私たちの方法は、単一細胞レベルで複雑な組織から遺伝子発現データを生成し、理解するのに役立ちます。私たちの方法は、基本的にどの組織にも同じように適用でき、プロトコル関連のアーチファクトがほとんどない高品質のデータにつながります。シュミット・オット研究室のJanna Leiz博士と私がプロトコルを発表します。
腎臓を冷たい解剖プレートに置くことから始め、鋭いメスまたはかみそりの刃を使用して、1〜2ミリメートルの中央のスライスを取得します。組織片に皮質齍軸全体が含まれていることを確認してください。マイクロダイセクションハサミと鉗子を使用して、センターピースの側面から皮質を慎重にトリミングします。
解剖された組織片内では、皮質、外側髄質、および内側髄質の3つのセグメントがはっきりと見えるはずです。腎臓片を事前に調製したRNA安定化溶液に移し、RNA分解を避けるために摂氏4度で24時間インキュベートします。24時間後、RNA安定化溶液を除去する。
ティッシュペーパーで余分な溶液を慎重に取り除き、さらに使用するまでマイナス80°Cで組織を保管します。凍結した腎臓片を取り、1ミリリットルの核溶解バッファー1またはNLB1を含む氷上の60ミリメートルの予冷ポリスチレンペトリ皿に移します。かみそりの刃またはメスを使用して組織を完全にひきます。
1ミリリットルのピペットチップの先端を切り取り、細かく刻んだ組織とバッファーを氷の上に置いたグラインダーチューブに移します。すべてのピースが移されたことを確認し、ペトリ皿をバッファーで5〜10回洗浄します。氷上でグラインダーチューブ内で乳棒Aをゆっくりと上下に25回動かして、懸濁液を均質化します。
氷上で予冷した15ミリリットルの収集チューブ内の100マイクロメートルのストレーナーにホモジネートを通し、さらに1ミリリットルのNLB1でフィルターを洗浄します。グラインダーチューブを冷たいEZ核溶解バッファーで洗浄し、バッファーを廃棄します。ホモジネートをグラインダーチューブに戻し、氷上でグラインダーチューブ内で乳棒Bをゆっくりと上下に15回動かして、懸濁液を均質化します。
ホモジネートを氷上で予冷した15ミリリットルの収集チューブに移します。グラインダーチューブをさらに2ミリリットルのNLB1で洗浄し、すべての組織片を収集チューブに移してください。ホモジネートを氷上で5分間インキュベートして細胞を溶解します。
ホモジネートを40マイクロメートルのストレーナーに通して、予冷された15ミリリットルの収集チューブに入れます。スイングバケットローターを備えた遠心分離機で、収集チューブを摂氏4度で500倍Gで5分間回転させます。それまでの間、RNase阻害剤溶液をNLB2に追加します。
ペレットを乱すことなく上清を除去します。ペレットを4ミリリットルのNLB2に慎重に再懸濁します。懸濁液をスクロース勾配バッファーの1ミリリットルのクッションで慎重に下敷きにします。
スイングバケットローターを備えた遠心分離機で、懸濁液を摂氏4度で5分間500倍Gで回転させます。その間、RNase阻害剤溶液を核懸濁緩衝液に添加する。遠心分離後、収集チューブを取り扱うときに2つの層を乱さないように注意しながら、遠心分離機から収集チューブをそっと取り外します。
細胞破片は2つの層の間に観察することができます。破片から始めて、上清を慎重に取り除きます。核ペレットを乱すことなく残りの上清を除去し、ペレットを1ミリリットルの核懸濁緩衝液に注意深く再懸濁します。
ホモジネートを20マイクロメートルのストレーナーに通し、予冷した5ミリリットルの蛍光活性化セルソーティング収集チューブに入れます。遺伝子の数を、一意の分子識別子によって定義される転写物の数に対してプロットし、ミトコンドリアリードの割合によって色付けして、単離された核の品質を評価しました。核あたり1, 600個の中央値遺伝子および2, 800個の中央値の固有の分子識別子を有する合計20, 000個の遺伝子が6, 000個の核中に検出された。
クラスター富化マーカーの遺伝子発現パターンはドットプロットを用いて可視化し、細胞型クラスターはt分布確率的近傍埋め込みプロットで可視化した。各細胞型の割合を計算し、近位尿細管と厚い上行肢細胞の比率を決定するために使用しました。常に摂氏4度で作業し、試験走行で最適な組織量を決定して、高品質の懸濁液と最適な濃度を確保することが重要です。
