Name: directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification
Uploaded: 2016-11-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
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This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.

1. Herstellung der Plasmide <ol><li> Bereiten Sie ein Plasmid (zB pET22) mit dem Ankerprotein (OmpA) zu einer biorthogonales Verknüpfung Domäne fusioniert (bezeichnet in diesem Protokoll als Anker-ST), Epitop - Tag (wie 6xHis, myc oder FLAG - Tags für die Reinigung und Identifizierung), periplasmatischen Lokalisation tag, Antibiotikaresistenz, und geeignete Replikationsursprung auf der Basis der ausgewählten Bakterienstamm 7. <ol><li> Extrahieren Plasmid-DNA aus über Nacht Kulturen eines im Handel erhältlichen DNA-Extraktions-Kit mit folgenden Protokoll des Herstellers. </li></ol></li><li> Bereiten Sie ein Plasmid (zB pACYC184) mit dem Enzym / Protein (PTE) innerhalb der OMV an die komplementäre bioorthogonale Verknüpfung Domäne des Ankerproteins zu dem fusionierten verpackt werden ( im Sinne dieses Protokoll als Enzym-SC), Epitop - Tag, periplasmatische Lokalisierung Tag, Antibiotika-Resistenz, die als Ankerprotein-Plasmid unterschiedlich ist, und geeignete origin der Replikation auf dem ausgewählten Bakterienstamm 7 basiert. <ol><li> Extrahieren Plasmid - DNA aus über Nacht Kulturen eines im Handel erhältlichen DNA - Extraktions - Kit mit folgenden Protokoll des Herstellers 7. </li></ol></li></ol> 2. Erzeugung eines OMV Verpackung E. coli Kultur <ol><li> Plasmidisolierung <ol><li> Reinige Plasmide kodieren , das Enzym-SC konstruieren und Anker-ST - Konstrukte aus getrennten Leitungen Wartungszelle Kommerzielle Plasmidisolation Kit gemäß Herstellerprotokoll 7 verwenden. Bestimmen DNA-Konzentration und Reinheit durch Absorption bei 260 nm und 280 nm gemessen wird. </li></ol></li><li> Co-Transformation <ol><li> Wählen Sie ein E. coli - Stamm, der kommerziell erhältlich ist , die Proteinexpression zu erleichtern. HINWEIS: BL21 (DE3) -Zellen wurden hier verwendet. Die T7-Lysogen wird für die Expression des anker ST Konstrukts erforderlich, die für prot auf dem T7-Promotor und T7-RNA-Polymerase beruhtein Ausdruck. Verwendung anderer Bakterienstämme erfordert entweder die Anwesenheit des T7 - Lysogen - Gens oder die Verwendung eines Plasmids , ausgenommen pET22 7. </li><li> Verdünnen gereinigte Plasmid-DNA zu äquivalenten molaren Konzentrationen dann wandeln sie in kompetente Bakterienzellen entweder über Hitzeschock-Transformation oder Elektroporation gemäß dem Protokoll des Herstellers für die kompetenten Zellen ausgewählt. </li><li> Platte transformierten Zellen auf antibiotikahaltigen Luria-Bertani (LB) Agarplatten sowohl mit Ampicillin (pET22) und Chloramphenicol (pACYC184); beide in Endkonzentrationen von 25 ug / ml. </li><li> Legen Sie die Kulturschale bei 37 ° C über Nacht nur Klone zu isolieren beide Plasmide enthalten. HINWEIS: Kolonien, die Antibiotika-Selektion überleben wird für alle zukünftigen OMV Präparate verwendet werden. Antibiotika (Ampicillin und Chloramphenicol) wird für alle flüssigen Kulturen zugegeben werden Selektionsdruck aufrecht zu erhalten und um die Anwesenheit beider Plasmide gewährleistet. </li></ol></li></ol> 3. OMV Produktion <ol><li> Colony Expansion <ol><li> Beimpfen von 5 ml Kulturmedium (typischerweise Terrific Broth (TB) oder LB) Antibiotika bei den genannten Konzentrationen (Schritt 2.2.3) mit einer einzelnen Kolonie aus den Selektionsplatten beschrieben in 2.2.4 enthält. </li><li> Führen Sie eine 1: 100-fache Verdünnung der über Nacht Starterkultur in verwirrte Kulturflaschen. HINWEIS: ein Volumen von Medien zwischen 250-500 ml verwenden. </li><li> Halten die Kultur bei 37 ° C bei 250 Upm Schütteln, dass eine ausreichende Belüftung der Kultur gewährleistet ist, erreicht. </li></ol></li><li> Induktion von jedem Plasmid <ol><li> Erlauben die Bakterienkultur bis zu einer OD 600 von 0,6-0,8, etwa 3 h Wachstum nach Beimpfung des Hauptwachstumskolben wachsen. </li><li> Um die endgültige Ausbeute von PTE-SC beladenen Vesikel zu verbessern, Zentrifuge die gesamte Kultur bei 7000 × g für 15 min. Zellpellet in vorgewärmte, frische Kulturmedien. HINWEIS: Diese Optional Schritt hilft eine leere OMV zu entfernen, die die Induktion PTE-SC vor in den Kulturmedien vorhanden sind. </li><li> Machen Sie eine 20% ige Stammlösung von L-Arabinose in Wasser und Sterilfilter mit einem 0,22 &amp; mgr; m-Filter. Store L-Arabinose-Lösung bei 4 ° C für 2-4 Wochen. </li><li> Fügen Sie den L-Arabinose-Lösung der Kulturflasche bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,2% PTE-SC Produktion zu initiieren. HINWEIS: Dies hilft, den periplasmatischen Raum mit PTE-SC vor der Förderung der verstärkten Vesikulation durch Induktion des mutierten OmpA-ST vorab zu laden. </li><li> Machen Sie eine 1 M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) Lösung in Wasser und Sterilfilter mit einem 0,22 &amp; mgr; m-Filter. HINWEIS: IPTG muss sofort einmal mit Feuchtigkeit versorgt werden. Aliquots von IPTG kann für 3-6 Monate eingefroren werden gespeichert und können unmittelbar vor auftauen zu verwenden. </li><li> Hinzufügen IPTG nach weiteren 3 Stunden Inkubationszeit bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM Herstellung des OmpA-ST zu initiieren. </li><li> Lassen Sie die cultur für eine weitere 8-14 h bei 37 ° C wachsen unter Schütteln. </li></ol></li></ol> 4. OMV Reinigung <ol><li> Entfernung von intakten Bakterien <ol><li> Zentrifugieren der Bakterienkulturmedium für 15 min bei 7000 xg bei 4ºC intakten Bakterien zu pelletieren. </li><li> Dekantieren und zu speichern, die Medien von der Spitze der Post Zentrifugation Zellpellet wird vorsichtig, um nicht das Zellpellet stören. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.1.1 und 4.1.2 für einen zusätzlichen Zentrifugationszyklus alle intakten Bakterien aus dem Kulturmedium ist sicher entfernt werden, um sicherzustellen, dekantieren und die Medien speichern. </li></ol></li><li> Entfernung von Proteinaggregaten <ol><li> Reinigung weiter die Bakterienkulturmedien ein 0,45 um Membranfilter verwendet, um restliche unerwünschte Bakterien und große Zellmaterial zu entfernen. HINWEIS: Verwenden Sie eine biologisch kompatiblen Membranmaterial für höhere Gewinnungsraten und niedriger Proteinadsorption wie Celluloseacetat (CA) oder Polyvinylidendifluorid (PVDF). Spritzenfilter Volumen weniger als 100 ml und Vakuumfiltervolumen größer als 100 ml. <ol><li> Um Spritzenfilter, Kulturmedium in sterile 10-50 ml Spritze ziehen. Bringen 0,45 um Filter zu Luer Ende Spritze. Drücken Sie Kolben und sammeln Durchfluss in ein neues Gefäß. </li><li> Vakuumfilter Kulturmedium auf eine sterile Filtrationsvorrichtung übertragen. Bringen Einheit zur Vakuumpumpe oder Absauger versenken Sog zu erzeugen. Übertragen gefilterten Mediums zu neuen Schiff. </li></ol></li></ol></li><li> Die Isolierung von OMV über Ultrazentrifugation <ol><li> Fügen Sie die gefilterten Kulturmedien in Zentrifugenröhrchen vorsichtig gegenüberliegende Rohre in der Zentrifuge zu balancieren. </li><li> Pellet bei ~ 150.000 xg für 3 h bei 4 ° C in einer Ultrazentrifuge des entsprechenden Rotors unter Verwendung sowohl des Instruments passend und -röhren verwendet wird. </li><li> Dekantiert die OMV abgereichertem Kulturmedien von der OMV Pellet, darauf achten, daß die OMV Pellet zu stören, sofort bei der Fertigstellung of Zentrifugieren als Pellet ermöglicht die OMV in den Medien zu bleiben wird das Pellet reduzieren OMV Erholung erweichen. HINWEIS: Dieses Pellet leicht braun werden und in Abhängigkeit von der Ausgangsbetrag der Bakterienkultur kann oder mit dem Auge nicht sichtbar sein. direkt von der Spitze des Zentrifugationsröhrchens die Medien Ansaugrauchmelder ist auch eine Option, wenn man bedenkt, dass die mehr Medien aus dem OMV entfernt Pellet die reineren die endgültige OMV Probe sein wird. </li><li> Speichern Sie die zentrifugiert Überstand für eine spätere dynamische Lichtstreuung (DLS) Tests, um sicherzustellen, dass die OMV Partikel von den Medien völlig erschöpft waren. </li><li> Hinzufügen 0,5-1 ml sterilfiltriert Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,4 oder 100 mM N - Cyclohexyl-2-aminoethansulfonsäure (CHES) Puffer bei pH 8,0 auf das OMV Pellet ermöglicht es für 30 min bei RT inkubiert. Stellen Sie sicher, dass das Pellet nicht trocknet. HINWEIS: Extremes in Ionenstärke der Lösung, pH-Wert und Temperatur kann in reduzierter OMV Löslichkeit führen und fördern aggresuchung. </li><li> Pipettieren vorsichtig die gereinigte OMV Lösung aus dem Zentrifugenröhrchen, das Mischen sanft das gesamte Pellet, um sicherzustellen, wurde in Lösung gebracht worden. </li></ol></li></ol> 5. OMV Charakterisierung <ol><li> Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen DLS oder Nanopartikel-Tracking-Software nach den Protokollen des Herstellers zur Verfügung gestellt einzigartig für jedes Instrument OMV Größenverteilung und Partikelkonzentration zu bestimmen. HINWEIS: Hier OMV Größenverteilung und Konzentration bestimmt wurde Nanosight LM10 Nanoparticle-Tracking und NTA 2.3 Analyse-Software verwendet wird. <ol><li> Öffnen Sie die Software. </li><li> Schalten Sie Mikroskop und reinigen alle Oberflächen auf dem Mikroskop und Nanopartikel-Tracking-Einheit. </li><li> In ~ 0,5 ml OMV Probe direkt auf das Sichtfenster der Partikel-Tracking-Gerät durch den Luer mit einer sterilen 1-ml-Spritze Montage sicher zu sein, das gesamte Sichtfenster abdecken, ohne dass Luft in das System Blasen zu injizieren. </li><li> Platz ter Nanopartikel-Tracking-Einheit auf dem Mikroskoptisch, und schalten Sie den Laser. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Aufnahme&quot; in der Software. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop Fokus und inszenieren die Partikel auf dem Vorschaubildschirm in der Software-Fenster zu visualisieren. </li><li> Stellen Sie die &quot;Kamera-Shutter&quot; und &quot;Camera Gain&quot; bis helle Partikel eindeutig auf einem dunklen Hintergrund sichtbar gemacht werden. </li><li> Stellen Sie erfassen Dauer auf 60 Sekunden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Record&quot;. </li><li> Wenn Sie gefragt werden, geben Sie die Probe / Gerätetemperatur, die Probe beschriften und in einen Benutzer festgelegten Ordner laufen bei der Fertigstellung der jeweils die Videodaten speichern. </li><li> Halten Sie alle Analyseparameter (Nachweisgrenze, Blur, Min Streckenlänge, Min Erwartete Partikelgröße) auf automatische Erkennung Modus und klicken Sie auf &quot;Prozessablauf.&quot; HINWEIS: Das Handbuch für wie kann jeder Parameter unabhängig für die Feinabstimmung Analyseergebnisse angepasst werden. </li><li> Nehmen Sie Partikelgrößenverteilung und Partikel / ml Konzentration, wie durch die Software bestimmt wird. HINWEIS: Eine typische OMV hydrodynamischen Größenbereich zwischen 30 bis 200 nm mit einer Partikel / ml - Konzentration von ~ 10 x 10 8. </li></ol></li><li> Die Bestimmung OMV Proteingehalt <ol><li> Verwenden Sie Standard - SDS-PAGE und Western - Blot - Protokolle OMV Reinheit, Enzymproduktion, und die SC-ST Vernetzungseffizienz 7 zu bewerten. HINWEIS: Vernetzungseffizienz wird nicht zu 100% 7 sein. </li></ol></li></ol> 6. Überprüfung der Enzym Verpackung <ol><li> PTE-Aktivitätstest <ol><li> Führen alle enzymatischen Assays in einem geeigneten Puffer, wie 100 mM CHES-Puffer (pH 8) bei 25 ° C entweder in einer Küvette oder in einer Well-Platte 96/384 gemultiplext. </li><li> Werden 5 ul einer 1: 1.000-Verdünnung von Paraoxon in CHES-Puffer und 90 &amp; mgr; l CHES und 5 &amp; mgr; l gereinigter OMV (~ 36-fach konzentriert, im Vergleich zu der OMV-Konzentration im Kulturmedium). Achtung: Paraoxon ist eine giftige Pestizidund muss pro Hersteller und institutionellen Richtlinien behandelt werden. </li><li> Nehmen Sie Extinktionsablesungen in regelmäßigen Abständen (alle 20 sec für ~ 2 Stunden Gesamtreaktionszeit) bei 405 nm (ε = 18,1 mM -1 cm -1) und bei 348 nm (isosbestischer Punkt ε = 5,4 mM -1 cm -1) zu Überwachung der Reaktionsverlauf des chromogenen paraoxon Abbauprodukt, p - Nitrophenol. HINWEIS: Bei pH - Werten über 8 die dominante deprotonierten Form p - Nitrophenol vorhanden ist , bei 405 nm für eine genaue Überwachung zu ermöglichen. In allen anderen komplexen oder niedrigerer pH - Lösungen ist es notwendig , den isosbestischen Punkt von 348 nm , wie mehrere Formen der p - Nitrophenol zu nutzen , wird anwesend sein. </li><li> Berechnen Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten durch die Steigung des linearen Teils der Verlaufskurven aus Schritt 6.1.3 Bestimmung der relativen Menge des PTE in jeder Probe, Verpackungseffizienz und Gesamt PTE Produktion zu vergleichen. </li><li> Führen Standard enzymatischeTestprotokolle K M, V max und k cat für die OMV verkapselt PTE zu bestimmen. ANMERKUNG: Eine Analyse Lineweaver-Burk kann zur Bestimmung dieser kinetischen Parameter verwendet werden , wenn der y-Intercept = 1 / V max und Steigung = K M / V max 20. </li></ol></li><li> Transmembran-Substrat / Produkt Diffusion. <ol><li> Führen die gleiche Analyse kinetischer Assay, wie in Schritt 6.1 unter Verwendung von zunehmenden Konzentrationen an Triton X-100 in Puffer CHES von 0-3 Vol% beschrieben. HINWEIS: Die Zugabe von Triton X-100 zu den solubilisierten Funktionen OMV so dass die Lipid-Doppelschicht zu stören, für die der Inhalt der OMV zur Reaktionslösung frei zugänglich zu sein. </li><li> Berechnen und vergleichen Sie die Anfangsgeschwindigkeiten an jedem Triton X-100 Ebene Trans Passage des Substrats / Produkt durch minimale Änderung der Enzymaktivität (Anfangsgeschwindigkeiten) angegeben, um zu überprüfen, verglichen zur Enzymaktivität in die Abwesenheit von Triton X-100. Wenn eine wesentliche Erhöhung der Enzymaktivität in Gegenwart von Triton X-100 beobachtet wird, ist es wahrscheinlich, daß das Substrat frei diffundieren nicht in das OMV. </li><li> Assay freie Enzymaktivität in Gegenwart von Triton X-100, der Enzymaktivität (wie in Abschnitt 6.1 oben beschrieben), um zu überprüfen, wird nicht durch das Tensid selbst gehemmt. HINWEIS: Wenn Aktivität stark von Triton X-100, alternative Additive wie Saponine oder verschiedene Polysorbat / Tween-Tenside können besser geeignet sein Bersten der OMV Membran beeinflusst. </li></ol></li></ol> 7. OMV über Speicher, <ol><li> Einfrieren <ol><li> Platz ~ 100 &amp; mgr; l-Aliquots von gereinigtem OMV direkt in flüssigem Stickstoff zu schnappen die Aliquots einfrieren sicher nicht vollständig zu sein, um die Fläschchen in Wasser getaucht oder Kontakt mit einem flüssigen Stickstoff mit der Probe selbst. HINWEIS: Gereinigte OMV direkt im Puffer werden einschnappen können eingefroren, die zum Lösen der OMV Pellet während des purificat ausgewählt wurdeIonen - Prozess ohne zusätzliche Gefrierschutzmittel notwendig 7. </li><li> Lagern Sie die schockgefroren Aliquots bei -80 ° C. </li><li> Tauen gefrorenen Aliquots aus Schritt 7.1.1, indem sie bei RT sicher zu sein, nicht zu erwärmen, die Proben platzieren. </li><li> Vor allen Proben für die Speicherung auf diese Weise vorbereitet führen den Enzymtest in Schritt 6.1 Vergleich Anfangsgeschwindigkeiten beschrieben vor und nach dem Einfrieren zu verifizieren, dass es keinen signifikanten Verlust der Enzymaktivität Beitrag Gefrier-Auftau. HINWEIS: Shop gereinigt OMV bei 4 ° C, wenn eine Verringerung der Enzymaktivität aufgrund von Gefrieren beobachtet wird. </li></ol></li><li> Die Gefriertrocknung <ol><li> Lyophilisieren die schockgefroren gereinigte OMV Aliquots im Handel erhältliche Lyophilisation Ausrüstung verwendet 21. </li><li> Die lyophilisierte Aliquots bei RT für Wochen oder bei -80 ° C für viele Monate. </li><li> Das gleiche Volumen von gereinigtem Wasser auf das gefriergetrocknete OMV als vor der Lyophilisation und lassen Sie sich für 30 min bei RT stehen t rehydrierener probieren. Vorsichtig mischen, wenn notwendig, sicher zu sein, nicht zu verwirbeln oder die OMV beschallen. </li><li> In lyophilisierten OMV Pulver direkt auf Point-of-Care für Anwendungen, in denen eine vorherige Verdünnung / Solubilisierung nicht notwendig ist. </li></ol></li></ol>

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BioSyst. 8 (2036), (2012).</li><li>De Crescenzo, G., Litowski, J. R., Hodges, R. S., O'Connor-McCourt, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+the+interacation+of+two-stranded+de+novo+designed+coiled-coils:+effect+of+chain+length+on+the+kinetic+and+thermodynamic+constants+of+binding.">Real-time monitoring of the interacation of two-stranded de novo designed coiled-coils: effect of chain length on the kinetic and thermodynamic constants of binding.</a> Biochemistry. 42, 1754-1763 (2003).</li><li>Charalambous, A., Antoniades, I., Christodoulou, N., Skourides, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split-Intein+for+simultaneous+site-specific+conjugation+of+quantum+dots+to+multiple+protein+targets+in+vivo.">Split-Intein for simultaneous site-specific conjugation of quantum dots to multiple protein targets in vivo.</a> J. Nanobiotechnol. 9, 1-14 (2011).</li><li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+proteomic+profiling+of+native+outer+membrane+vesicles+derived+fromEscherichia+coli.">Global proteomic profiling of native outer membrane vesicles derived fromEscherichia coli.</a> Proteomics. 7, 3143-3153 (2007).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+enzymatic+function+through+directed+packaging+into+bacterial+outer+membrane+vesicles.">Protecting enzymatic function through directed packaging into bacterial outer membrane vesicles.</a> Sci. Rep. 6, 24866 (2016).</li><li>Alves, N. J., Turner, K. B., Medintz, I. L., Walper, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+therapeutic+delivery+capabilities+and+challenges+utilizing+enzyme/protein+packaged+bacterial+vesicles.">Emerging therapeutic delivery capabilities and challenges utilizing enzyme/protein packaged bacterial vesicles.</a> Ther. Delivery. 6, 873-887 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese Protokoll - Funktionen eine repräsentative gerichtet Verpackungstechnik zu demonstrieren , in dem ein Enzym von Interesse produziert und verpackt in die OMV durch E. coli. Wie bei vielen komplexen Techniken gibt es mehrere Bereiche, in denen das Protokoll zur Verwendung in verschiedenen einzigartigen Anwendungen aufzunehmen modifiziert werden, von denen einige im Folgenden beschrieben. Während der Mechanismus der OMV Verpackung und Enzym Verkapselung kann auf die spezifischen Bedürfnisse angepasst werd...

Dargestellt ist hier ein Verfahren für die Konstruktion, Herstellung und Reinigung von Enzym-beladenen bakterielle äußere Membranvesikel (OMV). OMV sind klein, vor allem unilamellare, Proteo , die von 30 bis 200 nm 1,2 in einem Größenbereich. Alle Gram-negative und Gram-positive Bakterien , die bisher untersucht wurden , haben gezeigt , Freisetzung von entweder OMV oder extrazelluläre Vesikel (EV) von ihrer Oberfläche 3,4. Der genaue Mechanismus, durch den OMV produziert haben noch voll auf Grund der unterschiedlichen Bakterienpopulationen aufgeklärt werden, dass sie so gut wie die unterschiedlichen Funktionen ausscheiden, die sie dienen. OMV wurden , um eine breite Palette von Fracht aus kleinen Molekülen, Peptiden und Proteinen an genetischem Material dazu dient , eine Vielzahl von komplexen Signal, Gen - Translokation zu transportieren gezeigt, und Virulenzfunktionen 5,6. Die genauen Mechanismen der OMV Biogenese sind nicht gut charakterisiert, und scheinen zwischen Bakterienarten zu unterscheiden. Trotz this der Tat haben wir ein Verfahren zur Steigerung der Verpackungseffizienz eines rekombinanten Proteins in OMV entwickelt durch eine synthetische Bindung zwischen einem Protein von Interesse und eine hoch reichlich Protein endogen der bakteriellen äußeren Membran und anschließende OMV entsteht. In Abwesenheit eines synthetischen Bindung oder künstlich eingearbeitet Affinität zwischen dem rekombinant exprimierten Protein und der OMV die beobachtete Verpackungseffizienz sehr niedrig 7. Dieses Ergebnis ist in dem Augenblick der OMV Bildung an der Bakterienoberfläche oder durch gerichtete Verpackung durch Mechanismen, die nicht gut verstanden sind innerhalb der OMV erfolgt entweder durch Zufall Verkapselung als Einbau der Proteine ​​zu erwarten. Ein gewisser Erfolg wurde in Verpackungsproteine ​​einfach durch Überexpression in den periplasmatischen Raum beobachtet worden, die auf zufällige Chance Verkapselung, aber effektive Verpackung setzt eine hohe Proteinabhängig mit einigen Proteinen mit hohem Wirkungsgrad Verpackung im Vergleich zu anderen tham Do Paket nicht mehr 8-10. Durch die Verwendung von gemeinsamen synthetischen Biologie - Techniken haben wir versucht , Escherichia coli (E. coli) zu konstruieren , ein aktives Enzym von Interesse in OMV gleichzeitig produzieren, verpacken und ausscheiden, die derzeitigen Kenntnissen Beschränkungen hinsichtlich umgeht , wie OMV gebildet werden und wie Ladung durch die Bakterien ausgewählt ist für Verpackung. Für die Zwecke dieser Anmeldung ein Split-Protein Biokonjugation System wurde als der synthetische Verknüpfung der Wahl ausgewählt Richtungs Verpackung in das OMV erleichtern. Wie der Name schon ein Split-Protein Biokonjugation System schlägt besteht aus zwei komplementären Untereinheit Domänen, die miteinander interagieren. Die geteilten Proteindomänen für die Zwecke dieses Protokoll ausgewählt werden als die SpyCatcher (SC) und SpyTag (ST) Domäne und aus dem Streptococcus pyogenes Fibronektin-bindenden Protein (FbaB) 11 abgeleitet werden. Diese Spaltung Proteinsystem ist ungewöhnlich, dass when die beiden Untereinheiten innerhalb der Nähe sind eine Isopeptidbindung bildet sich spontan zwischen dem proximalen Asparaginsäure und Lysin Aminoreste Säure eine kovalente Bindung zu schaffen. Isopeptidbindung Bildung erfordert nicht die Zugabe von Chaperon - Proteinen, katalytische Enzyme oder Cofaktoren und kann bei Raumtemperatur (RT) und über einen weiten Bereich von physiologisch relevanten Bedingungen 12 leicht auftreten. Als Beweis des Konzeptes wurde Phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) aus Brevundimonas diminuta ausgewählt in E. coli 13 OMV abgeleitet verpackt werden. PTE enthält einen zweikernigen Zn / Zn aktiven Stelle und hat die Fähigkeit , Organophosphate durch eine Hydrolysereaktion zu brechen aryldialkylphosphates in Dialkylphosphate und arylalkohole Umwandlung 14. Die Exposition gegenüber Organophosphaten beeinträchtigt richtige Neurotransmitterfunktion durch die Hydrolyse von Acetylcholin durch Acetylcholinesterase bei neuromuskulären Verbindungen Hemmung Making Organophosphat abgeleiteten Verbindungen extrem gefährlich 15. Längerer oder signifikante Exposition gegenüber Organophosphaten führt häufig zu unkontrollierbaren Zuckungen und in der Regel zum Tode führt über Erstickung. Während PTE die höchste katalytische Aktivität gegenüber paraoxon zeigt, ein sehr wirksames Insektizid, ist es auch in der Lage 16 eine breite Palette von anderen Pestiziden und V / G - Typ chemischen Nervenmittel zur Hydrolyse. Zur Erleichterung wurde OMV Verpackung, ein bakterielles Plasmid ausgelegt, dass ein Genkonstrukt kodiert, das einen induzierbaren Promotor, einen periplasmatischen Lokalisierungssequenz und eine kurze multiple Klonierungsstelle stromaufwärts von der SC-Gensequenz. Einsetzen des PTE Gens zwischen dem Leiter und SC Sequenz zur Erstellung eines genetischen Schalter erlaubt, die die PTE-SC-Fusionsprotein in den periplasmatischen Raum für OMV Verpackung ausgerichtet ist. Während die hier beschriebenen Bemühungen auf PTE konzentrieren, ist das Enzym-Gen untereinander austauschbar und leicht mit einem anderen Gen-Sequenz ersetzt werden könnte, um facilitate Verpackung eines alternativen Enzym oder Protein. Was den zweiten Teil des synthetischen Bindung, eine reichliche outer membrane protein (OmpA) wird gewählt, um die ST-Peptidsequenz zu präsentieren. Während die Wahl des Ankerproteins variieren kann, ist es wesentlich, dass das Protein eine permissive Domäne besitzt, die in den periplasmatischen Raum präsentiert, toleriert das Fusionskonstrukt ohne Zytotoxizität zu induzieren, ist bekannt, in OMV anwesend zu sein, und nicht aggregiert, wenn er rekombinant ist hergestellt. OmpA ist ein 37,2 kDa Transmembran - Porin - Protein , das 17 in der bakteriellen äußeren Membran und anschließende OMV stark exprimiert wird bekannt sein. Es liegt im Transport von kleinen Molekülen verwickelt &lt;2 nm in der Größe, in der Bakterienmembran 18. Einheimische OmpA hat zwei strukturell unterschiedliche Domains, ein Trans Beta Barrel - Motiv und ein periplasmatisch löslichen C-terminalen Teil bekannt mit dem Peptidoglycan 19 zu interagieren. In der Mutante OmpA-ST Fusion designed hier der C-terminalen Teil von OmpA wurde gelöscht und die ST wurde dem periplasmatisch zugewandt N- oder C-Terminus fusioniert. Löschen des periplasmatischen Teil OmpA verringert die Anzahl der Wechselwirkungen zwischen der äußeren Membran und der Peptidoglykan in Membrandestabilisierung resultierende was zu hyper-vesiculation 7. Genomic OmpA wurde zusätzlich zu dem rekombinant exprimierten OmpA-ST-Konstrukt zu mildern Brutto Membrandestabilisierung gehalten.

<table><tbody><tr><td>IPTG</td><td>Any</td><td></td><td>Always prepare fresh or aliquot and freeze.</td></tr><tr><td>L-arabinose</td><td>Any</td><td></td><td>Can be prepared ahead of time and stored at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Any</td><td></td><td>Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TB/LB Culture Media</td><td>Any</td><td></td><td>Other growth medias will likely work similarly.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Any</td><td></td><td>One of many potential suitable surfactants.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Baffled culture flasks</td><td>Any</td><td></td><td>The baffles promote higher levels of aeration.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHES</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP318-100</td><td>Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH &gt; 8).</td></tr><tr><td>Paraoxon</td><td>Chem Service</td><td>N-12816</td><td>Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe Filter 0.45 &amp;micro;m</td><td>Thermo Scientific</td><td>60183-221 (30 mm)</td><td>Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical.</td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Excella E24</td><td>Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Culture Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>RC 5B PLUS</td><td>Large volume (500 ml) culture centrifuge capable of 7,000 x g.</td></tr><tr><td>Sorvall Ultracentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>WX Ultra 90</td><td>Capable of centrifugal forces &amp;ge;150,000 x g.</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>AH-629</td><td>Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced.</td></tr><tr><td>Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td>Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Infinite M1000</td><td>Necessary for enzyme kinetic assays.</td></tr><tr><td>DLS/particle tracking</td><td>NanoSight&amp;nbsp;</td><td>LM10</td><td>Necessary for OMV size distribution and concentration determination.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)</td><td>NEB</td><td></td><td>Suitable bacterial expression strain.</td></tr><tr><td>pET22</td><td>EMD Millipore</td><td>69744-3</td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>pACYC184</td><td>NEB</td><td></td><td>Other plasmids can be used in place of these.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Example kit.</td></tr></tbody></table>

directed protein packaging within outer membrane vesicles from escherichia coli: design, production and purification

Eine zunehmende Interesse der synthetischen Biologie-Techniken bei der Anwendung der äußeren Membran Vesikel (OMV) zu programmieren, führen zu einigen sehr interessanten und einzigartigen Anwendungen für die OMV, wo traditionelle Nanopartikel zu schwierig erweisen zu synthetisieren. Bis heute sind alle gramnegativen Bakterien wurde gezeigt, OMV Demonstrieren Verpackung einer Vielzahl von Ladung zu erzeugen, die kleine Moleküle, Peptide, Proteine ​​und genetische Material enthält. Auf der Grundlage ihrer unterschiedlichen Ladung, sind OMV in vielen biologischen Prozessen beteiligt im Bereich von Zell-Zell-Kommunikation zu Gentransfer und Lieferung von Virulenzfaktoren abhängig davon, welche Bakterien die OMV produzieren. Erst vor kurzem haben bakterielle OMV für den Einsatz in einem breiten Spektrum von Anwendungen durch die Entwicklung von Techniken zugänglich zu steuern und direkte Verpackung von rekombinanten Proteinen in die OMV. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung, Reinigung und Verwendung von Enzym verpackt OMV zur Bereitstellung verbesserter Marktpreisefürll Herstellung von rekombinanten Enzyms erhöht Vesikulation und verbesserte Enzymstabilität. Erfolgreiche Nutzung dieses Protokolls wird in der Schaffung einer Bakterienstamm führen, die gleichzeitig ein rekombinantes Protein produziert und leitet sie für OMV Verkapselung durch eine synthetische Bindung zwischen dem rekombinanten Protein zu schaffen, und eine äußere Membran-Ankerproteins. Dieses Protokoll beschreibt auch Verfahren zur Isolierung von OMV aus Bakterienkulturen sowie für eine angemessene Handhabung Techniken und Dinge zu berücksichtigen, wenn dieses Protokoll für den Einsatz für andere einzigartige Anwendungen wie Anpassung: pharmazeutische Drug Delivery, medizinische Diagnostik und Umweltsanierung.

Gleichzeitige Expression von zwei rekombinanten Proteinen, wie für die OMV Verpackungsstrategie in diesem Protokoll detailliert erforderlich ist, kann durch eine Anzahl verschiedener Wege erreicht werden. Hier wird ein Zwei-Vektor-System wurde mit kompatiblen Replikationsursprünge und separaten induzierbaren Genkassetten verwendet. Für die Expression des PTE-SC konstruieren Kommerzielle Plasmidrückgrat (pACY184) konstruiert wurde eine Arabinose induzierbare Gen-Kassette und ein Doppe...

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Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Entwurf, Herstellung und Reinigung

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

directed-protein-packaging-within-outer-membrane-vesicles-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

13.3K Aufrufe.  Naval Research Laboratory. A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented. 

Serie: Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a target for future development of inhibitors to decrease the virulence of the pathogen. To perform biophysical and structural characterization as well as inhibitor screening, large amounts of pure and active protein will be needed. We have developed a protocol for efficient production and purification of PPEP-1 by the use of E. coli as the expression host yielding sufficient amounts and purity of protein for crystallization and structure determination. Additionally, using microseeding, highly intergrown crystals of PPEP-1 can be grown to well-ordered crystals suitable for X-ray diffraction analysis. The methods could also be used to produce other recombinant proteins and to study the structures of other proteins producing intergrown crystals.

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) is a secreted metalloprotease and promising drug-target from the human pathogen Clostridium difficile. Here we describe all methods necessary for the production and structure determination of this protein.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Forschung

Biochemie

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, &#945;-helical and &#946;-barrel. While &#945;-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, &#946;-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite &#946;-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target &#946;-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

&#946;-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of &#946;-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Chemie

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Zum Haut Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

Biotechnik

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Directed Assembly of Elastin-like Proteins into defined Supramolecular Structures and Cargo Encapsulation In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery vehicles and enzyme scaffolds. Due to their biocompatibility and tunability on the genetic level, Elastin-like proteins (ELP) are ideal building blocks for biotechnological and biomedical applications. Nevertheless, the assembly of protein based supramolecular structures with distinct physiochemical properties and good encapsulation potential remains challenging.
Here we provide two efficient protocols for guided self-assembly of amphiphilic ELPs into supramolecular protein architectures such as spherical coacervates, fibers and stable vesicles. The presented assembly protocols generate Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) based on ELPs with adaptable physicochemical properties. PMBCs demonstrate phase separation behavior and reveal method dependent membrane fusion and are able to encapsulate chemically diverse fluorescent cargo molecules. The resulting PMBCs have a high application potential as a drug formulation and delivery platform, artificial cell, and compartmentalized reaction space.

At the interface of organic and aqueous solvents, tailored amphiphilic elastin-like proteins assemble into complex supramolecular structures such as vesicles, fibers and coacervates triggered by environmental parameters. The described assembly protocols yield Protein Membrane-Based Compartments (PMBCs) with tunable properties, enabling the encapsulation of various cargo.

Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Tailored proteinaceous building blocks are versatile candidates for the assembly of supramolecular structures such as minimal cells, drug delivery ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identifizierung von Protein-Komplexen in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Mit Sequential Peptide Affinity Purification in Kombination mit Tandem-Massenspektrometrie

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

Biologie

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of conventional light microscopes. As the resolution for a given microscope cannot be easily enhanced, we present protocols to transform the small rod-shaped gram-negative Escherichia coli (E. coli) and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) into larger, easily imaged spherical forms called spheroplasts or protoplasts. This transformation allows observers to rapidly and clearly determine whether peptides lodge themselves into the bacterial membrane (i.e., membrane localizing) or cross the membrane to enter the cell (i.e., translocating). With this approach, we also present a systematic method to characterize peptides as membrane localizing or translocating. While this method can be used for a variety of membrane-active peptides and bacterial strains, we demonstrate the utility of this protocol by observing the interaction of Buforin II P11A (BF2 P11A), an antimicrobial peptide (AMP), with E. coli spheroplasts and B. megaterium protoplasts.

Here we present a protocol to produce gram-negative Escherichia coli (E. coli) spheroplasts and gram-positive Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplasts to clearly visualize and rapidly characterize peptide-bacteria interactions. This provides a systematic method to define membrane localizing and translocating peptides.

Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine aus

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Identifizierung von Protein-Komplexen in

Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Regie Protein Verpackung innerhalb der äußeren Membran von Vesikeln

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Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung

Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Methode für effiziente Umfaltung und Reinigung des Chemorezeptor-Liganden-bindende Domäne

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Gerichtete Montage von Elastin-ähnlichen Proteinen in definierte supramolekulare Strukturen und Cargo-Verkapselung In Vitro

Identifizierung von Protein-Komplexen in

Produktion und Visualisierung von bakteriellen Spheroplasts und Protoplasten antimikrobielle Peptide Lokalisierung zu charakterisieren

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine aus