This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

プラスミドの調製<ol><li>双直交リンケージドメインに融合アンカータンパク質（のOmpA）（アンカー-STとしてこのプロトコルで呼ばれる）、（そのような精製および同定のための6xHis、MYCまたはFLAGタグなど）エピトープタグを含むプラスミド（ 例えば、pET22）を準備し、選択された細菌株7に基づいて複製のペリプラズム局在タグ、抗生物質耐性、および適切な起源。 <ol><li>製造業者のプロトコルに従って市販のDNA単離キットを使用して、一晩の培養物からプラスミドDNAを抽出します。 </li></ol></li><li>プラスミド（ 例えば、pACYC184に）（酵素SCとして、このプロトコルに記載）（PTE）がアンカータンパク質のそれに相補的なバイオ直交結合ドメインに融合したOMV内にパッケージされる酵素/タンパク質を含有する調製、エピトープタグ、ペリプラズム局在タグ、アンカータンパク質のプラスミドとは異なる抗生物質耐性、および適切なORIGレプリケーションの中で選択された細菌株7に基づきます。 <ol><li>製造業者のプロトコル7次市販のDNA単離キットを使用して、一晩の培養物からプラスミドDNAを抽出します。 </li></ol></li></ol> OMV包装大腸菌培養の2世代<ol><li>プラスミド分離<ol><li>酵素SC構築物をコードするプラスミドを精製し、アンカー-STは、製造業者のプロトコール7に従って商用プラスミド単離キットを使用して、別個のメンテナンス細胞株から構築します。 260 nmおよび280 nmの吸光度を測定することにより、DNA濃度及び純度を決定します。 </li></ol></li><li>同時形質転換<ol><li>タンパク質の発現を促進するために市販されている大腸菌株を選択します。 注：BL21（DE3）細胞を、ここに使用しました。 T7溶原菌はPROTためのT7プロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼに依存しているアンカー-STの構築物の発現のために必要とされますEIN表現。他の細菌株の使用は、T7溶原菌遺伝子の存在またはpET22 7以外のプラスミドの使用のいずれかが必要です。 </li><li>その後、選択したコンピテント細胞のための製造者のプロトコルに従って、熱ショック形質転換またはエレクトロポレーションのいずれかを経由してコンピ細菌細胞にそれらを変換する同等のモル濃度に精製されたプラスミドDNAを希釈します。 </li><li>アンピシリン（pET22）及びクロラムフェニコール（のpACYC184）の両方で寒天プレート抗生物質を含むルリア - ベルターニ（LB）上でプレートを形質転換細胞。両方を25μg/ mlの最終濃度で存在します。 </li><li>両方のプラスミドを含む唯一のクローンを単離するために、37℃で一晩培養皿を置きます。 注：抗生物質選択を生き残るコロニーは将来のすべてのOMV調製物に使用されます。抗生物質（アンピシリン及びクロラムフェニコール）は、選択圧を維持し、両方のプラスミドの存在を確実にするために、すべての液体培養物に添加されます。 </li></ol></li></ol> 3. OMV生産<ol><li>コロニー拡張<ol><li> 2.2.4で説明した選択プレートから単一コロニーを上記の濃度で抗生物質を含む培養培地（通常、テリフィックブロス（TB）またはLB）（ステップ2.2.3）の5ミリリットルを接種します。 </li><li>バッフル付き培養フラスコに一晩スターター培養物の100倍希釈：1を実行します。 注：250〜500ミリリットルの間でメディアのボリュームを使用してください。 </li><li>文化の十分な通気が達成されることを保証するために、250 rpmで振盪しながら37℃で培養物を維持します。 </li></ol></li><li>各プラスミドの誘導<ol><li>細菌培養物は、一次成長フラスコの接種後OD 0.6〜0.8の600、成長の約3時間に成長することを可能にします。 </li><li> PTE-SCロードされた小胞の最終収量を向上させるために、15分間、7000×gで培養物全体を遠心分離します。予熱した、新鮮な培地中に細胞ペレットを再懸濁します。 注：このオプトionalステップは、PTE-SC誘導する前に培養培地中に存在する任意の空のOMVを除去するのに役立ちます。 </li><li> 0.22μmのフィルターを用いて水と滅菌フィルターでのL-アラビノースの20％ストック溶液を作ります。 2-4週間4℃で保存L-アラビノースソリューション。 </li><li> PTE-SCの産生を開始するために最後の0.2％濃度になるように培養フラスコにL-アラビノース溶液を加えます。 注：これは、従来の変異体のOmpA-STの誘導を介して増加した小胞形成を促進することにPTE-SCとのペリプラズム空間をプリロードするのに役立ちます。 </li><li> 0.22μmのフィルターを用いて、1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）水溶液および滅菌フィルターを作成します。 注：IPTGは、水和直後に一度使用されなければなりません。 IPTGのアリコートを3~6ヶ月間凍結保存することができ、使用直前に解凍することができます。 </li><li> OmpA-STの産生を開始するために、0.5mMの最終濃度まで追加の3時間のインキュベーション期間後にIPTGを加えます。 </li><li> CULを許可します振盪しながら37℃でさらに8-14時間、成長するチャー。 </li></ol></li></ol> 4. OMV精製<ol><li>無傷細菌の除去<ol><li>無傷の細菌をペレット化し、4℃で7000×gで15分間、細菌培養培地を遠心します。 </li><li>デカントし、細胞ペレットポスト遠心分離は、細胞ペレットを乱さないように注意してくださいの上から、メディアを保存します。 </li><li>繰り返して、すべての無傷の細菌を培養培地は、メディアをデカントし、保存してくださいされてから削除されていることを確認するために、1つの追加の遠心分離サイクルのために4.1.1と4.1.2を繰り返します。 </li></ol></li><li>タンパク質凝集体の除去<ol><li>さらに、残留細菌および望ましくない大きな細胞物質を除去するために0.45μmのメンブレンフィルターを用いて細菌培養液を精製します。 注：高い回収のために生物学的に適合性の膜材料を使用し、例えば、セルロースアセテート（CA）またはポリフッ化ビニリデン（のような低タンパク質吸着PVDF）。および100mLより大きい真空フィルター体積未満シリンジフィルターボリューム。 <ol><li>シリンジフィルターに、滅菌した10〜50ミリリットル注射器に培地を描きます。注射器のルアー端に0.45μmのフィルターを取り付けます。プランジャーを押し下げて、新しい容器にフロースルーを収集します。 </li><li>真空フィルターに、滅菌ろ過装置に培地を転送します。吸引力を生成するために、真空ポンプまたはシンクアスピレーターにユニットを取り付けます。転送は、新しい容器に培地を濾過しました。 </li></ol></li></ol></li><li>超遠心分離を介したOMVの単離<ol><li>遠心機で、対向する管のバランスをとるように注意しながら遠心分離チューブに濾過した培養培地を追加します。 </li><li>楽器とチューブの両方に一致する対応するローターを使用して、超遠心分離機で4℃で3時間〜15万×gでペレットが利用されています。 </li><li>すぐに完了Oにおける、OMVペレットを乱さないように注意しながら、OMVペレットからOMV枯渇培地をデカントOMVペレットがメディアに残るすることを可能にするようFの遠心分離は、OMV回復を減らすペレットを柔らかくします。 注：このペレットはわずかに茶色になり、細菌培養の開始量に応じて、または目で見ることができない場合があります。遠心管の上部から直接メディアを吸引することもOMVから削除複数のメディアが最終OMVのサンプルがされるより純粋をペレット化することを念頭においてオプションです。 </li><li> OMV粒子は完全にメディアから枯渇されたことを確認するために、後で動的光散乱（DLS）テストのための遠心上清を保存します。 </li><li>それはRTで30分間インキュベートすることを可能にするOMVペレットにpH8.0のバッファー濾過滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4または100 mMのN -シクロヘキシル-2-アミノエタンスルホン酸（CHES）0.5〜1 mlを加え。ペレットが乾燥しないことを確認してください。 注：ソリューションのイオン強度、pH、および温度の極端な減少OMVの溶解性をもたらし、aggre促進することができますゲーション。 </li><li>慎重に可溶化されたペレット全体を確実にするために、静かに混合、遠心管から精製されたOMVソリューションをピペット。 </li></ol></li></ol> 5. OMVキャラクタリゼーション<ol><li> OMVのサイズ分布と粒子濃度を決定するために、各機器に固有の提供製造者のプロトコルに従って、任意の市販のDLSまたはナノ粒子追跡ソフトウェアを使用してください。 注：ここでは、OMVサイズ分布と濃度がNanoSight LM10ナノ粒子トラッキングおよびNTA 2.3解析ソフトウェアを利用して決定しました。 <ol><li>ソフトウェアを開きます。 </li><li>顕微鏡の電源をオンにして、顕微鏡とナノ粒子追跡ユニット上のすべての表面を洗浄。 </li><li> 〜任意の空気を注入することなく、全体表示ウィンドウをカバーすることを確認されて1ミリリットルの無菌注射器を用いてフィッティングルアーを通して粒子追跡装置の表示画面に直接OMVサンプルの0.5ミリリットルをシステムに泡を追加します。 </li><li>プレイストン彼は顕微鏡ステージ上のユニットを追跡し、レーザーをオンナノ粒子。 </li><li>ソフトウェアで「キャプチャ」をクリックしてください。 </li><li>ソフトウェアのウィンドウでプレビュー画面の存在上の粒子を可視化するために、顕微鏡の焦点とステージを調整します。 </li><li>明るい粒子が明らかに暗い背景上で可視化されるまで、「カメラシャッター」と「カメラゲイン」を調整してください。 </li><li> 60秒にキャプチャ持続時間を調整します。 </li><li> 「レコード」をクリックしてください。 </li><li>プロンプトが表示されたら、入力サンプル/デバイスの温度は、サンプルを標識し、フォルダを指定されたユーザに実行する各の完了時に映像データを保存します。 </li><li>モードを検出し、クリックして自動ですべての解析パラメータ（検出しきい値、ぼかし、最小トラック長、最小期待される粒子サイズを）キープ」処理シーケンスを。」 注：各パラメータを微調整解析結果に独立して調整することができる方法のマニュアルを参照してください。 </li><li>レコード粒度分布及び粒子/ mソフトウェアによって決定されるL濃度。 注：典型的なOMV流体力学的サイズの範囲は約10×10 8粒子/ mlの濃度で30〜200 nmの間です。 </li></ol></li><li> OMVタンパク質含量を決定します<ol><li> OMV純度、酵素生産、およびSC-STの架橋効率7を評価するために、標準的なSDS-PAGEおよびウエスタンブロットプロトコルを使用してください。 注：架橋効率は100％7になりません。 </li></ol></li></ol>酵素包装の6.検証<ol><li> PTE活性アッセイ<ol><li>いずれかのキュベット中、25℃で適切な緩衝液などの、100mMのCHES緩衝液（pH 8）中のすべての酵素アッセイを行うまたは96/384ウェルプレート中に多重化されます。 </li><li> 1の5μlの追加：CHES90μlの精製OMVの5μlにCHES緩衝液中のパラオキソン1,000希釈（〜36倍培養培地中に存在するOMVの濃度に比べて濃縮さ）。 注意：パラオキソンは有毒農薬でありますそして、メーカーや制度ガイドラインごとに処理する必要があります。 </li><li> 405 nmで一定の間隔で吸光度測定（〜2時間の総反応時間ごとに20秒）を取る（ε= 18.1 mMの-1 cm -1 で ）と348 nmの（等吸収点のε= 5.4 mMの-1 cm -1 で ）までに発色性パラオキソン分解産物、p個のニトロフェノールの反応の進行を監視します。 注：8上記のpH値でのpニトロフェノールの支配的な脱プロトン化形態は、405 nmで正確なモニタリングを可能にする存在です。他のすべての複雑なまたはより低いpH溶液では、p個のニトロフェノールの複数の形態が存在することになるとして348 nmでの等吸収点を利用する必要があります。 </li><li>各サンプル、パッケージング効率、および総PTE生産にPTEの相対量を比較するために、ステップ6.1.3からの進行曲線の直線部分の傾きを決定することによって、初期反応速度を計算します。 </li><li>標準的な酵素を実行しますOMVのためにK M、V maxとの k catを決定するためのアッセイプロトコルは、PTEをカプセル化。 注：ラインウィーバー-バーク分析は、y切片= 1 / V maxおよび傾き= K M / V maxの20これらの動力学的パラメーターの決意に利用することができます。 </li></ol></li><li>貫通基板/製品の普及。 <ol><li>ボリュームによって0から3パーセントからCHES緩衝液中のトリトンX-100の濃度の増加を利用するステップ6.1で説明したのと同じ動的アッセイ分析を実行します。 注：OMVの内容は反応溶液に自由にアクセスできるようにするためにできるように脂質二重層を破壊する可溶化OMV機能へのトリトンX-100の追加。 </li><li>計算し、アクティビティiを酵素に比較して酵素活性の変化が最小限である（初期速度）で示される基材/製品の貫通通路を確認するために、それぞれのトリトンX-100レベルでの初期速度を比較nはトリトンX-100の存在しません。酵素活性の実質的な増加は、トリトンX-100の存在下で観察された場合には、基板が自由OMV中に拡散しないようです。 </li><li>その酵素活性を検証するためのトリトンX-100の存在下でアッセイ遊離酵素活性（セクション6.1で上述したように）界面活性剤単独では阻害されません。 注：活性が大幅トリトンX-100の影響を受けている場合、例えば、サポニンまたは様々なポリソルベート/トゥイーン界面活性剤などの代替添加剤は、OMV膜を破壊することがより適切であり得ます。 </li></ol></li></ol> 7. OMVストレージ<ol><li>凍結<ol><li>直接液体窒素中に精製されたOMVの場所〜100μlアリコートは、スナップ必ず完全にバイアルを水没またはサンプル自体に任意の液体窒素に接触しないというアリコートを凍結します。 注：精製したOMVは、スナップpurificat中にOMVペレットを可溶化するために選択したバッファに直接凍結させることができます7必要に応じていない追加の凍結保護剤とのイオンプロセス。 </li><li> -80℃でスナップ凍結アリコートを保管してください。 </li><li>サンプルを加熱しないでくださいというRTでそれらを配置することによって、ステップ7.1.1から凍結した一定分量を解凍します。 </li><li>このように、ストレージのすべてのサンプルを準備する前には、前と酵素活性のポスト凍結融解の有意な損失がないことを確認するために、凍結後に初期速度を比較するステップ6.1で説明した酵素アッセイを行います。 注：酵素活性の低下が原因で凍結することが観察されている場合Storeは4℃でOMVを精製しました。 </li></ol></li><li>凍結乾燥<ol><li>市販の凍結乾燥機21を利用し 、スナップ凍結し、精製OMVアリコートを凍結乾燥。 </li><li>ストアは、数週間または何ヶ月のために-80℃でRTでアリコートを凍結乾燥させました。 </li><li>凍結乾燥する前のような凍結乾燥OMVに精製された同体積の水を追加し、トンを再水和するために室温で30分間放置彼はサンプリングします。 OMVをボルテックスまたは超音波処理しないように注意してくださいされて、必要なときに穏やかに混合します。 </li><li>ポイント・オブ・ケア希釈前/可溶化を必要としないアプリケーションのために直接凍結乾燥OMV粉末を追加します。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Avila-Calderon, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+bacterial+membrane+vesicles.">Roles of bacterial membrane vesicles.</a> Arch. Microbiol. 197, 1-10 (2015).</li><li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annu. Rev. Microbiol. 64, 163-184 (2010).</li><li>Beveridge, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+Gram+negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles.">Structures of Gram negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J. Bacteriol. 181, 4725-4733 (1999).</li><li>Kulkarni, H. M., Jagannadham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+multifaceted+roles+of+outer+membrane+vesicles+from+Gram-negative+bacteria.">Biogenesis and multifaceted roles of outer membrane vesicles from Gram-negative bacteria.</a> Microbiology. 160, 2109-2121 (2014).</li><li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74, 81-94 (2010).</li><li>Berleman, J., Auer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+bacterial+outer+membrane+vesicles+for+intra-+and+interspecies+delivery.">The role of bacterial outer membrane vesicles for intra- and interspecies delivery.</a> Environ. Microbiol. 15, 347-354 (2013).</li><li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+nanobioreactors-directing+enzyme+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 7, 24963-24972 (2015).</li><li>Kim, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+with+enhanced+functionality.">Engineered bacterial outer membrane vesicles with enhanced functionality.</a> J. Mol. Biol. 380, 51-66 (2008).</li><li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles.">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 286, 1269-1276 (2011).</li><li>Kesty, N. C., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+heterologous+outer+membrane+and+periplasmic+proteins+into+Escherichia+coli+outer+membrane+vesicles.">Incorporation of heterologous outer membrane and periplasmic proteins into Escherichia coli outer membrane vesicles.</a> J. Biol. Chem. 279, 2069-2076 (2003).</li><li>Zakeri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+tag+forming+a+rapid+covalent+bond+to+a+protein,+through+engineering+a+bacterial+adhesion.">Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, e690-e697 (2012).</li><li>Li, L., Fierer, J. O., Rapoport, T. A., Howarth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+and+optimization+of+the+covalent+association+between+SpyCatcher+and+a+peptide+tag.">Structural analysis and optimization of the covalent association between SpyCatcher and a peptide tag.</a> J. Mol. Biol. 426, 309-317 (2014).</li><li>Dumas, D. P., Durst, H. D., Landis, W. G., Raushel, F. M., Wild, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+organophosphorus+nerve+agents+by+the+phophotriesterase+from+Pseudomonas-Diminuta.">Inactivation of organophosphorus nerve agents by the phophotriesterase from Pseudomonas-Diminuta.</a> Arch. Biochem. Biophys. 277, 155-159 (1990).</li><li>Bigley, A. N., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+mechanisms+for+phosphotriesterases.">Catalytic mechanisms for phosphotriesterases.</a> Biochimica et Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteomics. 1834, 443-453 (2013).</li><li>Minton, N. A., Murray, V. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+organo-phosphate+poisoning.">A review of organo-phosphate poisoning.</a> Med. Toxicol. Adverse Drug Exper. 3, 350-375 (1988).</li><li>Bigley, A. N., Xu, C., Henderson, T. J., Harvey, S. P., Raushel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+neutralization+of+the+chemical+warfare+agent+VX:+Evolution+of+phosphotriesterase+for+phosphorothiolate+hydrolysis.">Enzymatic neutralization of the chemical warfare agent VX: Evolution of phosphotriesterase for phosphorothiolate hydrolysis.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 10426-10432 (2013).</li><li>Chatterjee, S. N., Chaudhuri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gram-negative+bacteria:+the+cell+membranes.">Gram-negative bacteria: the cell membranes.</a> Outer Membrane Vesicles of Bacteria. SpringerBriefs in Microbiology. , 15-34 (2012).</li><li>Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+function+of+OmpA+in+Escherichia+coli.">The function of OmpA in Escherichia coli.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 292, 396-401 (2002).</li><li>Danoff, E. J., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soluble,+periplasmic+domain+of+OmpA+folds+as+an+independent+unit+and+displays+chaperone+activity+by+reducing+the+self-association+propensity+of+the+unfolded+OmpA+transmembrane+beta-barrel.">The soluble, periplasmic domain of OmpA folds as an independent unit and displays chaperone activity by reducing the self-association propensity of the unfolded OmpA transmembrane beta-barrel.</a> Biophys. Chem. 159, 194-204 (2011).</li><li>Alves, N. J., Kline, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+the+inhibition+of+plasmin+and+delta-plasmin+via+benzamidine+derivatives.">Comparative study on the inhibition of plasmin and delta-plasmin via benzamidine derivatives.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 457, 358-362 (2015).</li><li>Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lyophilization+and+development+of+solid+protein+pharmaceuticals.">Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.</a> Int. J. Pharm. 203, 1-60 (2000).</li><li>Goormaghtigh, E., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Density-based+separation+of+liposomes+by+glycerol+gradient+centrifugation.">Density-based separation of liposomes by glycerol gradient centrifugation.</a> Anal. Biochem. 159, 122-131 (1986).</li><li>Alves, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalized+liposome+purification+via+Liposome+Extruder+Purification+(LEP).">Functionalized liposome purification via Liposome Extruder Purification (LEP).</a> Analyst. 138, 4746-4751 (2013).</li><li>Mayer, L. D., StOnge, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+free+and+liposome-associated+doxorubicin+and+vincristine+levels+in+plasma+under+equilibrium+conditions+employing+ultrafiltration+techniques.">Determination of free and liposome-associated doxorubicin and vincristine levels in plasma under equilibrium conditions employing ultrafiltration techniques.</a> Anal. Biochem. 232, 149-157 (1995).</li><li>Blakeley, B. D., Chapman, A. M., McNaughton, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-superpositive+GFP+reassembly+is+a+fast,+efficient,+and+robust+method+for+detecting+protein-protein+interactions+in+vivo.">Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo.</a> Mol. BioSyst. 8 (2036), (2012).</li><li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils:+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding.">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li><li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

代表性を実証するために、このプロトコル機能は、目的の酵素が生産され、 大腸菌によりOMVにパッケージ化されたパッケージング技術を指示しました。多くの複雑な技術と同様のプロトコルは以下に詳述されているいくつかの異なるユニークな用途での使用に適応するように変更することができる複数の領域が存在します。 OMVのパッケージングと酵素カプセル化のメカニズムは、特?...

ここで紹介するには、設計、生産、および酵素ロード細菌の外膜小胞（OMV）の精製方法です。 OMVは、30から200 nmの1,2からサイズの範囲でプロテオ主に単層、小さいです。現在までに研究されているすべてのグラム陰性及びグラム陽性菌は、その表面3,4からOMVまたは細胞外小胞（EV）のいずれかの放出を示しました。 OMVが生成されることにより、正確なメカニズムは完全に起因する彼らだけでなく、彼らが仕える様々な機能を分泌し、多様な細菌集団に解明されていません。 OMVは、複雑なシグナル伝達、遺伝子転座の様々なサービスを提供する遺伝物質を小分子、ペプチド、及びタンパク質から貨物の広い範囲を輸送することが示されており、毒性は5,6機能します。 OMVの生合成の正確なメカニズムは十分に特徴付けられ、そして細菌種間で異なるように思われていません。 THIにもかかわらず、事実は、我々は、目的のタンパク質と細菌の外膜に非常に豊富なタンパク質の内因性およびその後のOMVの間の合成結合を作成することによりOMVへの組換えタンパク質のパッケージング効率を高めるための方法を開発しました。合成結合、または人工的に組み込まれた親和性の非存在下で、組換えにより発現されたタンパク質およびOMVの間に観測されたパッケージング効率は7非常に低いです。この結果は、どちらかがよく理解されていないメカニズムによって細菌表面にまたは指向包装を通してOMV形成の正確な瞬間に偶然カプセル化を介して起こるOMV内のタンパク質の取り込みとして期待されます。第他人と比較して高い効率でパッケージング、いくつかのタンパク質との依存性タンパク質は非常にいくつかの成功は偶然のカプセル化が、効果的なパッケージに依存してペリプラズム空間内で過剰発現は、単にを通じてパッケージングタンパク質で観察されているですまったく8-10でパッケージ化しないでください。我々は同時に、パッケージを生成し、OMVが形成されている方法と貨物がために細菌によって選択される方法に関する現在の知識の限界を回避するOMVに関心の活性酵素を分泌する大腸菌 （E. coli）を操作するために求められる一般的な合成生物学の技術を利用することによって包装。 本出願の目的のためにスプリットタンパク質バイオコンジュゲーションシステムは、OMVに指向性パッケージングを容易にするために選択した合成結合として選択しました。名前が示すように、分割のタンパク質バイオコンジュゲーションシステムは、互いに相互作用する二つの相補的なサブドメインで構成されています。このプロトコルの目的のために選択された分割されたタンパク質ドメインはSpyCatcher（SC）とSpyTag（ST）ドメインと呼ばれ、 化膿連鎖球菌のフィブロネクチン結合タンパク質（FbaB）11から誘導されます。この分割されたタンパク質系は、ワットに珍しいです鶏は、2つのサブユニットが近接範囲内であるイソペプチド結合は、自然に共有結合を作成酸およびリジンのアミノ酸残基アスパラギン近位の間に形成されます。イソペプチド結合の形成は、シャペロンタンパク質、触媒酵素、または補因子の添加を必要とせず、容易に室温（RT）で、かつ生理学的に関連する条件12の広い範囲にわたって起こり得ます。 コンセプトの証明としては、Brevundimonasのディミニュータからホスホトリエステラーゼ（PTE）（EC 3.1.8.1）は、OMV 13由来の大腸菌にパッケージ化されるように選択されました。 PTEは、二核のZn / Znの活性部位を含み、ジアルキルホスフェートおよびアリールアルコール14にaryldialkylphosphatesを変換する加水分解反応を通じて有機リン酸塩を打破する能力を有しています。有機リンへの曝露は、神経筋接合部のmakinでアセチルコリンエステラーゼによってアセチルコリンの加水分解を阻害することにより、適切な神経伝達物質の機能を損ないます15非常に危険グラムの有機リン由来の化合物。有機リン酸エステルへの長期的または重大なエクスポージャーは、一般的に制御不能な痙攣をもたらし、一般的に窒息を介して死を引き起こします。 PTEは、パラオキソンに向かって最も高い触媒活性を示すが、非常に強力な殺虫剤は、また、他の殺虫剤とV / G型化学神経剤16の広い範囲を加水分解することが可能です。 OMVのパッケージングを容易にするために、細菌プラスミド、誘導性プロモーターを含む遺伝子構築物、ペリプラズム局在化配列、およびSC遺伝子配列の上流の短い多重クローニング部位をコードするように設計しました。 OMV包装用ペリプラズム空間にPTE-SC融合タンパク質を標的に遺伝スイッチの作成を許可されたリーダーとSC配列との間のPTE遺伝子の挿入。ここで説明する努力がPTEに焦点を当てながら、酵素遺伝子が交換可能であると容易にFACに別の遺伝子配列で置換することができ代替酵素またはタンパク質のilitate包装。 合成結合の第二の部分として、豊富な外膜タンパク質（のOmpA）は、STペプチド配列を提示するように選択されます。アンカータンパク質の選択を変えることができるが、タンパク質がペリプラズム空間に提示許容ドメインを有し、細胞毒性を誘発することなく融合構築を許容することが不可欠である、OMV中に存在することが知られており、それは、組換えとき凝集していません生産。 OmpAは非常に細菌の外膜およびその後のOMV 17内で発現することが知られている37.2 kDaの膜貫通ポリンタンパク質です。これは、大きさが2nmで細菌膜18を横切って、&lt;、小分子の輸送に関与しています。ネイティブのOmpAは、2つの構造のユニークなドメイン、膜貫通βバレルモチーフとペプチドグリカン19と相互作用することが知られペリプラズム可溶性C末端部分を有しています。変異型のOmpA-ST融合デザイン性でDここでのOmpAのC末端部分は削除されたとSTは、ペリプラズムに面しN末端またはC末端に融合させました。 OmpAのペリプラズム部分を削除すると、外膜と超小胞7につながる膜不安定化をもたらしペプチドグリカンとの間の相互作用の数を減少させます。ゲノムのOmpAは、総膜不安定化を緩和するために、組換え的に発現のOmpA-ST構築に加えて維持しました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">IPTG</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Can be prepared ahead of time and stored at 4C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">TB/LB Culture Media</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Other growth medias will likely work similarly.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">One of many potential suitable surfactants.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Baffled culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">The baffles promote higher levels of aeration.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">CHES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:96px;">BP318-100</td>
			<td style="width:273px;">Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &#62; 8).</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Paraoxon</td>
			<td style="width:93px;">Chem Service</td>
			<td style="width:96px;">N-12816</td>
			<td style="width:273px;">Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Syringe Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">60183-221&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (30 mm)</td>
			<td style="width:273px;">Filter diameter will depend on volume of sample.&#160; Low protein binding membrane is critical.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:93px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:96px;">Excella E24</td>
			<td style="width:273px;">Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Sorvall Culture Centrifuge</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">RC 5B PLUS</td>
			<td style="width:273px;">Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Sorvall Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">WX Ultra 90</td>
			<td style="width:273px;">Capable of centrifugal forces &#8805;150,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">AH-629</td>
			<td style="width:273px;">Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (25 x 89 mm)</td>
			<td style="width:93px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:96px;">344058</td>
			<td style="width:273px;">Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Tecan</td>
			<td style="width:96px;">Infinite M1000</td>
			<td style="width:273px;">Necessary for enzyme kinetic assays.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">DLS / particle tracking</td>
			<td style="width:93px;">NanoSight&#160;</td>
			<td style="width:96px;">LM10</td>
			<td style="width:273px;">Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:93px;">NEB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Suitable bacterial expression strain.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">pET22</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:96px;">69744-3</td>
			<td style="width:273px;">Other plasmids can be used in place of these.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">pACYC184</td>
			<td style="width:93px;">NEB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Other plasmids can be used in place of these.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td style="width:96px;">28704</td>
			<td style="width:273px;">Example kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

外膜小胞（OMV）をプログラムするために、合成生物学の技術を適用する際の関心の高まりは、従来のナノ粒子が合成することが非常に困難証明しているOMVのためのいくつかの非常に興味深く、ユニークなアプリケーションにつながっています。現在までに、すべてのグラム陰性菌には、小分子、ペプチド、タンパク質および遺伝物質を含む貨物の種々のOMV実証パッケージを生成することが示されています。それらの多様な貨物に基づいて、OMVは、細胞間コミュニケーションの遺伝子導入及び細菌がOMVを生成しているに応じて病原性因子の送達に至るまで多くの生物学的プロセスに関与しています。ごく最近になって、細菌のOMVは制御し、OMVへの組換えタンパク質の直接包装するための技術の開発を通じてアプリケーションの広い範囲にわたって使用するためにアクセス可能となっています。このプロトコルは、生産、精製する方法を記載し、そして酵素の使用を向上Overaのために提供するOMVをパッケージ化組換え酵素、小胞形成の増加、及び強化酵素安定性のLL製造。このプロトコルの成功利用は同時に、組換えタンパク質を産生する組換えタンパク質および外膜アンカータンパク質との間に合成リンケージを作成を通じてOMVのカプセル化のためにそれを指示する細菌株の作成になります。医薬品送達、医療診断、および環境修復：このプロトコルはまた、などの他のユニークなアプリケーションのための使用のためにこのプロトコルを適応する際に考慮すべき細菌培養と同様に適切な取り扱い技術や物事からOMVを単離するための方法を詳しく説明します。

このプロトコールで詳述OMVパッケージング戦略のために必要とされるように、2つの組換えタンパク質の同時発現は、異なる道の数を介して達成することができます。ここでは、2つのベクター系は、複製と独立した誘導性遺伝子カセットの互換性の起源で利用されました。 PTE-SCの発現のために商業的なプラスミド骨格（pACY184）を構築アラビノース誘導性遺伝子カセッ...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification at JoVE.com

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;：デザイン、生産および精製

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K ビュー.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

ビデオ: Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

生化学

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

豊かさと充電転送エシェリヒア属大腸菌の Rna のレベルの定量化

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

エシェリヒア属大腸菌のウイロイド派生システムを使用して円形の足場に組換え Rna の大量生産

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

サイト指示された突然変異誘発のため生体外でそしてエシェリヒア属大腸菌の RNA 相互作用に代表される生体実験

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

鶏卵からの外側および内側のペリビテリンサブ層の機械的分離とタンパク質可溶化

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

からの外膜小胞内の指向性タンパク質包装

要約

さらに動画を探す

この動画の章