Name: directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
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This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

1. Preparação dos plasmídeos <ol><li> Prepare um plasmídeo (por exemplo, pET22) contendo a proteína de ancoragem (OmpA) fundido com um domínio de ligação bi-ortogonal (referido no presente protocolo como âncora-ST), tag epitopo (como 6xHis, myc ou bandeira de tags para a purificação e identificação), tag periplasmático localização, a resistência aos antibióticos, e de origem adequada de replicação com base na estirpe bacteriana seleccionada 7. <ol><li> Extrair DNA de plasmídeo a partir de culturas durante a noite utilizando um kit de isolamento de ADN comercialmente disponível seguindo o protocolo do fabricante. </li></ol></li><li> Preparar um plasmídeo (por exemplo, pACYC184) contendo a enzima / proteína (TEP) a ser embalado dentro do OMV fundido com o domínio de ligação bioorthogonal complementar à da proteína de ancoragem (referido neste protocolo como enzima-SC), etiqueta de epitopo, tag periplasmático localização, a resistência aos antibióticos, que é diferente do que o plasmídeo de proteína de âncora, e orig adequadoem de replicação com base na estirpe bacteriana seleccionada 7. <ol><li> Extrair DNA de plasmídeo a partir de culturas durante a noite utilizando um kit de isolamento de ADN comercialmente disponível seguindo o protocolo do fabricante 7. </li></ol></li></ol> 2. Geração de uma cultura de E. coli OMV Packaging <ol><li> O isolamento de plasmídeo <ol><li> Purifica-se plasmídeos que codificam a enzima-SC construir e âncora-ST constrói a partir de linhas celulares de manutenção separadas utilizando um kit de isolamento de plasmídeo comercial de acordo com o protocolo do fabricante 7. Determinar a concentração e pureza do DNA por medição da absorvência a 260 nm e 280 nm. </li></ol></li><li> A co-transformação <ol><li> Seleccionar uma estirpe de E. coli, que está comercialmente disponível para facilitar a expressão de proteínas. NOTA: BL21 células (DE3) foram utilizados aqui. O lisogene de T7 é necessário para a expressão da construção de ancoragem-ST, que se baseia no promotor T7 e T7 ARN polimerase para protexpressão ein. A utilização de outras estirpes de bactérias exige quer a presença do gene lisogénio de T7 ou a utilização de um plasmídeo diferente pET22 7. </li><li> Dilui-se DNA de plasmídeo purificado a concentrações equivalentes molares, em seguida transformá-las em células bacterianas competentes, quer através de transformação de choque térmico ou electroporação, seguindo o protocolo do fabricante para as células competentes escolhidas. </li><li> células da placa transformada Onto Luria-Bertani (LB) placas de ágar com ampicilina (pET22) e cloranfenicol (pACYC184) contendo antibiótico; ambos presentes em concentrações finais de 25 ug / ml. </li><li> Colocar a placa de cultura a 37 ° C durante a noite para isolar apenas os clones que contêm ambos os plasmídeos. NOTA: As colónias que sobrevivem a selecção de antibiótico irá ser utilizado para todas as preparações futuras de OMV. Os antibióticos (ampicilina e cloranfenicol) será adicionada a todas as culturas líquidas para manter a pressão selectiva e assegurar a presença de ambos os plasmídeos. </li></ol></li></ol> 3. OMV Produção <ol><li> Expansão Colony <ol><li> Inocular 5 ml de meio de cultura (tipicamente Terrific Broth (TB) ou LB) contendo antibióticos nas concentrações acima mencionadas (passo 2.2.3) com uma única colónia a partir das placas de selecção descrito no 2.2.4. </li><li> Efectuar uma diluição 1: 100 de dobragem da cultura fermento durante a noite em frascos de cultura com deflectores. NOTA: Use um volume de mídia entre 250-500 ml. </li><li> Manter a cultura a 37 ° C com agitação a 250 rpm para garantir que o arejamento suficiente da cultura é atingido. </li></ol></li><li> Indução de cada plasmídeo <ol><li> Permitir que a cultura bacteriana para crescer a uma DO 600 de 0,6-0,8, cerca de 3 h de crescimento após a inoculação do balão de crescimento primário. </li><li> Para melhorar o rendimento final de TEP-SC vesículas carregadas, centrifugar toda a cultura a 7000 xg durante 15 min. Ressuspender o sedimento celular em pré-aquecido, o meio de cultura fresco. NOTA: Este optional passo ajuda a remover qualquer OMV vazio que estão presentes no meio de cultura antes da indução PTE-SC. </li><li> Adicione uma solução de 20% de L-arabinose em água e filtro estéril usando um filtro de 0,22 um. Loja solução de L-arabinose a 4 ° C durante 2-4 semanas. </li><li> Adicionar a solução de L-arabinose para o frasco de cultura para uma concentração final de 0,2% para iniciar a produção de TEP-SC. NOTA: Isso ajuda a pré-carregar o espaço periplásmico com PTE-SC antes da promoção de um maior vesiculation através da indução do mutante OmpA-ST. </li><li> Adicione uma solução 1 M de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) em água e filtro estéril usando um filtro de 0,22 um. NOTA: IPTG deve ser utilizado imediatamente, uma vez hidratado. Alíquotas de IPTG pode ser armazenado congelado durante 3-6 meses e pode ser descongelado imediatamente antes de usar. </li><li> Adicionar IPTG após um período de incubação adicional de três horas a uma concentração final de 0,5 mM, para iniciar a produção do OmpA-ST. </li><li> Permitir que a cultura-se crescer durante um adicional de 8-14 h a 37 ° C enquanto se agita. </li></ol></li></ol> 4. OMV Purificação <ol><li> Remoção de bactérias intactas <ol><li> Centrifuga-se o meio de cultura bacteriana durante 15 minutos a 7000 xg, a 4 ° C para sedimentar as bactérias intactas. </li><li> Decante, e salvar, os meios de comunicação fora do topo do poste centrifugação pellet celular tomando cuidado para não perturbar o pellet celular. </li><li> Repita os passos 4.1.1 e 4.1.2 para um ciclo de centrifugação adicional para garantir todas as bactérias intactas são removidos do meio de cultura tendo a certeza de decantar e salvar a mídia. </li></ol></li><li> A remoção de agregados de proteína <ol><li> Purificar o meio de cultura bacteriana utilizando um filtro de membrana de 0,45 um para remover as bactérias residuais e material celular indesejada grande. NOTA: Use um material de membrana biologicamente compatível para recuperações mais elevadas e adsorção de proteínas inferior, tais como acetato de celulose (CA) ou fluoreto de polivinilideno (PVDF). volumes de filtro de seringa inferior a 100 ml e volumes de filtro de vácuo superiores a 100 ml. <ol><li> Para filtro de seringa, desenhar meio de cultura em estéril seringa 10-50 ml. Encaixe de 0,45 um filtro de extremidade de Luer da seringa. Deprimir êmbolo e recolher flow-through em um novo navio. </li><li> Para aspirar filtro, transferir o meio de cultura a um aparelho de filtração estéril. Anexar unidade a bomba de vácuo ou afundar aspirador para gerar sucção. Transferência médio filtrada para nova embarcação. </li></ol></li></ol></li><li> Isolamento de OMV através Ultracentrifugação <ol><li> Adicione o meio de cultura filtrado em tubos de centrifugação tendo o cuidado de equilibrar tubos opostos na centrífuga. </li><li> Pelete a ~ 150.000 x g durante 3 horas a 4 ° C em uma ultracentrífuga com o rotor correspondente combinando tanto o instrumento e os tubos a ser utilizado. </li><li> Decanta-se o meio de cultura esgotado OMV a partir do sedimento OMV, tomando cuidado para não perturbar o sedimento OMV, imediatamente após a conclusão óf centrifugação como permitir a pastilha OMV permanecer nos meios de comunicação irá amolecer o sedimento reduzindo recuperação OMV. NOTA: Este sedimento será ligeiramente acastanhada e, dependendo da quantidade de partida de cultura bacteriana podem ou não podem ser visíveis a olho nu. Aspirando o suporte directamente a partir do topo do tubo de centrifugação, também é uma opção tendo em mente que os materiais removidos mais do OMV sedimentar o mais pura a amostra final será OMV. </li><li> Salve o sobrenadante centrifugado para testes mais tarde dinâmica de espalhamento de luz (DLS) para verificar se as partículas OMV foram totalmente descarregada a partir da mídia. </li><li> Adicionar 0,5-1 ml de filtrado tampão fosfato salino (PBS), pH 7,4 ou 100 mM de tampão estéril N -ciclo-hexil-2-aminoetanossulfónico ácido (CHES) a pH 8,0 e o sedimento de OMV permitindo-se incubar durante 30 min à temperatura ambiente. Certifique-se de que o sedimento não seca. NOTA: Os extremos em solução de força iónica, pH e temperatura podem resultar em reduzida solubilidade OMV e promover aggregação. </li><li> Cuidadosamente pipetar a solução purificada OMV a partir do tubo de centrífuga, misturando suavemente para assegurar que toda a pelete foi solubilizada. </li></ol></li></ol> 5. OMV Caracterização <ol><li> Usar qualquer software DLS ou rastreamento de nanopartículas comercialmente disponível seguindo os protocolos do fabricante fornecida únicas para cada instrumento para determinar a distribuição de tamanho OMV e concentração de partículas. NOTA: Aqui, distribuição de tamanho de OMV e concentração foi determinada utilizando NanoSight LM10 nanopartículas de rastreamento e software Análise NTA 2.3. <ol><li> Abra o software. </li><li> Ligue microscópio e limpar todas as superfícies da unidade de microscópio e rastreamento de nanopartículas. </li><li> Adicionar ~ 0,5 ml de amostra OMV directamente para a janela de visualização do dispositivo de localização de partículas através do encaixe Luer, com uma seringa esterilizada de 1 ml sendo certo para cobrir toda a janela de visualização, sem qualquer injecção de bolhas de ar no sistema. </li><li> lugar tele nanopartículas unidade de rastreamento no palco microscópio e ligar o laser. </li><li> Clique &quot;captura&quot; do software. </li><li> Ajuste o foco do microscópio e palco para visualizar as partículas na tela de visualização atual na janela do software. </li><li> Ajuste o &quot;obturador da câmera&quot; e &quot;Ganho Camera&quot; até que as partículas brilhantes são claramente visualizados em um fundo escuro. </li><li> Ajustar a duração de captura a 60 seg. </li><li> Clique em &quot;Record&quot;. </li><li> Quando solicitado, a entrada da temperatura / dispositivo de amostra, rotular a amostra, e salvar os dados de vídeo na conclusão da cada correr em uma pasta designada usuário. </li><li> Mantenha todos os parâmetros de análise (limiar de detecção, Blur, Pista Min Comprimento, Min esperado Particle Size) no modo de detecção automática e clique em &quot;sequência do processo.&quot; NOTA: Consulte o manual para saber como cada parâmetro pode ser ajustado de forma independente para os resultados da análise sintonia fina. </li><li> Ficha de distribuição de tamanho de partícula e as partículas / mL concentração tal como determinado pelo software. NOTA: Uma gama de tamanho hidrodinâmico OMV típica situa-se entre 30-200 nm com uma concentração de partículas / ml de ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Determinando OMV conteúdo Protein <ol><li> Use padrão de SDS-PAGE e protocolos de Western blot para avaliar a pureza OMV, a produção da enzima, e a eficiência de reticulação SC-ST 7. NOTA: A reticulação eficiência não é 100% 7. </li></ol></li></ol> 6. Verificação de Enzyme Packaging <ol><li> PTE Activity Assay <ol><li> Executar todos os ensaios enzimáticos em um tampão adequado, tal como tampão CHES 100 mM (pH 8) a 25 ° C em qualquer uma cuvete ou multiplexados numa placa de 96/384. </li><li> Adicionam-se 5 ul de uma diluição de 1: 1000 em tampão de paraoxon CHES 90 ul de CHES e 5 ul de OMV purificado (~ 36 vezes concentrada em comparação com a concentração de OMV presente no meio de cultura). Cuidado: Paraoxônio é um pesticida tóxicoe devem ser manuseados por fabricante e diretrizes institucionais. </li><li> Aqui as leituras de absorvância a intervalos regulares (cada 20 seg durante ~ 2 horas tempo total de reacção), a 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) e a 348 nm (ponto ε isosbestic = 5,4 mM-1cm-1) para se monitorizar a progressão da reacção do produto de decomposição paraoxon cromogénico, p-nitrofenol. NOTA: A valores de pH acima de 8 a forma desprotonada dominante do p-nitrofenol está presente permitindo um acompanhamento preciso a 405 nm. Em todas as outras soluções de complexo ou a diminuição do pH, é necessário utilizar o ponto isosbestic de 348 nm como múltiplas formas de o p-nitrofenol estará presente. </li><li> Calcular as velocidades iniciais de reacção através da determinação do declive da porção linear das curvas de progresso do passo 6.1.3 para comparar a quantidade relativa de TEP, em cada amostra, a eficiência de embalagem, e a produção total de TEP. </li><li> Execute enzimática padrãoprotocolos de ensaio para determinar K M, V max e gato k para a OMV encapsulado PTE. NOTA: A análise de Lineweaver-Burk pode ser utilizado para a determinação destes parâmetros cinéticos em que a intercepção de y = 1 / V max e de K = declive M / 20 V máx. </li></ol></li><li> Transmembrana Substrato / difusão do produto. <ol><li> Realizar a mesma análise cinética de ensaio tal como descrito no passo 6.1 utilizando concentrações crescentes de Triton X-100 em tampão CHES de 0-3% em volume. NOTA: A adição de Triton X-100 para as funções de OMV solubilizados para interromper a bicamada lipídica para permitir que o conteúdo do OMV ser livremente acessível à solução de reacção. </li><li> Calcular e comparar as velocidades iniciais em cada nível de Triton X-100 para verificar a passagem transmembranar do substrato / produto indicado por alteração mínima da actividade da enzima (velocidades iniciais) em comparação com a actividade da enzima in a ausência de Triton X-100. Se um aumento substancial na actividade enzimática é observado na presença de Triton X-100, é provável que o substrato não difundem livremente para dentro do OMV. </li><li> actividade da enzima livre de ensaio (como descrito acima na secção 6.1) na presença de Triton X-100 para verificar que a actividade da enzima não é inibida pelo próprio agente tensioactivo. NOTA: Se a actividade é grandemente influenciado por Triton X-100, aditivos alternativos, tais como saponinas ou diferentes polissorbato / tween surfactantes podem ser mais adequados para romper a membrana de OMV. </li></ol></li></ol> 7. OMV Armazenamento <ol><li> Congelando <ol><li> alíquotas lugar ~ 100 l de OMV purificado diretamente em nitrogênio líquido para tirar congelar as alíquotas sendo cuidado para não submergir totalmente os frascos ou entre em contato com qualquer azoto líquido com a própria amostra. NOTA: Purificada OMV podem ser congeladas rapidamente directamente no tampão que foi escolhida para solubilizar o sedimento durante a purificação de OMVprocesso de ion sem crioprotetores adicionais necessárias 7. </li><li> Conserve as alíquotas congeladas rapidamente a -80 ° C. </li><li> Descongelar alíquotas congeladas a partir do passo 7.1.1, colocando-os à temperatura ambiente sendo cuidado para não aquecer as amostras. </li><li> Antes da preparação de todas as amostras para o armazenamento desta maneira realizar o ensaio enzimático descrito no passo 6.1 comparando as velocidades iniciais antes e após congelação para verificar que não há perda significativa de actividade da enzima pós congelação-descongelação. NOTA: loja purificado OMV a 4 ° C, se uma redução na actividade enzimática é observada devido à congelação. </li></ol></li><li> Liofilização <ol><li> Liofilizar as aliquotas congeladas rapidamente OMV purificadas utilizando equipamento de liofilização comercialmente disponível 21. </li><li> Loja liofilizada alíquotas à temperatura ambiente durante semanas ou a -80 ° C durante muitos meses. </li><li> Adicionar o mesmo volume de água purificada para a OMV como liofilizado antes da liofilização e deixar em repouso à temperatura ambiente durante 30 minutos para re-hidratar tele provar. Misture delicadamente quando seja necessário cuidado para não vórtice ou sonicate da OMV. </li><li> Adicionar liofilizado em pó OMV directamente para o ponto-de-cuidado para aplicações onde antes de diluição / solubilização não é necessário. </li></ol></li></ol>

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BioSyst. 8 (2036), (2012).</li><li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils:+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding.">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li><li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Este protocolo funções para demonstrar um representante dirigido técnica de embalagem em que uma enzima de interesse é produzido e embalado em OMV por E. coli. Tal como com muitas técnicas complexas, existem várias áreas em que o protocolo pode ser modificado para acomodar para uso em diferentes aplicações únicas, algumas das quais são descritas abaixo. Enquanto o mecanismo de OMV embalagem e encapsulamento enzima pode ser adaptado às necessidades específicas existem várias etapas dentro deste pro...

Apresentado aqui é um método para a concepção, produção e purificação de vesículas carregadas por enzimas bacterianas da membrana externa (OMV). OMV são pequenos, principalmente unilamelar, proteolipossomas que variam em tamanho de 30-200 nm, de 1,2. Todas as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas que foram estudados até à data demonstraram libertação de qualquer das OMV ou vesículas extracelular (EV) de sua superfície de 3,4. O mecanismo preciso pelo qual OMV são produzidos ainda não foram completamente elucidados, devido às diversas populações bacterianas que eles, bem como as diferentes funções que eles servem secretam. OMV foram mostrados para o transporte de uma ampla gama de cargas de pequenas moléculas, péptidos, proteínas e material genético para servir uma variedade de sinalização complexas, a translocação do gene, e virulência funciona 5,6. Os mecanismos exactos de OMV biogénese não estão bem caracterizados, e parecem diferir entre as espécies bacterianas. apesar this verdade, temos desenvolvido um método para melhorar a eficiência de embalagem de uma proteína recombinante em OMV através da criação de uma ligação sintética entre uma proteína de interesse e uma proteína endógena altamente abundantes na membrana externa bacteriana e subsequente OMV. Na ausência de uma ligação sintética, ou incorporados artificialmente afinidade, entre a proteína expressa de forma recombinante e a OMV a eficiência de embalagem observada é muito baixo 7. Este resultado é de se esperar que a incorporação das proteínas dentro da OMV quer ocorre por meio de encapsulamento acaso no preciso momento da formação de OMV na superfície bacteriana ou através de uma embalagem dirigido por mecanismos que não são bem compreendidos. Algum sucesso foi observado em proteínas de embalagem simplesmente através da sobre-expressão dentro do espaço periplásmico que depende de encapsulamento acaso mas eficaz embalagem é altamente dependente da proteína com algumas proteínas de embalagens, a eficiência elevada comparado com outras tha não embalar em tudo 8-10. Através da utilização de técnicas de biologia sintética comuns procuramos projetar Escherichia coli (E. coli) para produzir simultaneamente, pacote e secretar uma enzima ativa de interesse em OMV que contorna as limitações do conhecimento atual sobre como OMV são formados e como a carga é selecionada pelas bactérias para embalagem. Para os fins deste pedido de um sistema de divisão de bioconjugação proteína foi escolhida como a ligação sintética de escolha para facilitar a embalagem direccional no OMV. Tal como o nome sugere um sistema de bioconjugação proteína de separação é constituída por duas subunidades domínios complementares que interagem um com o outro. Os domínios proteicos separação seleccionadas para efeitos deste protocolo são referidos como o SpyCatcher (SC) e SpyTag domínio (ST) e são derivados da proteína de ligação pyogenes Streptococcus fibronectina (FbaB) 11. Este sistema de proteína de divisão é incomum em que wuando as duas subunidades estão dentro da proximidade de uma ligação isopéptido forma espontaneamente entre as extremidades proximal resíduos de ácido aspártico e de ácido amino de lisina, criando uma ligação covalente. Formação da ligação isopéptido não requer a adição de proteínas chaperonas, enzimas, catalisadores ou cofactores e pode facilmente ocorrer à temperatura ambiente (TA) e sobre uma ampla gama de condições f isiologicamente relevantes 12. Como prova do conceito, phosphotriesterase (TEP) (EC 3.1.8.1) a partir de Brevundimonas diminuta foi seleccionado para ser embalado em E. coli derivada OMV 13. TEP contém um Zn / Zn local activo binuclear e tem a capacidade de quebrar organofosfatos através de uma reacção de hidrólise convertendo aryldialkylphosphates em dialkylphosphates e álcoois arilo 14. A exposição a organofosforados prejudica a função neurotransmissor adequada através da inibição da hidrólise da acetilcolina pela acetilcolinesterase nas junções neuromusculares Makincompostos derivados g organofosforados extremamente perigosas 15. A exposição prolongada ou significativa para organofosforados geralmente resulta em convulsões incontroláveis e, normalmente, causa a morte por meio de asfixia. Enquanto TEP apresenta a maior actividade catalítica em relação paraoxon, um insecticida muito potente, ele também é capaz de hidrolisar uma variedade de outros pesticidas e V / G tipo nervosas agentes químicos 16. Para facilitar a embalagem OMV, um plasmídeo bacteriano foi concebido que codifica uma construção de genes que contém um promotor indutível, uma sequência de localização periplasmático, e um local de clonagem múltipla curto a montante da sequência do gene CS. Inserção do gene da TEP entre o líder e a sequência de SC permitido para a criação de um interruptor genético que tem como alvo a proteína de fusão PTE-SC para o espaço periplásmico de embalagem OMV. Enquanto os esforços descritos aqui concentrar em PTE, o gene da enzima é intermutável e pode ser facilmente substituída por outra sequência de gene com o FACilitate embalagem de uma enzima ou proteína alternativa. À medida que a segunda parte da ligação sintética, uma proteína da membrana externa abundante (OmpA) é escolhido para apresentar a sequência do péptido ST. Embora a escolha de proteína de ancoragem pode variar, é essencial que a proteína tem um domínio permissiva, que apresenta no interior do espaço periplasmático, tolera a construção de fusão sem induzir citotoxicidade, é conhecido por estar presente em OMV, e não se agregar quando é recombinantemente produzido. OmpA kDa é uma proteína transmembranar de porina 37.2 que é conhecida por ser altamente expresso na membrana externa bacteriana e subsequente OMV 17. Ele está implicado no transporte de moléculas pequenas, &lt;2 nm de tamanho, através da membrana bacteriana 18. Nativo OmpA tem dois domínios estruturalmente únicos, um motivo barril beta transmembranar e uma porção C-terminal solúvel periplasmically conhecido para interagir com o peptidoglicano 19. No designe mutante fusão OmpA-STd aqui a porção C-terminal de OmpA foi eliminado e o ST foi fundido com o N- periplasmically virado ou C-terminais. Excluindo a parte periplasmático de OmpA diminui o número de interacções entre a membrana exterior eo peptidoglycan resultando na desestabilização da membrana levando a hiper-vesiculation 7. OmpA genómico foi mantida para além da construção de OmpA-ST expressa de forma recombinante para mitigar a desestabilização da membrana bruta.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Any</td><td></td><td>Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Any</td><td></td><td>Can be prepared ahead of time and stored at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB Culture Media</td><td>Any</td><td></td><td>Other growth medias will likely work similarly.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Any</td><td></td><td>One of many potential suitable surfactants.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Baffled culture flasks</td><td>Any</td><td></td><td>The baffles promote higher levels of aeration.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &gt; 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe Filter 0.45 &amp;micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical.</td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Culture Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capable of centrifugal forces &amp;ge;150,000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Necessary for enzyme kinetic assays.</td></tr><tr><td>DLS/particle tracking</td><td>NanoSight&amp;nbsp;</td><td>LM10</td><td>Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Suitable bacterial expression strain.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Example kit.</td></tr></tbody></table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

Um crescente interesse na aplicação de técnicas de biologia sintética para programar vesículas de membrana externa (OMV) estão levando a algumas aplicações muito interessantes e originais para OMV, onde nanopartículas tradicionais estão provando muito difícil de sintetizar. Até à data, todas as bactérias Gram-negativas têm sido mostrados para produzir embalagens OMV demonstrando um de uma variedade de carga que inclui pequenas moléculas, péptidos, proteínas e material genético. Com base na sua carga diversa, OMV estão implicadas em muitos processos biológicos que vão desde a comunicação célula-célula para a transferência de genes e entrega de factores de virulência, dependendo de quais as bactérias são a produção de OMV. Só recentemente é que OMV bacteriana se tornar acessível para uso em uma ampla gama de aplicações através do desenvolvimento de técnicas para controlar e embalagem direta de proteínas recombinantes em OMV. Este protocolo descreve um método para a produção, purificação, e da utilização de enzima embalados OMV para proporcionar melhorada Overaprodução ll da enzima recombinante, o aumento da vesiculação e estabilidade da enzima melhorada. a utilização bem sucedida deste protocolo irá resultar na criação de uma estirpe bacteriana que produz simultaneamente uma proteína recombinante e dirige-o para o encapsulamento OMV através da criação de uma ligação sintética entre a proteína recombinante e uma proteína de âncora de membrana externa. Este protocolo também detalha métodos para isolar OMV a partir de culturas de bactérias, bem como técnicas de manejo adequadas e coisas a considerar quando se adaptando este protocolo a ser utilizado para outras aplicações únicas, tais como: entrega farmacêutica de medicamentos, diagnósticos médicos, e remediação ambiental.

A expressão simultânea de duas proteínas recombinantes, como é necessário para a estratégia de embalagem OMV detalhado neste protocolo, podem ser realizadas através de um número de diferentes caminhos. Aqui, um sistema de dois vectores foi utilizado com origens de replicação compatíveis e cassetes de genes indutíveis separadas. Para a expressão do PTE-SC construir uma estrutura do plasmídeo comercial (pACY184) foi manipulado para incluir uma cassete de gene indutível arabi...

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Concepção, produção e purificação

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K visualizações.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

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From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Química

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Caracterização de transportadores de membrana por expressão heterologous em E. coli e produção de vesículas de membrana

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Bioquímica

Monitoring the Assembly of a Secreted Bacterial Virulence Factor Using Site-specific Crosslinking

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on the amber suppression technology that was originally developed by Peter Schultz and colleagues1. An amber mutation is first introduced at a specific codon of the gene encoding the protein of interest. The amber mutant is then expressed in E. coli together with genes encoding an amber suppressor tRNA and an amino acyl-tRNA synthetase derived from Methanococcus jannaschii. Using this system, the photo activatable amino acid analog p-benzoylphenylalanine (Bpa) is incorporated at the amber codon. Cells are then irradiated with ultraviolet light to covalently link the Bpa residue to proteins that are located within 3-8 &#197;. Photocrosslinking is performed in combination with pulse-chase labeling and immunoprecipitation of the protein of interest in order to monitor changes in protein-protein interactions that occur over a time scale of seconds to minutes. We optimized the procedure to study the assembly of a bacterial virulence factor that consists of two independent domains, a domain that is integrated into the outer membrane and a domain that is translocated into the extracellular space, but the method can be used to study many different assembly processes and biological pathways in both prokaryotic and eukaryotic cells. In principle interacting factors and even specific residues of interacting factors that bind to a protein of interest can be identified by mass spectrometry.

This article illustrates the use of pulse-chase radio labeling in combination with site-specific photocrosslinking to monitor interactions between a protein of interest and other factors in E. coli. Unlike traditional chemical cross-linking methods, this approach generates high resolution &#8220;snapshots&#8221; of an ordered assembly pathway in a living cell.

This article describes a method to detect and analyze dynamic interactions between a protein of interest and other factors in vivo. Our method is based on ...

Imunologia e Infecção

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

Montagem dirigida de proteínas semelhantes à elastina em estruturas supramoleculares definidas e encapsulamento de carga in vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an attractive alternative to liposomes or fatty acid-based vesicles. Externally or within the vesicles, peptides can be easily expressed and simplify the synthesis of membrane precursors. Provided here is a protocol for the creation of vesicles with diameters of ~200 nm based on the amphiphilic elastin-like polypeptides (ELP) utilizing dehydration-rehydration from glass beads. Also presented are protocols for bacterial ELP expression and purification via inverse temperature cycling, as well as their covalent functionalization with fluorescent dyes. Furthermore, this report describes a protocol to enable the transcription of RNA aptamer dBroccoli inside ELP vesicles as a less complex example for a biochemical reaction. Finally, a protocol is provided, which allows in vesiculo expression of fluorescent proteins and the membrane peptide, whereas synthesis of the latter results in vesicle growth.

Presented here are protocols for the creation of peptide-based small unilamellar vesicles capable of growth. To facilitate in vesiculo production of the membrane peptide, these vesicles are equipped with a transcription-translation system and the peptide-encoding plasmid.

Na síntese de Vesiculo de precursores de membrana peptídica para crescimento de vesículas autônomas

Compartmentalization of biochemical reactions is a central aspect of synthetic cells. For this purpose, peptide-based reaction compartments serve as an ...

Bioengenharia

Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity

The cell wall of Gram-negative bacteria consists of an inner (cytoplasmic) and outer membrane (OM), separated by a thin peptidoglycan layer. Throughout growth, the outer membrane can bleb to form spherical outer membrane vesicles (OMVs). These OMVs are involved in numerous cellular functions including cargo delivery to host cells and communication with bacterial cells. Recently, the therapeutic potential of OMVs has begun to be explored, including their use as vaccines and drug delivery vehicles. Although OMVs are derived from the OM, it has long been appreciated that the lipid and protein cargo of the OMV differs, often significantly, from that of the OM. More recently, evidence that bacteria can release multiple types of OMVs has been discovered, and evidence exists that size can impact the mechanism of their uptake by host cells. However, studies in this area are limited by difficulties in efficiently separating the heterogeneously sized OMVs. Density gradient centrifugation (DGC) has traditionally been used for this purpose; however, this technique is time-consuming and difficult to scale-up. Size exclusion chromatography (SEC), on the other hand, is less cumbersome and lends itself to the necessary future scale-up for therapeutic use of OMVs. Here, we describe a SEC approach that enables reproducible separation of heterogeneously sized vesicles, using as a test case, OMVs produced by Aggregatibacter actinomycetemcomitans, which range in diameter from less than 150 nm to greater than 350 nm. We demonstrate separation of &#34;large&#34; (350 nm) OMVs and &#34;small&#34; (&#60;150 nm) OMVs, verified by dynamic light scattering (DLS). We recommend SEC-based techniques over DGC-based techniques for separation of heterogeneously sized vesicles due to its ease of use, reproducibility (including user-to-user), and possibility for scale-up.

Bacterial vesicles play important roles in pathogenesis and have promising biotechnological applications. The heterogeneity of vesicles complicates analysis and use; therefore, a simple, reproducible method to separate varying sizes of vesicles is necessary. Here, we demonstrate the use of size exclusion chromatography to separate heterogeneous vesicles produced by Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografia de exclusão de tamanho para analisar heterogeneidade vesícula de membrana externa bacteriana

The cell wall of Gram-negative bacteria consists of an inner (cytoplasmic) and outer membrane (OM), separated by a thin peptidoglycan layer. Throughout ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificação de complexos de proteínas em<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Utilizando a purificação por afinidade sequencial Peptide em combinação com espectrometria de massa tandem

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Biologia

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

As multifacetadas benefícios da proteína Co-expressão em<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of conventional light microscopes. As the resolution for a given microscope cannot be easily enhanced, we present protocols to transform the small rod-shaped gram-negative Escherichia coli (E. coli) and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) into larger, easily imaged spherical forms called spheroplasts or protoplasts. This transformation allows observers to rapidly and clearly determine whether peptides lodge themselves into the bacterial membrane (i.e., membrane localizing) or cross the membrane to enter the cell (i.e., translocating). With this approach, we also present a systematic method to characterize peptides as membrane localizing or translocating. While this method can be used for a variety of membrane-active peptides and bacterial strains, we demonstrate the utility of this protocol by observing the interaction of Buforin II P11A (BF2 P11A), an antimicrobial peptide (AMP), with E. coli spheroplasts and B. megaterium protoplasts.

Here we present a protocol to produce gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts to clearly visualize and rapidly characterize peptide-bacteria interactions. This provides a systematic method to define membrane localizing and translocating peptides.

Produção e visualização de Spheroplasts bacterianas e protoplastas para caracterizar a localização de peptídeo antimicrobiano

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Dirigido Embalagem Proteína da Membrana Externa no interior de vesículas

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