This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

1. Preparazione di plasmidi <ol><li> Preparare un plasmide (ad esempio, pET22) contenente la proteina di ancoraggio (OmpA) fusa a un dominio di legame biortogonale (di cui al presente protocollo come anchor-ST), tag epitopo (come 6xHis, myc o la bandiera tag per la purificazione e identificazione), tag periplasmic localizzazione, la resistenza agli antibiotici, e l&#39;origine appropriata di replica in base al ceppo batterico selezionato 7. <ol><li> Estrarre il DNA plasmide da culture durante la notte utilizzando un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore. </li></ol></li><li> Preparare un plasmide (ad esempio, pACYC184) contenente l&#39;enzima / proteine (PTE) da confezionare all&#39;interno della OMV fusa al dominio di legame bioorthogonal complementare a quella della proteina di ancoraggio (denominato nel presente protocollo come enzima-SC), epitopo, tag periplasmic localizzazione, la resistenza agli antibiotici che è diverso da quello del plasmide proteine ​​di ancoraggio, e orig appropriatain di replica basata sul ceppo batterico selezionato 7. <ol><li> Estrarre il DNA plasmide da culture durante la notte utilizzando un kit di isolamento del DNA disponibile in commercio seguendo il protocollo 7 del produttore. </li></ol></li></ol> 2. Generazione di un OMV Packaging E. coli Cultura <ol><li> Isolamento plasmidi <ol><li> Purificare plasmidi che codificano l&#39;enzima-SC costruire ed ancoraggio-ST costruisce da linee cellulari di manutenzione separati utilizzando un kit di isolamento plasmide commerciale come da protocollo 7 del produttore. Determinare la concentrazione di DNA e la purezza misurando l&#39;assorbanza a 260 nm e 280 nm. </li></ol></li><li> Co-trasformazione <ol><li> Selezionare un ceppo di E. coli che è disponibile in commercio per facilitare l&#39;espressione delle proteine. NOTA: BL21 cellule (DE3) sono stati utilizzati qui. Il lysogen T7 è necessaria per l&#39;espressione del costrutto ancoraggio-ST, che si basa sul promotore T7 e T7 RNA polimerasi per protespressione ein. L&#39;uso di altri ceppi batterici richiede o la presenza del gene lysogen T7 o l&#39;uso di un plasmide diverso pET22 7. </li><li> Diluire purificato DNA plasmidico a concentrazioni molari equivalenti poi trasformarle in cellule batteriche competenti tramite uno shock termico trasformazione o elettroporazione seguenti protocollo del produttore per le cellule competenti scelti. </li><li> cellule piastra trasformato Onto antibiotico contenente Luria-Bertani (LB) piastre di agar sia con ampicillina (pET22) e cloramfenicolo (pACYC184); entrambi presenti a concentrazioni finali di 25 ug / ml. </li><li> Porre la capsula cultura a 37 ° C durante la notte per isolare solo i cloni che contengono entrambi i plasmidi. NOTA: Le colonie che sopravvivono selezione antibiotica saranno utilizzati per tutti i futuri preparati OMV. Antibiotici (ampicillina e cloramfenicolo) saranno aggiunti a tutti colture liquide per mantenere la pressione selettiva e garantire la presenza di entrambi i plasmidi. </li></ol></li></ol> 3. OMV Produzione <ol><li> Colony espansione <ol><li> Seminare 5 ml di terreni di coltura (tipicamente Brodo Terrific (TB) o LB) contenenti antibiotici alle concentrazioni di cui sopra (punto 2.2.3) con una singola colonia dalle piastre di selezione descritti al punto 2.2.4. </li><li> Eseguire una diluizione 1: 100 volte della coltura starter durante la notte in fiasche di coltura sconcertato. NOTA: utilizzare un volume di file multimediali tra 250-500 ml. </li><li> Mantenere la coltura a 37 ° C agitando a 250 rpm per garantire che sufficiente aerazione della cultura è raggiunto. </li></ol></li><li> Induzione di ogni plasmide <ol><li> Lasciare che la coltura batterica a crescere ad un OD 600 di 0,6-0,8, a circa 3 ore di crescita dopo l&#39;inoculazione del pallone di crescita primario. </li><li> Per migliorare la resa finale del PTE-SC vescicole caricate, centrifugare l&#39;intera cultura a 7.000 xg per 15 min. Risospendere il pellet di cellule in pre-riscaldato, terreni di coltura fresco. NOTA: Questo optionale passaggio consente di rimuovere qualsiasi OMV vuoto che sono presenti nel terreno di coltura prima dell&#39;induzione PTE-SC. </li><li> Ottenere una soluzione stock al 20% di L-arabinosio in acqua e filtro sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron. Conservare la soluzione L-arabinosio a 4 ° C per 2-4 settimane. </li><li> Aggiungere la soluzione L-arabinosio al pallone di coltura ad una concentrazione finale dello 0,2% di avviare la produzione PTE-SC. NOTA: Questo aiuta a precaricare spazio periplasmatico con PTE-SC prima di promuovere una maggiore vescicolazione attraverso l&#39;induzione del mutante OmpA-ST. </li><li> Fare una soluzione 1 M isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) in acqua e filtro sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron. NOTA: IPTG deve essere utilizzato immediatamente una volta idratato. Aliquote di IPTG possono essere conservati congelati per 3-6 mesi e possono essere scongelati immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Aggiungere IPTG dopo un ulteriore periodo di incubazione 3 ore ad una concentrazione finale di 0,5 mM di avviare la produzione del OmpA-ST. </li><li> Lasciare che il culture a crescere per un ulteriore 8-14 ore a 37 ° C sotto agitazione. </li></ol></li></ol> 4. OMV Purificazione <ol><li> Rimozione dei batteri Intact <ol><li> Centrifugare terreni di coltura batterica per 15 min a 7000 xga 4 ° C per sedimentare batteri intatti. </li><li> Decantare, e salvare, i media la parte superiore del post centrifugazione pellet cellulare facendo attenzione a non disturbare il pellet. </li><li> Ripetere i punti 4.1.1 e 4.1.2 per un ciclo di centrifugazione ulteriore per garantire tutti i batteri intatti vengono rimossi dal terreno di coltura avendo cura di decantare e salvare i media. </li></ol></li><li> La rimozione di aggregati proteici <ol><li> Ulteriori purificare il terreno di coltura batterica usando un filtro da 0,45 micron a membrana per rimuovere batteri residui e grande materiale cellulare indesiderato. NOTA: utilizzare un materiale a membrana biologicamente compatibile per i recuperi più elevati e minore assorbimento di proteine, come acetato di cellulosa (CA) o polivinilidene difluoruro (PVDF). volumi filtri Siringa meno di 100 ml e volumi filtra sotto vuoto superiore a 100 ml. <ol><li> Per il filtro della siringa, disegnare terreno di coltura in siringa sterile 10-50 ml. Fissare 0,45 micron filtro per Luer fine della siringa. Premere stantuffo e raccogliere flusso continuo in una nuova nave. </li><li> Per aspirare il filtro, il trasferimento terreno di coltura ad un apparato di filtrazione sterile. Fissare unità a vuoto della pompa o affondare aspiratore per generare aspirazione. Trasferimento medio filtrata a nuova nave. </li></ol></li></ol></li><li> Isolamento di OMV via Ultracentrifugazione <ol><li> Aggiungere il terreno di coltura filtrato in tubi centrifugazione facendo attenzione a bilanciare i tubi opposte nella centrifuga. </li><li> Pellet a ~ 150.000 xg per 3 ore a 4 ° C in un&#39;ultracentrifuga utilizzando il rotore corrispondente corrispondenza dello strumento e tubi essendo utilizzata. </li><li> Decantare il terreno di coltura impoverito OMV dal pellet OMV, facendo attenzione a non disturbare il pellet OMV, immediatamente al completamento of centrifugazione a consentire il pellet OMV rimanere nei media ammorbidire il pellet riducendo recupero OMV. NOTA: Questo pellet sarà leggermente marrone e seconda della quantità di partenza di coltura batterica può o non può essere visibile ad occhio. Aspirare il supporto direttamente dalla parte superiore del tubo di centrifugazione è anche un&#39;opzione tenendo presente che i media più rimossi dal OMV pellet più pura campione finale OMV sarà. </li><li> Salvare il surnatante centrifugato per la prova successiva Dynamic Light Scattering (DLS) per verificare che le particelle OMV sono state completamente esaurite da parte dei media. </li><li> Aggiungere 0,5-1 ml di soluzione sterile a pH 7,4 o 100 mM N -Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic tampone filtrata tampone fosfato (PBS) Acido (CHES) a pH 8,0 al pellet OMV permettendogli di incubare per 30 minuti a RT. Assicurarsi che il pellet non si asciughi. NOTA: Gli sbalzi di soluzione forza ionica, il pH e la temperatura può causare ridotta solubilità OMV e promuovere aggregazione. </li><li> pipetta con attenzione la soluzione purificata OMV dalla provetta, mescolando delicatamente per garantire l&#39;intero pellet è stato solubilizzato. </li></ol></li></ol> 5. OMV Caratterizzazione <ol><li> Utilizzare qualsiasi software DLS o di monitoraggio nanoparticelle disponibile in commercio seguendo i protocolli del produttore fornito uniche per ogni strumento per determinare la distribuzione delle dimensioni OMV e concentrazione di particelle. NOTA: Qui, distribuzione delle dimensioni OMV e la concentrazione è stata determinata utilizzando NanoSight LM10 nanoparticelle di monitoraggio e NTA 2.3 Software di analisi. <ol><li> Aprire il software. </li><li> Accendere il microscopio e pulire tutte le superfici dell&#39;unità microscopio e il monitoraggio delle nanoparticelle. </li><li> Aggiungere ~ 0,5 ml di OMV campione direttamente alla finestra di visualizzazione del dispositivo di tracciamento di particelle attraverso il raccordo Luer con 1 ml siringa sterile avendo cura di coprire l&#39;intera finestra di visualizzazione senza iniettare eventuali bolle d&#39;aria nel sistema. </li><li> luogo tegli nanoparticelle unità di monitoraggio sul palco microscopio e accendere il laser. </li><li> Fai clic su &quot;Capture&quot; nel software. </li><li> Regolare il fuoco microscopio e mettere in scena per visualizzare le particelle sullo schermo di anteprima presente nella finestra del software. </li><li> Regolare il &quot;Shutter&quot; e &quot;guadagno della telecamera&quot; fino a quando le particelle brillanti sono chiaramente visualizzati su uno sfondo scuro. </li><li> Regolare la durata di cattura per 60 sec. </li><li> Fai clic su &quot;Record&quot;. </li><li> Quando richiesto, immettere la temperatura del / dispositivo campione, etichettare il campione, e salvare i dati video al termine della ciascuna correre in una cartella utente designato. </li><li> Tenere tutti i parametri di analisi (Rilevazione soglia, Blur, lunghezza minima traccia, Min atteso Particle Size) su auto modalità di rilevamento e cliccare su &quot;svolgimento del processo.&quot; NOTA: Consultare il manuale per come ogni parametro può essere regolato in modo indipendente per fini risultati delle analisi sintonia. </li><li> Record distribuzione granulometrica e particelle / mconcentrazione l come determinato dal software. NOTA: Una tipica gamma di dimensioni idrodinamica OMV è compresa tra 30-200 nm con una concentrazione di particelle / ml di ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Determinazione OMV contenuto proteico <ol><li> Utilizzare SDS-PAGE e protocolli standard Western Blot per valutare la purezza OMV, la produzione di enzimi, e l&#39;efficienza di reticolazione SC-ST 7. NOTA: La reticolazione efficienza non sarà al 100% 7. </li></ol></li></ol> 6. Verifica di Enzyme Packaging <ol><li> PTE Activity Assay <ol><li> Eseguire tutti saggi enzimatici in un tampone adatto ad esempio 100 mM CHES tampone (pH 8) a 25 ° C sia in una cuvetta o multiplato in un piatto ben 96/384. </li><li> Aggiungere 5 ml di una diluizione 1: 1.000 in tampone paraoxon CHES a 90 ml di CHES e 5 ml di purificato OMV (~ 36 volte concentrato rispetto alla concentrazione OMV presente nei mezzi di coltura). Attenzione: Paraoxon è un pesticida tossicoe deve essere gestito per produttore e linee guida istituzionali. </li><li> Le letture di assorbanza a intervalli regolari (ogni 20 sec per ~ tempo di reazione totale di 2 ore) a 405 nm (ε = 18.1 mM -1 cm -1) e a 348 nm (ε punto isosbestic = 5.4 mM -1 cm -1) monitorare la progressione della reazione il prodotto guasto paraoxon cromogenico, p -nitrophenol. NOTA: A valori di pH superiore a 8 è presente la forma deprotonato dominante di p -nitrophenol consentendo accurato monitoraggio a 405 nm. In tutte le altre soluzioni pH complessa o inferiore è necessario utilizzare il punto isosbestico di 348 nm come molteplici forme di p -nitrophenol saranno presenti. </li><li> Calcolare velocità di reazione iniziali determinando la pendenza della porzione lineare delle curve progressi dal punto 6.1.3 di confrontare in ciascun campione, efficienza confezionamento e produzione totale PTE la quantità relativa di PTE. </li><li> Eseguire enzimatica di serieprotocolli di analisi per determinare K M, V max e K gatto per la OMV incapsulati PTE. NOTA: un&#39;analisi Lineweaver-Burk può essere utilizzato per la determinazione di questi parametri cinetici dove l&#39;intercetta = 1 / V max e pendenza = K M / V max 20. </li></ol></li><li> Transmembrane substrato / diffusione del prodotto. <ol><li> Eseguire la stessa analisi analisi cinetica come descritto al punto 6.1 utilizzando concentrazioni crescenti di Triton X-100 in tampone CHES da 0-3% in volume. NOTA: L&#39;aggiunta di Triton X-100 per le funzioni solubilizzate OMV perturbare il doppio strato lipidico consentendo il contenuto della OMV il libero accesso alla soluzione di reazione. </li><li> Calcolare e confrontare le velocità iniziali per ogni livello di Triton X-100 per verificare transmembrana passaggio del substrato / prodotto indicato dal minimo cambiamento nell&#39;attività enzimatica (velocità iniziali) rispetto al enzimatica in mancanza di Triton X-100. Se un sostanziale aumento dell&#39;attività enzimatica è osservata in presenza di Triton X-100 è probabile che il substrato non diffonde liberamente nel OMV. </li><li> attività enzimatica libera Assay (come descritto sopra nel paragrafo 6.1) in presenza di Triton X-100 per verificare che l&#39;attività enzimatica non è inibita dal tensioattivo stesso. NOTA: Se l&#39;attività è notevolmente influenzato dalle Triton X-100, additivi alternativi, come saponine o vari polisorbato / tensioattivi interpolazione può essere più adatto alla rottura della membrana OMV. </li></ol></li></ol> 7. OMV bagagli <ol><li> Congelamento <ol><li> aliquote luogo ~ 100 ml di purificato OMV direttamente in azoto liquido a scatto per congelare il aliquote assicurandosi di non immergere completamente le fiale o contattare qualsiasi azoto liquido con il campione stesso. NOTA: purificata OMV può essere congelato a scatto direttamente nel buffer che è stato selezionato per solubilizzare il pellet OMV durante il depuprocesso ionico senza crioprotettori supplementari necessari 7. </li><li> Conservare le aliquote a scatto congelato a -80 ° C. </li><li> Scongelare aliquote congelate dal punto 7.1.1 mettendoli a temperatura ambiente assicurandosi di non riscaldare i campioni. </li><li> Prima di preparare tutti i campioni per la conservazione in questo modo eseguire il saggio enzimatico descritto al punto 6.1 confrontando velocità iniziali prima e dopo il congelamento per verificare che non vi è alcuna perdita significativa di attività enzimatica dopo congelamento-scongelamento. NOTA: Conservare purificato OMV a 4 ° C se una riduzione dell&#39;attività enzimatica si osserva dovuti al gelo. </li></ol></li><li> Liofilizzazione <ol><li> Lyophilize gli snap congelato purificati aliquote OMV che utilizzano attrezzature liofilizzazione disponibili in commercio 21. </li><li> Conservare aliquote liofilizzato a temperatura ambiente per settimane oa -80 ° C per molti mesi. </li><li> Aggiungere lo stesso volume di acqua purificata al liofilizzato OMV come prima liofilizzazione e lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 min per reidratare tlui campione. Mescolare delicatamente quando sia necessario assicurarsi di non vortice o ultrasuoni la OMV. </li><li> Aggiungere polvere liofilizzata OMV direttamente al punto di cura per le applicazioni dove prima diluizione / solubilizzazione non è necessario. </li></ol></li></ol>

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BioSyst. 8 (2036), (2012).</li><li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils:+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding.">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li><li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo funzioni di protocollo per dimostrare un rappresentante dirette tecnica imballaggio in cui viene prodotto e confezionato in OMV da E. coli un enzima di interesse. Come per molte tecniche complesse ci sono più aree in cui il protocollo può essere modificato per ospitare per l&#39;utilizzo in diverse applicazioni uniche, alcune delle quali sono descritte di seguito. Mentre il meccanismo di imballaggi OMV e l&#39;enzima incapsulamento può essere adattata alle esigenze specifiche ci sono diversi passaggi ...

Qui presentata è un metodo per la progettazione, produzione e purificazione di vescicole enzimi batterici caricato membrana esterna (OMV). OMV sono piccole, soprattutto unilamellare, proteoliposomi che variano nel formato 30-200 nm 1,2. Tutti i batteri Gram-negativi e Gram-positivi che sono stati studiati fino ad oggi hanno dimostrato rilascio di una OMV o vescicole extracellulari (EV) dalla loro superficie 3,4. Il meccanismo preciso con cui sono prodotti OMV devono ancora essere completamente chiarito causa delle diverse popolazioni batteriche che loro così come le funzioni diverse che servono secernono. OMV hanno dimostrato di trasportare una vasta gamma di carico da piccole molecole, peptidi e proteine di materiale genetico serve una varietà di segnalazione complesso, gene traslocazione, e virulenza FUNZIONI 5,6. I meccanismi esatti di OMV biogenesi non sono ben caratterizzati, e sembrano differire tra le specie batteriche. nonostante this Infatti, abbiamo sviluppato un metodo per migliorare l&#39;efficienza di confezionamento di una proteina ricombinante in OMV creando un legame sintetico tra una proteina di interesse e altamente abbondante endogena proteina alla membrana esterna batterica e successiva OMV. In assenza di un legame sintetico, o di affinità artificialmente incorporato, tra la proteina ricombinante espressa e la OMV l&#39;efficienza confezione osservato è molto basso 7. Questo risultato è prevedibile come l&#39;incorporazione delle proteine ​​all&#39;interno della OMV sia avviene attraverso l&#39;incapsulamento casualità nel momento preciso della formazione OMV in superficie batterica o attraverso il packaging diretto da meccanismi che non sono ben compresi. Qualche successo è stato osservato nel confezionamento proteine ​​semplicemente attraverso sovraespressione nello spazio periplasmatico che si basa su incapsulamento casualità ma efficace imballaggio è altamente proteina dipendente con alcune proteine ​​Confezioni ad alta efficienza rispetto ad altri tha non comprimere affatto 8-10. Utilizzando le tecniche comuni di biologia sintetica abbiamo cercato di progettare Escherichia coli (E. coli) per produrre contemporaneamente, pacchetto e secernere un enzima attivo di interesse in OMV che aggira le limitazioni attuali conoscenze su come si formano e come OMV carico viene selezionato dai batteri per confezionamento. Ai fini della presente domanda, un sistema di proteine ​​bioconjugation scaglionato è stato selezionato come il legame sintetici di scelta per facilitare confezionamento direzionale nel OMV. Come suggerisce il nome un sistema proteico bioconjugation scissione comprende due domini subunità complementari che interagiscono tra loro. I domini di proteine spaccatura selezionati ai fini del presente protocollo sono indicati come la SpyCatcher (SC) e SpyTag dominio (ST) e sono derivati dal Streptococcus pyogenes fibronectina-binding protein (FbaB) 11. Questo sistema proteina spaccatura è insolito in quanto wgallina le due subunità sono all&#39;interno di prossimità un legame isopeptide forma spontaneamente tra la prossimale aspartico residui acidi acidi e lisina aminoacidi che creano un legame covalente. Formazione del legame Isopeptide non richiede l&#39;aggiunta di proteine chaperone, enzimi catalitici o cofattori e può verificarsi facilmente a temperatura ambiente (RT) e su un ampio intervallo di condizioni fisiologicamente rilevanti 12. Come prova di concetto, phosphotriesterase (PTE) (CE 3.1.8.1) dal Brevundimonas minuto è stato scelto per essere confezionato in E. coli derivati OMV 13. PTE contiene un sito attivo binuclear Zn / Zn e ha la capacità di abbattere organofosfati attraverso una reazione di idrolisi conversione aryldialkylphosphates in dialkylphosphates e alcoli arilici 14. L&#39;esposizione a organofosfati compromette il corretto funzionamento dei neurotrasmettitori attraverso inibendo l&#39;idrolisi di acetilcolina da acetilcolinesterasi alle giunzioni neuromuscolari makincomposti derivati g organofosfati estremamente pericolose 15. Prolungata o significativa esposizione a organofosfati si traduce spesso in preda a convulsioni incontrollabili e di solito provoca la morte tramite asfissia. Mentre PTE presenta la più alta attività catalitica verso paraoxon, un insetticida molto potente, è anche in grado di idrolizzare una vasta gamma di altri pesticidi e V / tipo G agenti nervini chimici 16. Per facilitare confezionamento OMV, un plasmide batterico creata che codifica un costrutto genico che contiene un promotore inducibile, una sequenza di localizzazione periplasmatica, ea breve polylinker monte della sequenza SC gene. Inserimento del gene PTE tra il leader e la sequenza SC permette la creazione di un interruttore genetico che colpisce la proteina di fusione PTE-SC allo spazio periplasmatico per imballaggi OMV. Mentre gli sforzi descritti qui concentrano sulla PTE, il gene dell&#39;enzima è intercambiabile e può essere facilmente sostituita con un&#39;altra sequenza genica a FACconfezionamento ilitate di un enzima alternativo o proteine. Come la seconda parte del collegamento sintetico, viene scelto per presentare la sequenza peptidica ST un&#39;abbondante proteina della membrana esterna (OmpA). Mentre la scelta di proteine ​​di ancoraggio può variare, è essenziale che la proteina ha un dominio permissiva che presenta all&#39;interno dello spazio periplasmatico, tollera il costrutto di fusione senza indurre citotossicità, è noto per essere presente in OMV, e non aggrega quando è ricombinante prodotta. OmpA è un kDa proteina transmembrana 37,2 porin che è noto per essere altamente espresso nella membrana esterna batterica e conseguente OMV 17. Si è implicato nel trasporto di piccole molecole, &lt;2 nm in termini di dimensioni, attraverso la membrana batterica 18. Native OmpA ha due domini strutturalmente unici, un barile motivo transmembrana beta e una porzione C-terminale periplasmically solubile noto per interagire con il peptidoglicano 19. Nel mutante OmpA-ST fusione designed qui la porzione C-terminale della OmpA stato eliminato e la ST è stata fusa alla periplasmically fronte N- o C-Termini. Eliminare la parte periplasmic del OmpA diminuisce il numero di interazioni tra la membrana esterna e il peptidoglicano con conseguente destabilizzazione della membrana che porta a iper-vescicole 7. Genomic OmpA stata mantenuta in aggiunta al costrutto OmpA-ST ricombinante espressa per mitigare destabilizzazione membrana lordo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">IPTG</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">L-arabinose</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Can be prepared ahead of time and stored at 4C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Chloramphenicol&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">TB/LB Culture Media</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Other growth medias will likely work similarly.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">One of many potential suitable surfactants.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Baffled culture flasks</td>
			<td style="width:93px;">Any</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">The baffles promote higher levels of aeration.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">CHES</td>
			<td style="width:93px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:96px;">BP318-100</td>
			<td style="width:273px;">Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &#62; 8).</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Paraoxon</td>
			<td style="width:93px;">Chem Service</td>
			<td style="width:96px;">N-12816</td>
			<td style="width:273px;">Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Syringe Filter 0.45 &#181;m</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">60183-221&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (30 mm)</td>
			<td style="width:273px;">Filter diameter will depend on volume of sample.&#160; Low protein binding membrane is critical.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Shaker incubator</td>
			<td style="width:93px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:96px;">Excella E24</td>
			<td style="width:273px;">Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Sorvall Culture Centrifuge</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">RC 5B PLUS</td>
			<td style="width:273px;">Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Sorvall Ultracentrifuge&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">WX Ultra 90</td>
			<td style="width:273px;">Capable of centrifugal forces &#8805;150,000 x g.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:96px;">AH-629</td>
			<td style="width:273px;">Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:155px;">Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; (25 x 89 mm)</td>
			<td style="width:93px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:96px;">344058</td>
			<td style="width:273px;">Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">Spectrophotometer&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Tecan</td>
			<td style="width:96px;">Infinite M1000</td>
			<td style="width:273px;">Necessary for enzyme kinetic assays.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">DLS / particle tracking</td>
			<td style="width:93px;">NanoSight&#160;</td>
			<td style="width:96px;">LM10</td>
			<td style="width:273px;">Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">BL21(DE3)</td>
			<td style="width:93px;">NEB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Suitable bacterial expression strain.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">pET22</td>
			<td style="width:93px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:96px;">69744-3</td>
			<td style="width:273px;">Other plasmids can be used in place of these.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:155px;">pACYC184</td>
			<td style="width:93px;">NEB</td>
			<td style="width:96px;"></td>
			<td style="width:273px;">Other plasmids can be used in place of these.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:155px;">Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:93px;">Qiagen</td>
			<td style="width:96px;">28704</td>
			<td style="width:273px;">Example kit.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

Un crescente interesse per l&#39;applicazione di tecniche di biologia sintetica per programmare vescicole membrana esterna (OMV) stanno portando ad alcune applicazioni molto interessanti e uniche per OMV in cui le nanoparticelle tradizionali si stanno rivelando troppo difficili da sintetizzare. Ad oggi, tutti i batteri Gram-negativi hanno dimostrato di produrre OMV confezionamento dimostrazione di una varietà di carico che comprende piccole molecole, peptidi, proteine ​​e materiale genetico. Sulla base della loro diversa carico, OMV sono implicati in molti processi biologici che vanno dalla comunicazione cellulare per il trasferimento genico e consegna dei fattori di virulenza seconda di quale batteri producono l&#39;OMV. Solo di recente sono batterica OMV diventati accessibili per l&#39;uso in una vasta gamma di applicazioni attraverso lo sviluppo di tecniche per il controllo e il confezionamento diretta di proteine ​​ricombinanti in OMV. Questo protocollo descrive un metodo per la produzione, purificazione, e l&#39;uso di enzima confezionato OMV prevede migliorata overala produzione ll di enzima ricombinante, aumento vescicole, e una maggiore stabilità dell&#39;enzima. utilizzazione di successo di questo protocollo comporta la creazione di un ceppo batterico che produce contemporaneamente una proteina ricombinante e la dirige per OMV incapsulamento attraverso la creazione di un collegamento sintetica tra la proteina ricombinante e una proteina della membrana esterna di ancoraggio. Questo protocollo dettagli anche i metodi per isolare OMV da colture batteriche così come le tecniche di manipolazione e cose da considerare quando si adattare questo protocollo per l&#39;uso per altre applicazioni uniche quali: la consegna della droga farmaceutica, diagnostica medica e risanamento ambientale.

L&#39;espressione simultanea di due proteine ​​ricombinanti, come è richiesto per la strategia di imballaggio OMV descritto in questo protocollo, può essere realizzato attraverso diverse vie. Qui, un sistema a due vettoriale è stato utilizzato con origini compatibili di replicazione e cassette geniche inducibili separati. Per l&#39;espressione del PTE-SC costruire un backbone plasmide commerciale (pACY184) è stato progettato per includere una arabinosio inducibile cassetta genica...

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Packaging proteine ​​diretto all&#39;interno della membrana esterna vescicole da<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Progettazione, produzione e purificazione

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K Views.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Ricerca

Biochimica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. The relative levels of different tRNAs, and the ratio of aminoacylated tRNA to total tRNA, known as the charging level, are important factors in determining the accuracy and speed of translation. Therefore, the abundance and charging levels of tRNAs are important variables to measure when studying protein synthesis, for example under various stress conditions. Here, we describe a method for harvesting tRNA and directly measuring both the relative abundance and the absolute charging level of specific tRNA species in Escherichia coli. The tRNA is harvested in such a way that the labile bond between the tRNA and its amino acid is preserved. The RNA is then subjected to gel electrophoresis and Northern blotting, which results in separation of the charged and uncharged tRNAs. The levels of specific tRNAs in different samples can be compared due to the addition of spike-in cells for normalization. Prior to RNA purification, we add 5% of E. coli cells that overproduce the rare tRNAselC to each sample. The amount of the tRNA species of interest in a sample is then normalized to the amount of tRNAselC in the same sample. Addition of spike-in cells prior to RNA purification has the advantage over addition of purified spike-in RNAs that it also accounts for any differences in cell lysis efficiency between samples.

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

Here we present a method for directly measuring transfer RNA charging levels from purified Escherichia coli RNA as well as a way to compare relative levels of transfer RNA, or any other short RNA, across different samples based on the addition of spike-in cells expressing a reference gene.

Quantificazione di abbondanza e ricarica i livelli di RNA di trasferimento in Escherichia coli

Transfer RNA (tRNA) is an essential part of the translational machinery in any organism. tRNAs bind and transfer amino acids to the translating ribosome. ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

Produzione su larga scala di RNA ricombinante su un'impalcatura circolare utilizzando un sistema derivato Viroid in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caratterizzazione dei trasportatori a membrana di Eterologous Expression in E. coli e produzione di membrane

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. It is formed by two proteinaceous sublayers that are tightly associated and formed by distinct female reproductive organs. Both structures are assumed to have their own functional specificities, which remain to be defined. To characterize the function of proteins composing each sublayer, the first challenge is to establish the conditions that would allow for the mechanical separation of these two intricate layers, while limiting any structural damage. The second step is to optimize the experimental conditions to facilitate protein solubilization from these two sublayers, for subsequent biochemical analyses. The efficiency of this approach is assessed by analyzing the protein profile of each sublayer by Sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE), which is expected to be distinct between the two structures. This two-step procedure remains simple; it requires classical biochemical equipment and reagents; and is compatible with further in-depth proteomics. It may also be transposed to other avian eggs for comparative biology, knowing that the structure and the composition of the perivitelline layer has been shown to have species-specific features. In addition, the non-denaturing conditions developed for sublayers separation (step 1) allow their structural analyses by scanning and transmission electron microscopy. It may also constitute the initial step for subsequent protein purification to analyze their respective biological activities and 3D structure, or to perform further immunohistochemical or functional analyses. Such studies would help to decipher the physiological function of these two sublayers, whose structural and functional integrities are determinant criteria of the reproductive success.

This article reports a simple method to isolate the outer and inner perivitelline sublayers of chicken eggs while minimizing structural alteration and to optimize protein solubilization of each sublayer for proteomic analyses.

Separazione meccanica e solubilizzazione proteica dei sottostrati perivitellini esterni ed interni dalle uova di gallina

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

Packaging proteine ​​diretto all'interno della membrana esterna vescicole da

Packaging proteine diretto all'interno della membrana esterna vescicole da