regionen des adulten Gehirns Zebrabärbling. Zusätzlich beschreiben wir das Verfahren der Genexpression in Zebrabärbling Neurosphären zu manipulieren.

Isolierung und Kultur von Adult Zebrafisch brain-derived Neurosphären

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K Aufrufe.  Yale University.  Hier stellen wir ein reproduzierbares Verfahren adulte Neurogenese zu untersuchen, aus dem gesamten Gehirn stamm eine Neurosphäre Assay verwendet oder von entweder dem telencephalic, tectal oder cerebellar Regionen des adulten Gehirns Zebrabärbling. Zusätzlich beschreiben wir das Verfahren der Genexpression in Zebrabärbling Neurosphären zu manipulieren. 

Serie: Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

Isolierung und Charakterisierung von Einzelzellen aus Zebrafischembryonen

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural intermediacy between the rodent and human hippocampi, is therefore a valuable model in which to study adult neurogenesis. In vitro culture assays are an essential component of characterizing neurogenesis and adult neural precursor cells, allowing for precise control over the cellular environment. To date however, culture protocols for canine cells remain under-represented in the literature. Detailed here are systematic protocols for the isolation and culture of hippocampal neural precursor cells from the adult canine brain. We demonstrate the expansion of canine neural precursor cells as floating neurospheres and as an adherent monolayer culture, producing stable cell lines that are able to differentiation into mature neural cell types in vitro. Adult canine neural precursors are an underused resource that may provide a more faithful analogue for the study of human neural precursors and the cellular mechanisms of adult neurogenesis.

The canine brain is a valuable model in which to study adult neurogenesis. Presented here are protocols for isolating and expanding adult canine hippocampal neural precursor cells from primary brain tissue.

Isolierung und Expansion von adulten Canine Hippocampus Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting occurs. Loss of muscle mass and function is associated with muscle fiber type atrophy, fiber type switching, defective muscle regeneration associated with dysfunction of satellite cells, muscle stem cells, and other pathophysiological processes. These changes are associated with changes in intracellular as well as local and systemic niches. In addition to most commonly used rodent models of muscle ageing, there is a need to study muscle homeostasis and wasting using human models, which due to ethical implications, consist predominantly of in vitro cultures. Despite the wide use of human Myogenic Progenitor Cells (MPCs) and primary myoblasts in myogenesis, there is limited data on using human primary myoblast and myotube cultures to study molecular mechanisms regulating different aspects of age-associated muscle wasting, aiding in the validation of mechanisms of ageing proposed in rodent muscle. The use of human MPCs, primary myoblasts and myotubes isolated from adult and aged people, provides a physiologically relevant model of molecular mechanisms of processes associated with muscle growth, atrophy and regeneration. Here we describe in detail a robust, inexpensive, reproducible and efficient protocol for the isolation and maintenance of human MPCs&#160;and their progeny&#160;&#8212; myoblasts and myotubes from human muscle samples using enzymatic digestion. Furthermore, we have determined the passage number at which primary myoblasts from adult and aged people undergo senescence in an in vitro culture. Finally, we show the ability to transfect these myoblasts and the ability to characterize their proliferative and differentiation capacity and propose their suitability for performing functional studies of molecular mechanisms of myogenesis and muscle wasting in vitro.

This protocol describes a robust, reproducible and simple method of isolation and culture of myoblast progenitor cells from the skeletal muscle of adult and aged people. The muscles used here include foot and leg muscles. This approach enables the isolation of an enriched population of primary myoblasts for functional studies.

Herstellung und Kultur von Myogenic Vorläuferzellen / Primär-Myoblasten aus Skelettmuskel von adulten und im Alter von Menschen

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The M&#252;ller glia re-enter the cell cycle and produce neuronal progenitor cells that undergo subsequent rounds of cell divisions and differentiate into the lost neuronal cell types. Both M&#252;ller glia and neuronal progenitor cell nuclei replicate their DNA and undergo mitosis in distinct locations of the retina, i.e. they migrate between the basal Inner Nuclear Layer (INL) and the Outer Nuclear Layer (ONL), respectively, in a process described as Interkinetic Nuclear Migration (INM). INM has predominantly been studied in the developing retina. To examine the dynamics of INM in the adult regenerating zebrafish retina in detail, live-cell imaging of fluorescently-labeled M&#252;ller glia/neuronal progenitor cells is required. Here, we provide the conditions to isolate and culture dorsal retinas from Tg[gfap:nGFP]mi2004 zebrafish that were exposed to constant intense light for 35 h. We also show that these retinal cultures are viable to perform live-cell imaging experiments, continuously acquiring z-stack images throughout the thickness of the retinal explant for up to 8 h using multiphoton microscopy to monitor the migratory behavior of gfap:nGFP-positive cells. In addition, we describe the details to perform post-imaging analysis to determine the velocity of apical and basal INM. To summarize, we established conditions to study the dynamics of INM in an adult model of neuronal regeneration. This will advance our understanding of this crucial cellular process and allow us to determine the mechanisms that control INM.

Zebrafish retinal regeneration has mostly been studied using fixed retinas. However, dynamic processes such as interkinetic nuclear migration occur during the regenerative response and require live-cell imaging to investigate the underlying mechanisms. Here, we describe culture and imaging conditions to monitor Interkinetic Nuclear Migration (INM) in real-time using multiphoton microscopy.

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of the heart after ischemic injury. When activated, epicardial cells undergo a process known as epithelial to mesenchymal transition (EMT) to provide cells to the regenerating myocardium. Furthermore, the epicardium contributes via secretion of essential paracrine factors. To fully appreciate the regenerative potential of the epicardium, a human cell model is required. Here we outline a novel cell culture model to derive primary epicardial derived cells (EPDCs) from human adult and fetal cardiac tissue. To isolate EPDCs, the epicardium is dissected from the outside of the heart specimen and processed into a single cell suspension. Next, EPDCs are plated and cultured in EPDC medium containing the ALK 5-kinase inhibitor SB431542 to maintain their epithelial phenotype. EMT is induced by stimulation with TGF&#946;. This method enables, for the first time, the study of the process of human epicardial EMT in a controlled setting, and facilitates gaining more insight in the secretome of EPDCs that may aid heart regeneration. Furthermore, this uniform approach allows for direct comparison of human adult and fetal epicardial behavior.

The epicardium plays a crucial role in the development and repair of the heart by providing cells and growth factors to the myocardial wall. Here, we describe a method to culture human primary epicardial cells that enables the study and comparison of their developmental and adult characteristics.

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Kultur und Transfektion von Primärzellen Zebrafisch

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Nanoparticle-mediated siRNA Gene-silencing in Adult Zebrafish Heart

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart after apex resection or cryoinjury, making it an important model organism for heart regeneration study. However, the lack of loss-of-function methods for adult organs has restricted insights into the mechanisms underlying heart regeneration. RNA interference via different delivery systems is a powerful tool for silencing genes in mammalian cells and model organisms. We have previously reported that siRNA-encapsulated nanoparticles successfully enter cells and result in a remarkable gene-specific knockdown in the regenerating adult zebrafish heart. Here, we present a simple, rapid, and efficient protocol for the dendrimer-mediated siRNA delivery and gene-silencing in the regenerating adult zebrafish heart. This method provides an alternative approach for determining gene functions in adult organs in zebrafish and can be extended to other model organisms as well.

It remains a major challenge to develop conditional gene-knockout or effective gene-knockdown in adult zebrafish organs. Here we report a protocol for performing nanoparticle-mediated siRNA gene-silencing in adult zebrafish heart, thus providing a new loss-of-function method for studying adult organs in zebrafish and other model organisms.

Nanopartikel-vermittelten SiRNA Gen-silencing in Erwachsenen Zebrafisch-Herz

Mammals have a very limited capacity to regenerate the heart after myocardial infarction. On the other hand, the adult zebrafish regenerates its heart ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...