Name: isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres
Uploaded: 2016-02-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres at JoVE.com

The authors thank Guillermina Hill-Teran and Marie-Elise Schwartz for assistance. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (5R00HL105791 to S.N.) and from the Alzheimer (NIRP 12-259162). This work was also supported by Institut National de la Sant&#233; et de la Recherche M&#233;dicale (CFC and JLT), Agence Nationale de la Recherche (13-BSV4-0002-01 (JLT), NIH (1R01EB016629-01A1 (JLT), Connecticut Stem Cell Research Fund (13-SCA-Yale-04 (JLT).

WT CF suşu Zebra balığı Yale Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC protokol numarası 2012-11473) tarafından onaylanan protokollere göre kaldırdı ve muhafaza edildi. Tüm deneyler ilk araştırma amaçlı hayvanların kullanımı ile ilgili organları düzenleyen ilgili tüm devlet ve kurumsal etik tarafından onaylanmış olmalıdır. 1. hazırlıklar <ol><li> Diseksiyon ortamı 10 ml hazırlamak 200 ul 100x Penisilin-Streptomisin DMEM / F12 9.8 ml. </li><li> , Doku kültürü için 10 ml su ile L-sistein 120 mg ekleyin: L-sistein solüsyonu hazırlayın. 2 haftaya kadar 4 ° C &#39;de, L-sistein solüsyonu saklayın veya 1 yıla kadar -20 ° C&#39; de parçalar halinde. </li><li> DNase I çözelti hazırlayın: doku kültürü için 1 ml su için, DNase I deposu 2 aya kadar, 4 ° C &#39;de DNase I çözeltisi 10 mg ekleyin. </li><li> Papain çözelti hazırlayın: Papain solut hazırlamakiyonu, DMEM / F12 5 ml 100 ul papain (yaklaşık 140 adet), 100 ul DNase I (% 1) ve 200 ul L-sistein (12 mg / ml) ekleyin. Taze papain çözüme her zaman hazırlamak ve kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ile sterilize edin. </li><li> Yıkama çözeltisi hazırlayın: yıkama çözeltisi 100 ml hazırlanması 93,85 mi DPBS 1x glikoz% 45, 500 uL, 1 M HEPES ve 5 ml FBS 650 ul ekleyin. Kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutlu filtre içinden filtre yıkama çözeltisi sterilize edin. en fazla 2 ay için 4 ° C&#39;de yıkama solüsyonu saklayın. </li><li> insülin çözeltisi hazırlayın: insülin çözeltisinin 2 ml hazırlamak için, doku kültürü için 2 ml su içinde, 10 N NaOH ve 100 mg insülin 25 ul damla ekleyin. </li><li> EGF ve FGF çözümleri hazırlayın: 100 ug / ml konsantrasyonda DMEM / F12 iki mitojenler eritin. -20 ° C&#39;de 10 ul alikotları olarak saklanmalıdır. </li><li> B-27 ve K-2 ortamı hazırlayın: KAYIT B-27 ve K-2 takviyesi 500 ul -20 ° C ve 1 ml alikotlar, respectiv deely. </li><li> Z farklılaşma durumu orta hazırlayın: Z-farklılaşma durumu ortamı 100 ml hazırlayın 40 ul insülin (50 mg / ml), 500 ul B-27, 1 mL N-2, 650 ul glükoz 45 ve% 1 ml eklemek 100 x penisilin-streptomisin DMEM / F12 97,81 ml. Kullanmadan önce 0.22 mikron gözenek boyutu filtre ile Z-farklılaşma durum orta sterilize edin. 1 hafta kadar 4 ° C &#39;de Z-farklılaşma durumu orta saklayın. </li><li> Z durumu orta hazırlayın: Z-durumu ortamı 50 ml hazırlayın EGF 10 ul steril Z farklılaşma durumu ortamı (20 ng / ml), 50 ml FGF 10 ul ekleyin. 1 hafta kadar 4 ° C &#39;de Z-ortamla saklayın. </li><li> Farklılaşma kültürü için kaplama çözeltisi hazırlayın: 5 ml dışı kaplama çözümü için, hücre dışı matriks solüsyonu 100 ul ekleyin DMEM / F12 4.9 ml (örneğin, Matrigel.). buz üzerinde 4 ° C&#39;de çözülme hücre dışı matris çözeltisi. Bir kez çözüldü, U, 4 ° C &#39;de devam2 hafta s. </li></ol> Yetişkin Zebra balığı Beyin 2. Diseksiyon <ol><li> Jel buz paketleri ile 100 mm x 15 mm Petri kabı doldurarak yatağı bir diseksiyon hazırlayın. Daha sonra Petri kabı kapağı yerleştirmek ve jel donar kadar -20 ° C de inkübe edilir. Kapak yerin üstüne temiz filtre kağıdı kare filtre kağıdı ve plastik film ile petri hem sarın ve. </li><li> Temiz ve her kullanımdan önce% 70 etanol ya da ısı ile tüm mikrodiseksiyon aletleri sterilize. mikroskop yakınındaki bütün sterilize diseksiyon aletleri yerleştirin ve sağ ötenazi önce, fiber optik aydınlatma ile mikroskop altında diseksiyon yatak yerleştirin. </li><li> Bir tüm beyin neurosphere hazırlanması için 2 yetişkin zebrafish toplamak; ve 3 ila 4 zebra balığı parçalara beyin bölgelerinde Neurospheres oluşturmak için. </li><li> Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış bir protokol kullanılarak yetişkin zebrafish (8-12 aylık) euthanize. Sonraki 7, balık batırmak% 5, 5-10 saniye boyunca, etanol ve hızlı bir şekilde cerrahi bıçak kullanılarak solungaçları düzeyinde dekapitasyon diseksiyon yatakta yer. <ol><li> Hayvanın kalp atışı yavaş yavaş yavaşlatır ve dolaşımı durana kadar aşırı dozda tricaine metansülfonat (300 mg / L) yönetmek, hayvanlar euthanize, ardından buzlu suya batırın. </li></ol></li><li> aşağı kafa dorsal yüzü çevirin, ve makas kullanılarak ağzına kesim tarafında uzunlamasına kesim yapmak. Forseps kullanarak kafatasının taban açığa ve tüm komşu doku kaldırmak. tektum yönelik omurilik başından kafatası yanal duvarların kesin. </li><li> makas kullanılarak, kesme ve optik sinirler kaldırmak ve daha sonra tektum seviyesinde kafatası en dış kısımda, her iki tarafı da çıkarın. Baş ventral yüzü yukarı çevirin. Kafatasının en üst kısmı geri kalanını soyulabilir, forseps kullanma. </li><li> Yeni bir tabak wi içine kafatası kalan kısmı ile beyin birlikte aktarındiseksiyon orta (1.1) th. bozulmamış tüm beyin yapılarını tutarak, mikro bıçağın plastik tutacağı kullanarak diseksiyon orta beyin dokusunu temizleyin. </li><li> Bu açıdan bakıldığında, bütün zebrabalıkları beyni kullanarak protokolü devam ediyor. <ol><li> Alternatif bütün zebrabalıkları beyin ya da taze neşter ile disseke telencephalon, tektum / diensefalon veya beyincik gelen neurospheres oluşturmak için spesifik beyin bölgelerinde için bu protokolü adapte. Şekil 3 ve 11 referans faiz göre tanımlanan beyin bölgesini incelemek için bir nöral özel floresan Zebra balığı nöral transgenik satırını kullanın. </li></ol></li></ol> Yetişkin Beyin 3. Tek Hücre Ayrılma <ol><li> Bir biyolojik güvenlik kabini sonraki tüm işlemlerini gerçekleştiriyoruz. diseksiyon orta 800 ul içeren bir 1.5 ml tüp içine beyin doku transferi (adım 1.1 hazırlanmış). Beyin dokusu dokunmadan, pipetleme diseksiyon orta çıkarın. </li><li>papain çözeltisi (adım 1.4) 500 ul ilave edin ve 10 dakika için 37 ° C &#39;de beyin dokusu sindirimi. hücre canlılığı azaltabilir olarak daha uzun 15 dakika inkübe etmeyin. </li><li> inkübasyondan sonra, alttan ~ 0.25 inç 1000 ul pipetlemeyin ucu kesilmiş kullanarak 15 ml konik tüp içine papain çözüm 500 ul ile beyin dokusuna aktarın. Yavaşça yavaşça aynı ucu ile yukarı ve aşağı 10 kez pipetleme beyin doku ayırmak. pipetlemeyin yukarı ve 15&#39;den fazla kez aşağı ve hücre canlılığı değiştirebilir olarak, bu adımı sırasında hava kabarcıkları üretemeyen yok. </li><li> Bir kesilmemiş 1.000 ul düzenli ucunu kullanarak 10 yukarı pipetleme tarafından takip dakika ve aşağı 10-13 kez 37 ° C&#39;de tekrar beyin dokusu kuluçkaya yatmaktadır. pipetlemeyin yukarı etmeyin ve en fazla 15 kat aşağı, hücre ölümünü önlemek için. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca (RT) 800 xg yıkama çözeltisi (adım 1.5), ve santrifüj 2 ml hücre süspansiyonu eklenerek enzimatik sindirim durdurun. Dikkatle s decantupernatant ve 1000 ul düzenli ucu ile pipetleme ve aşağı şiddetle bir parmak ve sonra tüp dokunarak kalan çözelti içinde pelletini. Daha sonra, yıkama çözeltisi 2 ml ekleyin. </li><li> Bu aşamada, tek bir hücre süspansiyonu elde edilmiştir mikroskop altında bakın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 800 x g hızında tekrar hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatantı ve taze Z-ortamla (adım 1.10) 1 ml kullanarak pelet yeniden askıya. </li><li> Tripan mavisi 12 ve kullanarak leke hücreler mavi ölü hücreleri hariç tutarak hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak. Hücre süspansiyonunun 200 ul ve her bir kuyu taze Z ortamla 300 ul, 24 oyuklu bir plaka hazırlanması. ~ 500 hücre / ml bir yoğunlukta tohum hücreleri. Zebra balığı, beyin-türevi Neurospheres 37 ° C&#39;de iyi bir büyüme olmadığı,% 5 CO2 içinde 30 ° C&#39;de bir inkübatör içinde kültürlendi hücreleri korumak. </li></ol> İlköğretim Neurospheres 4. Nesil &lt;/ P&gt; <ol><li> Nitro (div1) &#39;de 1 gün sonra, mikroskop altında yetişkin tüm beyin elde edilen tek bir hücre süspansiyonu gözlemlemek ve moloz de merkezinde biriken olup olmadığını not edin. Dikkatle orta yaklaşık 100 ul pipetleme herhangi bir enkaz kaldırmak (mümkünse daha az). Sonraki taze Z-ortamla 100 ul ekleyin. Tek hücre süspansiyonları, bu süre (Şekil 2A div1) de dikkat edilmelidir. </li><li> In vitro olarak 2 gün sonra (DIV2) sonra, kültürlenmiş hücreleri genişletmek. ucu kesilmiş 1.000 ul pipet kullanarak, toplamak ve iyi bir yeni her bir kuyudan hücre süspansiyonu 250 ul aktarın. Tüm kuyulara taze Z-ortamla 250 ul ekleyin. kültür hücreleri genişleyen önce, iyi boyunca yukarı pipetleme ve aşağı çok yavaşça süspansiyon homojenize. </li><li> Yineleyin in vitro aşağıdaki 4 gün (DiV4) için 4.1 ve 4.2 adımları tekrarlayın. neurospheres büyüklüğünde bir progresif artış vi olmalıdırDIV3 ve DiV4 (Şekil 2B ve C) merkezi ve iyi kenarlarında kişidir. Not: Primer Neurospheres geçit veya multipotency değerlendirmek farklılaşması için işlenebilir. Alternatif olarak, farklılaşma sürecinde belirli genlerin rolünü tanımlamak için nucleofection ya lipo transfeksiyon 11 işlenebilir. </li></ol> İlköğretim Neurospheres 5. Pasajlanması <ol><li> Her kuyudan doku kültürü 250 ul çıkarın ve mekanik olarak 1 ml pipet DiV4 Neurospheres ayrıştırmaları. çok hızlı hava kabarcığı oluşumu hücre ölümünü artmış olabilir aşağı yukarı pipetlemeyin ve vermeyin. </li><li> Bir hemasitometre ile hücre sayımı ve 24 oyuklu plakanın her oyuğuna primer kültür yüzey 250 ul 800 hücre / ul dağıtın. </li><li> her bir kuyunun Z-ortamla 250 ul ekleyin. </li><li> Aşama 4.2 belirtildiği gibi, in vitro olarak 2 gün sonra (DIV2) sonra, kültürlenmiş hücreleri genişletmekd 4.3. </li></ol> İlköğretim Neurospheres 6. Farklılaşma <ol><li> 10 dakika süre ile,% 70 etanol içine daldırma ile kaplama gözlük sterilize, 12 oyuklu plakanın her oyuğuna yerleştirerek oda sıcaklığında daha sonra kuru örtücü camlar. </li><li> yaygın genişletmek ve tüm cam kapak kapsayabilir şekilde kapak camın merkezde hücre dışı kaplama çözeltisi (aşama 1.11) 300 ul ekle. Daha sonra, (nemlendirilmiş hücre kültür inkübatörü kullanılarak), 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, hücre dışı Kaplama çözeltisini çıkarın ve 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca cam kapak kurutun. </li><li> Her kuyudan doku kültürü 250 ul çıkarın. Mekanik yukarı ve aşağı pipetleme tarafından (geniş uç ucu ile) 1 ml pipet ile kuyu başına tüm DiV4 birincil neurospheres ayırmak. </li><li> Tohum daha önce hazırlanmış hücre dışı matris ile kaplanmış coverglasses 4 x 10 3 hücre / ml&#39;lik bir hücre yoğunluğunda (6.1-6 adımında neurosphere hücre süspansiyonları ayrıştırılır.3) ve alt-tabakaya bağlı kadar% 5 CO2 içinde 30 ° C&#39;de, en az 30 dakika boyunca devam edin. Daha sonra, kültür ortamı çıkarın ve hızlı bir şekilde,% 5 CO2 içinde 30 ° C&#39;de 24 saat boyunca hücrelerin kültürlenmesi önce ön-ısıtılmış taze Z farklılaşma durumu ortamı (aşama 1.9) içinde 1 ml. </li><li> Her iki gün, hücre farklılaşmasının zamanında Z-farklılaşma koşulu orta yarısı değiştirin. </li></ol> İlköğretim Neurospheres 7. Gen Manipülasyonu <ol><li> 4 ° C&#39;de 80 x g&#39;de 8 dakika boyunca santrifüjlenerek DiV3-4 primer Neurospheres (adım 4.3) toplayın. Ticari oligonucleoatides lipozom transfeksiyon için hazırlanırken previouly 11 veya DNA plazmid vektörlerinin Nucleo-transfeksiyon nitelendirdi. </li><li> Reaksiyon karışımı, 100 ul (82 ul nucleofactor çözeltisi ve ek 18 ul), 4 x 10 3 hücre / ul hücre yoğunluğunda yeniden süspanse neurosphere pelet. </li><li> neurosphere asıltı Mix(1 ug / ml olarak plazmid stoklarının) seçim DNA plazmid vektörü 5 ul üzerinde. nucleotransfection bir Nucleofector küvet içine neurosphere / DNA karışımı, transferi ve Nucleofector kiti ile, imalatçının talimatlarına uygun olarak bir program Nucleofector seçin. </li><li> Hemen nucleofection sonra hücrelere önceden ısıtılmış Z durumu ortam (1.10), 500 ml bir hacim kazandırmak ve yukarıda tarif edildiği gibi, hücre yenileme ve / veya farklılaşma özelliklerini incelemek için, transfekte Neurospheres plaka. </li></ol>

<ol>
	<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+isolation+and+characterization.">Neural stem cell isolation and characterization.</a> Methods Enzymol. 419, 3-23 (2006).</li><li>Brewer, G. J., Torricelli, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+neurons+and+neurospheres.">Isolation and culture of adult neurons and neurospheres.</a> Nat Protoc. 2, 1490-1498 (2007).</li><li>Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+multipotent+neural+stem+or+progenitor+cells+from+both+the+dentate+gyrus+and+subventricular+zone+of+a+single+adult+mouse.">Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse.</a> Nat Protoc. 7, 2005-2012 (2012).</li><li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+wide+open:+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells.">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 486-498 (2011).</li><li>Winter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+neural+stem+cell+segmentation,+tracking+and+lineaging+with+validation+and+editing.">Vertebrate neural stem cell segmentation, tracking and lineaging with validation and editing.</a> Nat Protoc. 6, 1942-1952 (2011).</li><li>Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+neural+stem+cells.">Mammalian neural stem cells.</a> Science. 287, 1433-1438 (2000).</li><li>Reynolds, B. A., Rietze, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurospheres--re-evaluating+the+relationship.">Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship.</a> Nat Methods. 2, 333-336 (2005).</li><li>Ghosh, C., Liu, Y., Ma, C., Collodi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cultures+derived+from+early+zebrafish+embryos+differentiate+in+vitro+into+neurons+and+astrocytes.">Cell cultures derived from early zebrafish embryos differentiate in vitro into neurons and astrocytes.</a> Cytotechnology. 23, 221-230 (1997).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neuron+culture+for+nerve+growth+and+axon+guidance+studies+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Primary neuron culture for nerve growth and axon guidance studies in zebrafish (Danio rerio).</a> PloS one. 8, e57539 (2013).</li><li>Hinsch, K., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+long-term+persistence+of+new+neurons+in+the+adult+zebrafish+brain:+a+quantitative+analysis.">Generation and long-term persistence of new neurons in the adult zebrafish brain: a quantitative analysis.</a> Neuroscience. 146, 679-696 (2007).</li><li>Ristori, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dicer-miR-107+interaction+regulates+biogenesis+of+specific+miRNAs+crucial+for+neurogenesis.">A dicer-miR-107 interaction regulates biogenesis of specific miRNAs crucial for neurogenesis.</a> Dev Cell. 32, 546-560 (2015).</li><li>Louis, S. K., SIegel, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Viability+Analysis+Using+Trypan+Blue:+Manual+and+Automated+Methods.">Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and Automated Methods.</a> Methods Mol Bio. 740, (2011).</li><li>Harrison, M. M., Jenkins, B. V., O'Connor-Giles, K. M., Wildonger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR+view+of+development.">A CRISPR view of development.</a> Genes dev. 28, 1859-1872 (2014).</li><li>Marz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+in+progenitor+cell+subtypes+in+the+ventricular+zone+of+the+zebrafish+adult+telencephalon.">Heterogeneity in progenitor cell subtypes in the ventricular zone of the zebrafish adult telencephalon.</a> Glia. 58, 870-888 (2010).</li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

Bu protokolün amacı nöral kök / progenitör hücrelerin hücresel ve moleküler özellikleri incelemek için izole etmek ve kültür yetişkin zebrafish beyin kaynaklı Neurospheres etmektir. Burada, yetişkin zebrafish beyin, multipotent nöral hücreleri seçmek ve üç sinir hücre tipleri, yani astrositler, nöronlar ve oligodendrositleri oluşturmak için nasıl rapor. tekrarlanabilir neurosphere oluşturan deneyi şimdiye kadar zebrabalıkları kurulmuş olmasaydı bu yana protokol son derece önemlid...

Memeli nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) Neurospheres 1 olarak adlandırılan hücrelerin bölünmesi kümeleri gibi serbest bir kültürlerinde gelişme yetenekleri ile, in vitro olarak karakterize edilmiştir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) varlığında, NSC&#39;lerde kendini yenileyen NSCs oluşturmak için ya da simetrik olarak bölmek veya asimetrik, iki farklı yavru hücrelere oluşturmak için, yani. Bir ayırıcı projenitör hücre ve yeni bir MGK. Neurosphere kültürler, bu nedenle nöral kök / progenitör hücrelerin ve daha fazla farklı sinir hücrelerinden 2-4 bir karışımı olan NSC&#39;lerde Ancak iki spesifik özellikleri ile, diğer neurosphere hücre tiplerinden ayırt edilebilir. Bunlar serbest uzun süreli kendini yenileme görüntüler kültürleri yüzen ve hücre dışı matriks substratlara büyüme faktörlerinin geri çekilmesi ve yapışma takiben tüm nöral hücre soyları (yani, nöronlar, astrositler ve oligodendrosit) içine ayırt edebilirsiniz. memeli konakçının içindeALS, neurosphere kültür sistemi, yetişkin beyinde NSC&#39;lerde varlığını göstermek için kullanılan ilk tüp sistemi ve proliferasyonu, kendi kendini yenileme ve nöral kök ve projenitör hücrelerinin multipotency analiz etmek için en sık kullanılan araç. Bu nedenle, küre oluşturan deneyleri bazı dezavantajları ve sınırlamalar 4 muzdarip olsa da, bu kültür sistemi kendi in vivo niş 4 çıkarılır ve kilit düzenleyiciler belirlenmesinde etkili olmuştur zaman kök hücresi gibi davranmaya bir hücrenin potansiyelini değerlendirmek için değerlidir MGK kendini yenileme ve hücre kader tayini 5-7. yetişkin nörogenezi sınırlı memelilere aksine, Zebra balığı yapısal hayatları boyunca tüm beyin ekseni boyunca yeni nöronlar üretirler. Zebra balığı yetişkin beyin t anlamak için Zebra balığı güçlü bir model organizma yapma nöral kök / progenitör hücreler barındıran birden nörojenik nişler görüntülerHücrenin beyinde aktivitesi hem de merkezi sinir sistemi rejenerasyonu için gerekli olan moleküler programları kaynaklanıyor. Geçtiğimiz 17 yıl içinde, çeşitli araştırma grupları izole ve Zebra balığı sinir hücreleri 8,9 kültürleme için yöntemler geliştirmiştir. Bu çalışmalar embriyonik nöronal ve in vitro glial hücreler üretmeyi amaçladığını, ancak NSCs korumak ve onların özelliklerini incelemeyi bulundu. Neurospheres yetişkin Apteronotus leptorhynchus (Brown hayalet Knifefish) 10 içinde olmasına rağmen, zebrabalıkları bir neurosphere oluşturucu deney kurulacak kalmıştır. Burada zebrabalıkları nöron 11 sırasında miR-107 rolünü göstermek için bir neurosphere oluşturan deneyi açıklar. protokol sağlar: 1) Zebra balığı bütün beyin ya da telencephalon, tektum ve beyincik gibi çeşitli disseke beyin bölgelerinden ya yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin toplanması; fl 2) nesiloating ve yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerden kendini sürekli yenileyen Neurospheres; 3) aşağı ve yukarı yönde regülasyonu kodlayan genlerin ya da küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar neurospheres 11, ekspresyon için nöral kök / progenitör hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması rollerini araştırmak.

<table><tbody><tr><td>DPBS 1x</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C6852-25g</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2 supplement (100x) liquid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td>1 M</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose 45%&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>&amp;nbsp;100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I5500-50 mg</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>DN25-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Papain&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>PFA&amp;nbsp;</td><td>TCI</td><td>P0018</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>AmericanBio</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine MS-222</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>stock solution of 4 mg/ml.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Trycold gel&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>TGP8</td><td>gel pack</td></tr><tr><td>Amaxa Basic Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>VPI-1004</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration in vertebrates. However, an in-depth analysis of the molecular mechanisms underlying zebrafish adult neurogenesis has been limited due to the lack of a reliable protocol for isolating and culturing neural adult stem/progenitor cells. Here we provide a reproducible method to examine adult neurogenesis using a neurosphere assay derived from zebrafish whole brain or from the telencephalon, tectum and cerebellum regions of the adult zebrafish brain. The protocol involves, first the microdissection of zebrafish adult brain, then single cell dissociation and isolation of self-renewing multipotent neural stem/progenitor cells. The entire procedure takes eight days. Additionally, we describe how to manipulate gene expression in zebrafish neurospheres, which will be particularly useful to test the role of specific signaling pathways during adult neural stem/progenitor cell proliferation and differentiation in zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Neurosphere Kültür Genel Şeması Burada yetişkin zebrabalıkları beyninden yapılan bir neurosphere oluşturucu deneyinin protokolünün tüm adımları açıklamaktadır. İlk olarak, yetişkin nöral kök / progenitör hücrelerin zebra balığı tüm beyin veya bu telencephalon, tektum ve serebellum (Şekil 1A-C) gibi çeşitli parçalara beyin bölgelerinde, ya toplanmıştı...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Burada tüm beyin veya telencephalic, tectal veya yetişkin zebrabalıkları beyin beyincik bölgelerinin türetilen bir neurosphere tahlili kullanılarak yetişkin nöron incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Ayrıca, zebrabalıkları neurospheres gen ifadesini işlemek için prosedürü açıklar.

Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

isolation-and-culture-of-adult-zebrafish-brain-derived-neurospheres

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.9K Görüntüleme.  Yale University.  Burada tüm beyin veya telencephalic, tectal veya yetişkin zebrabalıkları beyin beyincik bölgelerinin türetilen bir neurosphere tahlili kullanılarak yetişkin nöron incelemek için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Ayrıca, zebrabalıkları neurospheres gen ifadesini işlemek için prosedürü açıklar. 

Video: Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

Nörobilim

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in an intact and developing vertebrate. However, the detailed imaging of the morphologies of distinct cell types and subcellular structures is limited in whole mounts. Therefore, we established an efficient and easy-to-use protocol to culture live primary cells from zebrafish embryos and adult tissue.
In brief, 2 dpf zebrafish embryos are dechorionated, deyolked, sterilized, and dissociated to single cells with collagenase. After a filtration step, primary cells are plated onto glass bottom dishes and cultivated for several days. Fresh cultures, as much as long term differenciated ones, can be used for high resolution confocal imaging studies. The culture contains different cell types, with striated myocytes and neurons being prominent on poly-L-lysine coating. To specifically label subcellular structures by fluorescent marker proteins, we also established an electroporation protocol which allows the transfection of plasmid DNA into different cell types, including neurons. Thus, in the presence of operator defined stimuli, complex cell behavior, and intracellular dynamics of primary zebrafish cells can be assessed with high spatial and temporal resolution. In addition, by using adult zebrafish brain, we demonstrate that the described dissociation technique, as well as the basic culturing conditions, also work for adult zebrafish tissue.

We present an efficient and easy-to-use protocol for preparing primary cell cultures of zebrafish embryos for transfection and live cell imaging as well as a protocol to prepare primary cells from adult zebrafish brain.

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Gelişim Biyolojisi

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the differentiation and proliferation potential of neural stem cells, as well as to generate cell lines than can be assayed over time. Also, neurospheres can create a niche (in vitro) that allows the modeling of the dynamic changing environment, such as varying growth factors, hormones, neurotransmitters, among others. Microtus ochrogaster (prairie vole) is a unique model for understanding the neurobiological basis of socio-sexual behaviors and social cognition. However, the cellular mechanisms involved in these behaviors are not well known. The protocol aims to obtain neural progenitor cells from the neurogenic niches of the adult prairie vole, which are cultured under non-adherent conditions, to generate neurospheres. The size and number of neurospheres depend on the region (subventricular zone or dentate gyrus) and sex of the prairie vole. This method is a remarkable tool to study sex-dependent differences in neurogenic niches in vitro and the neuroplasticity changes associated with social behaviors such as pair bonding and biparental care. Also, cognitive conditions that entail deficits in social interactions (autism spectrum disorders and schizophrenia) could be examined.

We established the conditions to culture neural progenitor cells from the subventricular zone and dentate gyrus of the adult brain of prairie voles, as a complementary in vitro study, to analyze the sex-dependent differences between neurogenic niches that could be part of functional plastic changes associated with social behaviors.

Yetişkin Çayır Voles Nörojenik Nişler Türetilmiş Nörosferkültürü

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Murin Subventriküler Bölgesinden İzole Edilen NSC'lerin Etkin Nükleofeksiyonu

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Murin Subventriküler Bölgeden Türetilmiş Nöral Kök Hücre Kültürlerinde Yüksek Verimli Gen İletimi için Geliştirilmiş Nükleofeksiyon

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Generation and Differentiation of Primary Neurospheres from Zebrafish Neural Stem Cells

Source: Lopez-Ramirez, M. A. et al., <a href="https://app.jove.com/v/53617">Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the generation and differentiation of primary neurospheres. Neural stem cells from zebrafish, in the presence of growth factors, proliferate into free-floating neurospheres with self-renewal capacity, which later differentiate into glial cells and neurons.

Zebra Balığı Nöral Kök Hücrelerinden Primer Nörosferlerin Üretilmesi ve Farklılaşması

1. Preparations

	Prepare 10 ml of dissection medium, and add 200 &#181;l of 100x penicillin-streptomycin into 9.8 ml of Dulbecco&#39;s Modified Eagle ...

Yetişkin balığı beyin türevli Neurospheres İzolasyon ve Kültürü

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Kültür ve zebra balığı primer hücre Transfection

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler'den Kök Hücre

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

Yetişkin Çayır Voles Nörojenik Nişler Türetilmiş Nörosferkültürü

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Zebra Balığı Nöral Kök Hücrelerinden Primer Nörosferlerin Üretilmesi ve Farklılaşması