このプロトコルは、機能的なマウス造血幹細胞の増殖と遺伝子操作を可能にし、造血幹細胞の生物学と造血のより深い理解を可能にします。この技術の利点は、造血幹細胞を長期間のex vivo培養でサポートでき、造血の遺伝学を調べるための遺伝子操作を可能にすることです。この培養システムは、造血幹細胞生物学および造血に関する遺伝子研究、分子研究、生化学的研究を含むさまざまな研究のためのプラットフォーム技術を提供します。
トラブルシューティングの表には、この手法で遭遇する一般的な問題の原因と解決策がリストされています。骨髄細胞について読むよりも、骨髄細胞を正しく抽出し、完全な培地変更を実行する方法を示す方がはるかに簡単で効果的です。造血幹細胞(HSC)の抽出を開始するには、糸くずの出ない繊細なタスクワイプを使用して、適切に安楽死させたマウスから新たに分離された骨をきれいにします。
約3ミリリットルのPBSを含む乳鉢に追加する前に、骨から筋肉と脊髄を取り除きます。乳棒を使用して、せん断力を最小限に抑えるために骨を粉砕せずに粉砕します。次に、5ミリリットルのシリンジに取り付けられた19ゲージの針を使用して、PBSに放出された大きな骨髄片を分解し、懸濁液を70ミクロンのフィルターを通して50ミリリットルの円錐管に移します。
懸濁液が移されたら、骨が漂白されるまで新鮮なPBSでこのプロセスを繰り返します。マウスあたり約30ミリリットルのエンドボリュームを目指し、2匹のマウスが骨髄が見えなくなるまで骨を漂白するために50ミリリットルを目指します。上部に50ミクロンのフィルター、下に15ミリリットルの円錐管を備えた磁気カラムセパレーターの磁石に磁気ろ過カラムを配置して、カラム濃縮の準備をします。
次に、細胞をアロフィコシアニン抗c-Kit抗体およびアロフィコシアニン磁気マイクロビーズで処理した後、3ミリリットルの滅菌PBSを50ミクロンフィルターおよび濾過カラムに通す。PBSが通過したら、細胞懸濁液をカラムに通し、その後、毎回3ミリリットルの冷たいPBSを3回洗浄します。各洗浄の後、カラムの滴下が止まるのを待ってから、次の洗浄のためにPBSを追加します。
次に、カラムを磁石から取り外し、新しい15ミリリットルのチューブの上に置き、5ミリリットルの冷たいPBSをカラムに追加してから、カラムプランジャーを取り付け、プランジャーを押して細胞を溶出します。本文に記載されているプロトコルに従って、ミリリットルあたり0.5〜100万個の細胞を播種するために必要な数の細胞またはウェルに十分なHSC培地を準備します。次に、c-Kitが豊富な造血幹および前駆細胞(HSPC)をスピンダウンし、ペレットを新たに調製したHSC培地に目的の細胞密度で再懸濁します。
細胞をフィブロネクチンコーティングまたは負の表面帯電プレートに移し、適切な容量を維持します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%の組織培養インキュベーターに入れます。細胞培養を乱すことなくプレートを組織培養インキュベーターから静かに取り外した後、ピペットまたは真空ポンプを使用して、各ウェルの液体メニスカスから培地の約90〜95%をゆっくりと吸引します。
井戸の底から培地を引き上げることは避けてください。次に、摂氏37度に予熱した1ミリリットルの新鮮な培地をウェルに加えます。プレートを組織培養インキュベーターに戻し、実験が必要になるまで2〜3日ごとに培地を交換します。
細胞をヌクレオフェクションバッファーに再懸濁した後、直ちに複合体化したリボ核タンパク質を含むPCRチューブに細胞懸濁液を移し、ゆっくりと上下にピペッティングして穏やかに混合する。次に、混合物を適切な容量のエレクトロポレーションキュベットに非常にゆっくりと移し、キュベット内に気泡が形成されないように連続的な流体運動を維持します。次に、エレクトロポレーター上で、エレクトロポレーションされるウェルの位置を選択します。
タッチスクリーンを使用して、細胞タイププログラムをCD34陽性ヒトとして選択するか、パルスコードEO100を入力し、OKボタンを押します。キュベットをエレクトロポレーターに移し、タッチスクリーンのスタートボタンを押してエレクトロポレーションを開始します。エレクトロポレーションの直後に、培養液の反応量の5倍をキュベットに加える。
次に、細胞を準備したプレートにそっと移し、プレートを組織培養インキュベーターに戻します。前に示したように培地交換を行った後、10マイクロリットルの細胞を収集し、血球計算盤で1:2の希釈でTurkの溶液を使用してそれらをカウントします。形質導入のためにフィブロネクチンコーティングプレートに必要な用量の細胞を再プレートし、形質導入されていないネガティブコントロール細胞を別々にプレートします。
次に、レンチウイルスベクターを細胞を含む各ウェルに追加し、細胞あたり20形質導入単位の用量を維持して、約30%の形質導入効率を達成します。ただし、実験要件に応じてレンチウイルスベクターの用量を経験的に決定します。最後に、細胞を組織培養インキュベーターに6時間戻す。
前述のようにメディアの変更を実行します。c-Kit富化HSCの蛍光活性化細胞ソーティングでは、CD150陽性、CD34陰性、c-Kit陽性、Sca1陽性、および系統陰性の細胞の約0.2%が得られました。HSPC培養の4週間後、CD201陽性、CD150陽性、c-Kit陽性、Sca1陽性、および系統陰性の画分は、GFP発現レンチウイルスベクターによる形質導入後、GFP陽性細胞が約30%コンフルエントになると、培養物の予想密度はミリリットルあたり約200万細胞であることが判明しました。
最初の培地交換が行われる前の最初の24〜48時間以内に約50%の細胞死が観察された。しかし、1週間後、細胞数は播種された細胞数の80〜100%に戻りました。新鮮で予熱した培地を使用した正確な培地交換は、このHSC培養法の長期安定性にとって重要です。
元の方法が2019年に発表されて以来、この分野ではHSC生物学を研究するためにさまざまな方法でそれを使用し始めています。
