The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.

これらのプロトコルは、科学施設内動物管理使用委員会のためのカーネギー研究所（プロトコル番号139）によって承認されています。 1.動物の準備<ol><li> 10時間明：暗サイクル14時間で28℃で大人と幼虫を維持します。シェル無料アルテミア （デカプセル化、非ハッチング、14 DPFで開始）と商用マイクロペレット1日2回大人フィード。 </li><li>これらのプロトコルは、ABの背景の自然産卵により収集6-7 DPFの幼虫の使用に最適化されています。プロトコルは、他の年齢や背景の幼虫のために改変することができます。前6 DPFに外因性の食べ物を提供しないでください。 </li><li> （ミリリットルは、EMは100あたり4 mg / mlでトリカインの4.2ミリリットル）を室温（RT）で胚のメディア（EM）にトリカインで幼虫を麻酔します。 </li></ol>脂質の豊富な卵黄フィードの調製<ol><li>鶏の卵黄を準備し、格納します。 12鶏卵の卵黄と白を分離します。 1.5に卵黄、アリコート1ミリリットルをプールmlチューブ、および1年のCまで-80℃で保存してください（12黄身は〜80アリコートを行います）。白人のプール、店舗、および脂質に乏しい、タンパク質が豊富な飼料として使用します。 </li><li>所望であれば、卵黄飼料に添加される蛍光脂質類似体（複数可）を準備します。 <ol><li>製造元の指示に従って、不透明なガラス管に、アリコート（次の注意溶剤を議論を参照してください）/μlの0.1μgので100％エタノールまたは100％クロロホルムで購入し、粉末状の蛍光脂質類似体をサスペンドパラフィルムで密封し、そして店。有機溶媒の急速な蒸発に長期保存のために〜400μlのより少ない分量のボリュームを使用しないでください。 注：脂質類似体をエタノール中に懸濁されている場合、それはクロロホルムよりN 2下でより速く乾燥するので、脂質類似体の大ボリュームが使用されます。脂質アナログをエタノールに懸濁された場合には、ステップ2.2.4でリポソームフィードに追加する前に乾燥させ、再懸濁する必要はありませんが、全体のエタノール濃度が0を超えてはなりません。リポソーム飼料中1％エタノールの潜在的に交絡生理学的効果を回避します。 </li><li>蛍光脂肪酸類似体の場合：EMで20ミリリットルの5％卵黄乳剤の総容量を準備します。それから、ライブ共焦点イメージングおよび食物摂取アッセイまたはを1μg/ mlの6.4μM4,4-ジフルオロ-4-ボラ- 3A、4a-ジアザ-s-インダセン（BODIPY C 16）の最終濃度で5ミリリットルのアリコートを調製実体顕微鏡イメージングのためのBODIPY C 12。 1.5ミリリットルのプラスチックチューブに蛍光脂質類似体の所望の量を転送します。チューブから脂質を爆破しないように注意しながら、N 2気流下で脂質を乾燥させます。 </li><li>すぐに、チューブの側面ダウンストリームをピペットで5μlの100％エタノール中に再懸濁は、95μlのEMを追加し、よく混ぜます。 注：混合物が均質に表示されます。着色された脂質は、チューブの側面に残るか、液体が塊状の表示された場合、脂質は完全に可溶化し、より多くのエタノールを必要としていません。あちこちにチューブを守ります氷の上メートルの光とストア。 </li><li>蛍光コレステロールアナログの場合：ライブイメージング研究のための5ミリリットル百分の0.5から5卵黄エマルジョン中2.4 / mlのコレステロールの最終濃度を準備します。 1.5mL容のプラスチックチューブにコレステロールの所望の量を転送します。チューブから脂質を爆破しないように注意しながら、N 2気流下で脂質を乾燥させます。 </li><li>すぐに、チューブの側面ダウンストリームをピペッティングし、精製し、H 2 O中にRTの1％脂肪酸フリーBSAの85μlのと混合することによって、RTの100％エタノール15μlの中で再懸濁光からチューブを保護し、氷上で保存します。 </li></ol></li><li>卵黄リポソームフィードを準備します。 <ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブにEMに卵黄の解凍アリコートを追加します。ボルテックス1-2分間希釈した卵黄の混合物;混合物は、均質なエマルションであることが表示されます。 </li><li>タンパク質のコングロマリットを削除し、新しい、新鮮な50mlコニカルチューブに収集するために、細かいメッシュストレーナーを通して混合物を注ぎます。 </li><li>パルスソニカリポソームを作成するために、RTで：;四分の一インチテーパーマイクロチップ（6 W出力強度5倍（上の5×1秒、1秒オフ）が5月10日各セット間の秒の一時停止）と卵の混合物TE。超音波処理器の電源設定は、機器に依存しているため、各楽器やマイクロチップのための最適化を必要とします。 注：継続的に使用するまで均質性を維持するために、RTでリポソーム混合物を揺すります。 </li></ol></li><li>必要に応じて、卵黄リポソームに蛍光脂質類似体を追加します。すぐに超音波処理した後、リポソームに組み込む30秒間高速でリポソーム混合渦に準備脂質をピペット。ホイルでチューブを包むことにより、光から混合物を保護し、室温で揺れ続けます。 </li></ol> 3.摂食パラダイム<ol><li>給餌のために幼虫を準備します。 <ol><li>摂食を妨げることが明らかな形態学的欠陥のための飼料、画面の幼虫を開始する前に。 60ミリメートルX 15ミリメートルのペトリ皿または6または12ウェルのPLAへの転送の幼虫TES、最小限にEMを削減し、準備されたリポソーム溶液5mlで置き換えます。 </li><li>必要に応じて、5ミリリットルEMに無給電制御の幼虫を転送および/または5ミリリットル5％卵白EMおよび並列に扱います。 </li></ol></li><li>ゆっくり蛍光脂質類似体が存在する場合、光から遮蔽するために継続しながら、食物摂取を奨励するために、フィードを通じてインキュベートロッカー内の幼虫（30 rpmで29-31°C）を揺すります。幼虫は、光にさらされる必要がある場合は、着色ガラスインキュベーターカバーで露出を最小限に抑えることができます。 </li><li>給餌期間の終了時に、EMで3回、自由に泳ぐ幼虫をすすぎます。 注：幼虫は、フィード中の任意の時点でリポソームを消費し始めることができます。それは幼虫が同時に供給開始することが重要である場合には、食物摂取のための画面送りの1時間後（3.4を参照）、フィードを完了するために、卵黄エマルジョンへの給電を開始している唯一の幼虫を返します。 </li><li>少数EAない可能性食物摂取のために、この時点で幼虫を選別トン（一般〜0から5パーセント）。彼らが供給されているかどうかを判断するために麻酔またはわずかに氷の上の金属ブロック上で冷却された幼虫の腸を調べます。リポソームを消費した幼虫は暗く腸（ 図1）を持つことになります。 </li><li>すぐに食物摂取のための画像やプロセスの幼虫。代わりに、新鮮なEMにおける場所の幼虫および代謝処理が発生することを可能にするために28℃でインキュベートします。 </li></ol>ライブイメージング用4.取付幼虫<ol><li>マウントメディアを準備します。 <ol><li> 3％メチルセルロースの場合：-20°Cで年間の沸点近くEM、渦、4°Cで2〜3日間完全に溶解するまで室温でロック、店舗の25ミリリットルに0.75グラムのメチルセルロースを追加します。 4℃での凍結および解凍の繰り返しサイクルは、気泡を除去します。幼虫を搭載しながら、氷上で3％のメチルセルロースを保管してください。 </li><li> 1.2％の低マウントアガロースの場合：25 mLのEMにアガロース低溶融、沸騰させることによって溶解し、2ミリリットルのトンへの一定分量の0.3グラムを追加ubes、およびヒートブロック上で26から28℃に維持します。未使用のアリコートを室温で保存するか、または-20℃と使用時に再び煮沸することができます。アガロースは幼虫にさらすか、加熱過剰とすることができる前に処理するのに十分クールであることを確認してください。 </li></ol></li><li>低倍率、中スループットライブイメージングのために、氷の上の金属ブロックに組織上のスライドガラスを配置し、スライドを冷却するのを待ちます。フィッシングラインの火かき棒を使用して、3％メチルセルロースに幼虫を転送する、スライド上に（氷上で4℃に維持されている）、3％メチルセルロースの寛大な量を適用するに接着（0.41ミリメートルの直径釣り糸ガラス毛細管の端）メチルセルロースが希釈されないように（過剰EMドレイン）、必要に応じて幼虫を配置するための婚約を作成します。 </li><li>直立オイル出現を目的とした短期（&lt;20分）、高倍率のライブイメージングのため、希薄に法カバーガラスで幼虫をマウントします。 <ol><li>にシアノアクリレートベースの接着剤（スーパーグルー）を使用しますスライドガラスの一端にAA 22ミリメートル×30ミリメートルカバースリップを添付します。カバーガラスに隣接してスライド上の3％メチルセルロースの細い線を入れて、広い口径パスツールピペットを用いてスライドに幼虫を転送するためにポーカーを使用してください。それはメチルセルロースを希釈しないように余分なEMを削除します。 </li><li>カバースリップの隣に自分の頭でポーカーを使用して、そっとその両側にメチルセルロースで幼虫を配置（アップ肝臓の複数の画像を左、右の画像に胆嚢をアップ側）。 </li><li>優しく第二カバーガラスのコーナーとのスポット瞬間接着剤は、幼虫をブリッジ、取り付けられたカバースリップ上にカバースリップ、スライド上の他の一端を配置します。幼虫は無傷のままであるように、このステップの間、またはイメージングしながら目的で、過剰な圧力をかけないように注意してください。 </li></ol></li><li>直立浸対物レンズとの長期、高倍率のイメージングでは、アガロースで幼虫をマウントします。転送アガロースその後、1.2％の低融点の小アリコートに幼虫を追加します。シャーレにアガロースの小容積の幼虫。 <ol><li>迅速アガロースが固化する前に、ポーカーで幼虫を置きます。アガロースは2-3分間乾燥し、乾燥からそれを防ぐために、新鮮なEMと完全にアガロースをカバーすることができます。 </li></ol></li><li>長期的には、反転を目的とした高倍率のイメージングは​​、アガロースでガラスボトムディッシュに幼虫をマウントします。 <ol><li>氷の上の金属ブロックを冷却します。過冷却と幼虫の凍結を防止するために組織によって分離された金属ブロック上に皿を置きます。皿に幼虫を移し、組織で吸上により、EMを削除します。 </li><li>幼虫の上に28°C低融点アガロース（1.2％）の低下を置き、すぐにポーカー（ダウン最高の画像を左側肝臓、ダウン胆嚢像に右側）と位置付けます。寒ブロックから皿を外し、2-3分間乾燥させ、そしてアガロースをカバーするために、新鮮なEMの十分なボリュームを追加（〜2〜5ミリリットル）。 </li></ol></li></ol> 5.食物摂取検定<ol><li> 6.4μMBODIPY C 16を含む卵黄リポソームフィードの終わりには、EMを取り外し、プラスチック1.5または2ミリリットルチューブに10洗浄幼虫の最小値をプールし、凍結スナップ。サンプルは、数ヶ月間、光から保護し、-80℃で保存してもよいです。 注：可能な場合は、複数の複製を収集します。バックグラウンド脂質蛍光（同クラッチから理想的に幼虫が使用されている）のために正規化するために、この段階で未吸血幼虫を収集することが重要です。 </li><li>修正されたブライ・ダイアーの脂質抽出3,21を実行します 。 <ol><li> （代替的に精製されたH 2 Oを使用することができる）、氷上でサンプルに100μlの均質化緩衝液（20mMのトリス-Cl、1 mMのEDTA）を加えます。マイクロチップ超音波処理装置（：1秒間オフに1秒5秒の合計）と氷上でホモジナイズします。その幼虫を確認し、完全に均質化されています。ない場合は、繰り返します。 13 mlの使い捨てガラス培養チューブに移す（他のガラス管を使用してもよいです）。 注：クロロホルムは危険です。後続のすべての脂質の元を実行します化学フード内で室温で牽引段階。 </li><li> 2（クロロホルム：メタノール）を使用均質化緩衝液の各100μlのために、1の375μlを添加します。ボルテックス30-60秒、10分間インキュベート、使用100μlの均質化緩衝液、渦30秒あたりのクロロホルム125μlを添加します。 </li><li> （光から保護2000のx グラム 、5分、RT）を用い、100μlの均質化緩衝液、ボルテックス30秒、および遠心あたり200 mMトリスpH7.5の125μlのを追加します。慎重に遠心分離機からサンプルを削除します。上部相は水性である幼虫破片のインターフェースを、下部有機相（脂質を含有する）：これらは2相に分離されます。 </li><li>きれいなガラスピペットを用いて底部、有機相を回収し、清潔な13 mLのガラス管にそれを転送します。 注：界面における水相と幼虫破片を避けるように注意してください。汚染が発生した場合には、遠心分離工程および再収集を繰り返します。上部の水相を捨てます。削除して、これを破棄するために役立つかもしれません有機相を収集する前に相。サンプルは、最大1ヶ月間-80℃で保存することができます。 </li><li>光から保護しながら、真空下での有機相（0.12気圧）を乾燥させます。それは、脂質溶解性を低下させるように、液体が蒸発した後の試料を乾燥し続けないでください。 1（クロロホルム：メタノール）2に脂質を再懸濁し、氷上で保存します。クロロホルムの最適量：メタノール溶液を使用する検出方法に依存します。低起動し、必要に応じて希釈するために続けています。一般的なガイドラインは、10プールされた幼虫のために10μLを使用することです。 </li></ol></li><li>チャネリングTLCプレート上に等間隔でサンプル全体のボリュームを発見し、日常的に生体分子イメージングのために使用されるレーザスキャナ（ 例えば 、蛍光プレートリーダー）でプレートをスキャンします。 510から665ナノメートルから500〜650 nmおよび発光極大からの励起極大を有する物質のリストに含まれる蛍光脂質類縁体は、520 nmで488 nmのレーザー発光コレクションでの使用。 <ol><li>イメージングソフトウェアで各スポットの全蛍光を定量化します。 注意：自然対になった、未吸血幼虫サンプルの蛍光を差し引くことにより、バックグラウンド脂質蛍光を発生するための正しいです。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここに記載された技術は、研究者は、脂質の豊富な飼料と幼虫のゼブラフィッシュを扱うライブ幼虫に食餌脂質処理を可視化し、幼虫の食物摂取量を定量化することができます。成功を確実にするために、特別な注意は、いくつかの重要なステップに与えられるべきです。コマーシャル鶏の卵は異なります。潜在的な変動を最小限に抑えるために、我々は、オメガ3脂肪酸について濃縮されて...

腸は食物脂質の処理を調節する機構は、肝臓は、複合脂質の合成およびリポタンパク質代謝を制御し、これらの器官は、食物摂取量を制御するために、中枢神経系でどのように機能するか完全には理解されています。これは、肥満、心臓血管疾患、糖尿病、および非アルコール性脂肪肝疾患の現在の流行に照らして、この生物学を解明するために、生物医学的関心です。細胞培養およびマウスにおける研究食物中の脂肪と病気の間の機械的な関係の理解の大部分を提供している、およびゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、この作業を補完する理想的なモデルとして浮上しています。 ゼブラフィッシュは、急速に発展、高等脊椎動物1,2と同様の胃腸（GI）器官、脂質代謝、およびリポタンパク質の輸送があり、遺伝的に扱いやすいです。幼虫のゼブラフィッシュの光学的透明性は、in vivo試験で particulaを容易にGI系の研究のためのRの利点その細胞外環境（ すなわち 、胆汁、微生物、内分泌シグナリングは）ex vivoでのモデル化することは事実上不可能であるように。とゼブラフィッシュ幼生のイメージングを生きるために、遺伝的扱いやすさとconducivenessを組み合わせた研究によれば、体食物の操作（高脂肪3,4、 -コレステロール5、および-炭水化物ダイエット6,7）、および心血管疾患8の様々なモデル、糖尿病9,10、脂肪肝11-13、および肥満14-16、代謝洞察のホストを提供するために浮上しています。 代謝研究に幼虫のゼブラフィッシュの移行の重要な側面は、ゼブラフィッシュとゼブラフィッシュの独自の強みを活用した新規アッセイの開発に他のモデル動物で開発された技術の最適化です。このプロトコルは、技術がLIPI幼虫のゼブラフィッシュを養うために開発され、最適化された提示しますDが豊富な食事は、細胞内の解像度に全身から食餌脂質処理を可視化し、食物摂取量を測定します。それが脂肪やコレステロールの高レベルが含まれているとして、鶏の卵黄を〜（脂質が構成する脂質の豊富な食事を構成するために〜5％がコレステロールであるそのうちの鶏の卵黄の58％を、選ばれた、60％はトリグリセリドであり、35％がリン脂質であります）。ゼブラフィッシュダイエットと摂食連隊は、ラボ17全体で標準化されていないとして、鶏の卵黄は、典型的な市販のゼブラフィッシュマイクロペレット食品（〜15％の脂質）、それは特定の脂肪酸種の既知の割合で標準化された飼料であるという利点よりも多くの脂肪を提供します。また、卵黄に設けられた蛍光脂質類似食物脂質18の輸送および蓄積を可視化、脂質滴を含む画像の細胞成分複合脂質に両方としてバイタル色素3および共有結合の取り込みを介して作用することにより、薄層クロマトグラフィー（TLC）を介して代謝を調査19 </sup&gt;高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（SAF未発表データ）、および総食物摂取量20についての定量的アッセイを提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="832">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt)</td>
			<td style="width:143px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A5040-25G</td>
			<td style="width:335px;">Anesthesia for larval zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Chicken eggs</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:127px;">N/A</td>
			<td>Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Ultrasonic processor 3000 sonicator</td>
			<td style="width:143px;">Misonix, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">S-3000</td>
			<td>To make egg yolk liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Sonabox acoustic enclosure</td>
			<td style="width:143px;">Misonix, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">432B</td>
			<td>To make egg yolk liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">1/8&#8221; tapered microtip</td>
			<td style="width:143px;">Misonix, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">419</td>
			<td>To make egg yolk liposomes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Amber vials (4 ml, glass)</td>
			<td style="width:143px;">National Scientific</td>
			<td style="width:127px;">13-425</td>
			<td>Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Incu-Shaker Mini&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Benchmark</td>
			<td style="width:127px;">1222U12</td>
			<td>Incubated shaker for feeds</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C16&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D3821</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C12&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D3822</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C5&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D3834</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">BODIPY FL C5</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">D2183</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">TopFluor cholesterol&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Avanti Polar Lipids Inc.</td>
			<td style="width:127px;">810255</td>
			<td>Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Fatty acid-free BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A0281-1G</td>
			<td>For TopFluor cholesterol solubilization</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">M0387</td>
			<td>Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:127px;">BP165-25</td>
			<td>Mounting media for live larval imaging; 22 x 30</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">VWR microscope slides&#160;</td>
			<td style="width:143px;">VWR&#160;</td>
			<td style="width:127px;">16004-422</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Coverslips&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Cover Glass</td>
			<td style="width:127px;">12-544A</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Super glue</td>
			<td style="width:143px;">Loctite</td>
			<td style="width:127px;">LOC01-30379</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">FluoroDish (glass bottom dish)</td>
			<td style="width:143px;">World Precision Instruments, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:127px;">FD35-100</td>
			<td>Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsytems</td>
			<td style="width:127px;">SP-2, SP-5</td>
			<td>Microscope for high magnification live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Stereoscope</td>
			<td style="width:143px;">Nikon</td>
			<td style="width:127px;">SM21500</td>
			<td>Microscope for low magnification live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Glass culture tubes&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Kimble</td>
			<td style="width:127px;">73500-13100</td>
			<td>Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Savant SpeedVac Plus&#160;</td>
			<td style="width:143px;">ThermoQuest</td>
			<td style="width:127px;">SC210A</td>
			<td>Lipid extraction</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Channeled TLC plates</td>
			<td style="width:143px;">Whatman Scientific</td>
			<td style="width:127px;">WC4855-821</td>
			<td>Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">Channeled TLC plates</td>
			<td style="width:143px;">Analtech, Inc.</td>
			<td style="width:127px;">66911</td>
			<td>Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td>
			<td style="width:143px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:127px;">9410</td>
			<td>Fluorescent plate reader for food intake assay</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:231px;">ImageQuant software</td>
			<td style="width:143px;">GE Healthcare</td>
			<td>29000605</td>
			<td>Analysis of food intake assay</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:231px;">5 3/4&#8217; Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Kimble</td>
			<td style="width:127px;">63A53WT</td>
			<td>Transfering larvae</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-fat feeding paradigm for larval zebrafish: feeding, live imaging, and quantification of food intake

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.

29-31℃でロッカーに供給すると、健康な幼虫（≥95％）の大半は、1時間以内に食べるようになります。卵黄エマルジョンを消費すると、幼虫の腸は、カラーで暗くなります。非常に暗い腸2時間（ 図1）で観察することができます。幼虫が未吸血されているか、または供給するために失敗した場合、腸は透明なまま。幼虫供給卵白展示色で暗くしない膨張した腸管腔。 <p class="jo...

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High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake

Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich ...

high-fat-feeding-paradigm-for-larval-zebrafish-feeding-live-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K ビュー.  Carnegie Institution for Science. Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques. 

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Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

生物学

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

ハイドラ内グルタチオンによって誘発される摂食応答を測定する

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant defense response to microbial elicitors and to wounding caused by chewing insects, eliciting systemic calcium signals in plants. However, the role of calcium in vivo during biotic stress is still unclear. This protocol describes the use of a genetically-encoded calcium sensor to detect calcium signals in plants during feeding by a hemipteran pest. Hemipterans such as aphids pierce a small number of cells with specialized, elongated sucking mouthparts, making them the ideal tool to study calcium dynamics when a plant is faced with a biotic stress, which is distinct from a wounding response. In addition, fluorescent biosensors are revolutionizing the measurement of signaling molecules in vivo in both animals and plants. Expressing a GFP-based calcium biosensor, GCaMP3, in the model plant Arabidopsis thaliana allows for the real-time imaging of plant calcium dynamics during insect feeding, with a high spatial and temporal resolution. A repeatable and robust assay has been developed using the fluorescence microscopy of detached GCaMP3 leaves, allowing for the continuous measurement of cytosolic calcium dynamics before, during, and after insect feeding. This reveals a highly-localized rapid calcium elevation around the aphid feeding site that occurs within a few minutes. The protocol can be adapted to other biotic stresses, such as additional insect species, while the use of Arabidopsis thaliana allows for the rapid generation of mutants to facilitate the molecular analysis of the phenomenon.

Real-time In Vivo Recording of Arabidopsis Calcium Signals During Insect Feeding Using a Fluorescent Biosensor

This protocol outlines a simple method for analyzing calcium signals in plants generated by feeding hemipteran insects, such as aphids. Arabidopsis thaliana transformed with the GFP calcium biosensor GCaMP3 allow for the real-time in vivo imaging of calcium dynamics with a high temporal and spatial resolution.

リアルタイム体内シロイヌナズナカルシウム信号の間に記録して蛍光バイオ センサーを用いた昆虫の餌

Calcium ions are predicted to be key signaling entities during biotic interactions, with calcium signaling forming an established part of the plant ...

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been conducted to investigate the effect of gut microbes as a whole; however, different microbes could exert distinct effects toward the host. This article provides the methodology to study the effect of each specific mosquito gut microbe and the potential mechanism.
This protocol contains two parts. The first part introduces how to dissect the mosquito midgut, isolate cultivable bacteria colonies, and identify bacteria species. The second part provides the procedure to generate antibiotic-treated mosquitoes and reintroduce one specific bacteria species.

This article presents a protocol to investigate the effect of individual mosquito gut bacteria, including isolation and identification of mosquito midgut cultivable microbes, antibiotic depletion of mosquito gut bacteria, and reintroduce one specific bacteria species.

抗生物質処理された蚊による細菌性経口摂食アッセイ

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease transmitted through an infectious bite from the female Anopheles mosquito. Malaria control will eventually rely on a multitude of approaches, which includes ways to block transmission to, through and from mosquitoes. To study mosquito stages of malaria parasites in the laboratory, we have optimized a protocol to culture highly infectious Plasmodium falciparum gametocytes, a parasite stage required for transmission from the human host to the mosquito vector. P. falciparum gametocytes mature through five morphologically distinct steps, which takes approximately 1-2 weeks. Gametocyte culture described in this protocol is completed in 15 days and are infectious to mosquitoes from days 15-18. These protocols were developed to maintain a continuous cycle of infection competent gametocytes and to maintain uninterrupted supply of mosquito stages of the parasite. Here, we describe the methodology of gametocyte culture and how to infect mosquitoes with these parasites using glass membrane feeders.

Plasmodium falciparum Gametocyte Culture and Mosquito Infection Through Artificial Membrane Feeding

Detailed investigations on mosquito stages of malaria parasites are critical to design effective transmission blocking strategies. This protocol demonstrates how to effectively culture infectious gametocytes and then feed these gametocytes to mosquitoes to generate mosquito stages of P. falciparum.

熱帯熱マラリア原虫 人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染

Malaria remains one of the most important public health problems, causing significant morbidity and mortality. Malaria is a mosquito borne disease ...

Live Imaging of Microtubule Dynamics in Glioblastoma Cells Invading the Zebrafish Brain

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment failure is mainly due to the invasiveness of GBM cells, which speaks for the need for a better understanding of GBM motile properties. To investigate the molecular mechanism supporting GBM invasion, new physiological models enabling in-depth characterization of protein dynamics during invasion are required. These observations would pave the way to the discovery of novel targets to block tumor infiltration and improve patient outcomes. This paper reports how an orthotopic xenograft of GBM cells in the zebrafish brain permits subcellular intravital live imaging. Focusing on microtubules (MTs), we describe a procedure for MT labeling in GBM cells, microinjecting GBM cells in the transparent brain of 3 days post fertilization (dpf) zebrafish larvae, intravital imaging of MTs in the disseminating xenografts, altering MT dynamics to assess their role during GBM invasion, and analyzing the acquired data.

We report a technique permitting live imaging of microtubule dynamics in glioblastoma (GBM) cells invading a vertebrate brain tissue. Coupling the orthotopic injection of fluorescently tagged GBM cells into a transparent zebrafish brain with high-resolution intravital imaging allows the measurement of cytoskeleton dynamics during in situ cancer invasion.

ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング

With a dismal median survival time in real populations-between 6 to 15 months-glioblastoma (GBM) is the most devastating malignant brain tumor. Treatment ...

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

要約

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ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

キメラゼブラフィッシュ胚における網膜と脳の開発のライブイメージングのためのGFP発現割球の移植

開発ゼブラフィッシュの表皮から細胞の押出のライブイメージング

ライブの検出

ハイドラ内グルタチオンによって誘発される摂食応答を測定する

リアルタイム体内シロイヌナズナカルシウム信号の間に記録して蛍光バイオセンサーを用いた昆虫の餌

抗生物質処理された蚊による細菌性経口摂食アッセイ

熱帯熱マラリア原虫人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染

ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

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ライブゼブラフィッシュの胚における二光子軸索切断とタイムラプス共焦点イメージング

共焦点顕微鏡によるゼブラフィッシュ胚の脳のイメージングを生きる

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ハイドラ内グルタチオンによって誘発される摂食応答を測定する

リアルタイム体内シロイヌナズナカルシウム信号の間に記録して蛍光バイオ センサーを用いた昆虫の餌

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熱帯熱マラリア原虫 人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染

ゼブラフィッシュ脳に侵入する膠芽腫細胞における微小管動態のライブイメージング

リアルタイム体内シロイヌナズナカルシウム信号の間に記録して蛍光バイオセンサーを用いた昆虫の餌

熱帯熱マラリア原虫人工膜供給による食作用細胞培養と蚊感染