この方法は、ゼブラフィッシュの脳腫瘍細胞のアトピー注射と細胞内生体内イメージングを組み合わせることにより、脳腫瘍浸潤中の微小管の役割の調査に専念しています。この技術の主な利点は、微小管細胞骨格が獲得される高い空間時間分解能にあります。in vivo脳腫瘍浸潤モデルとしてはユニークであり、微小管ダイナミクスの詳細な解析を可能にします。
in situ脳腫瘍細胞浸潤の細胞内イメージングは、癌浸潤に関与する可能性のある任意の目的タンパク質の分析に使用できます。まず、摂氏37度で培養した膠芽腫細胞をPBSで洗浄します。1ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを添加し、すべての細胞が完全に剥離するまでセルインキュベーター内で摂氏37度で5〜10分間インキュベートして、細胞を剥離します。
50ミリリットルの遠沈管内の5ミリリットルの完全膠芽腫細胞培地に細胞を再懸濁します。45ミリリットルの氷冷PBSを加え、134倍Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、完全に上下にピペッティングすることにより、1ミリリットルの氷冷PBSで細胞を再懸濁します。
さらに49ミリリットルの氷冷PBSを加え、134倍Gで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞を200マイクロリットルの氷冷PBSに再懸濁します。移植手順の間、氷上に保管してください。
膠芽腫細胞をゼブラフィッシュ幼虫の中脳にマイクロ注入するには、マイクロインジェクションキャストプレートに、トリカイン1リットルあたり160ミリグラムを添加した6ミリリットルのE3培地を充填します。12匹のDEE-KOHR-EE-UH-NAY-TED幼虫をマイクロインジェクションプレートに移します。幼虫が麻酔をかけられ、触っても完全に反応しなくなったら、横向きの塹壕に合わせ、頭を上げて卵黄嚢をサイズ00の絵筆で塹壕の壁に押し付けます。
次に、マイクロローディングチップを使用して5マイクロリットルの膠芽腫細胞をマイクロキャピラリーにロードし、キャピラリーをユニバーサルキャピラリーホルダーに挿入します。麻酔をかけた幼虫を入れたマイクロインジェクションプレートを実体顕微鏡ステージに置きます。マイクロマニピュレーターノブを使用して、マイクロキャピラリーの先端をマイクロ注入プレートの境界に配置します。
次にメスでそれを破って、細胞の直径とほぼ同じ大きさの鋭いエントリポイントを作成します。マイクロインジェクターにオイルを静かに流し、針の先端を培地に突っ込んで、細胞が毛細血管から流出していることを確認します。毛細血管の先端に細胞を集中させて、注入される体積あたりの注入細胞数を最大化し、脳組織がPBSで満たされないようにします。
オイルが手動でインジェクターに導入されるときに、マイクロキャピラリーから出てくる細胞を注意深く調べます。手動ノブで20〜50セルを供給するために必要な回転数を経験的に定義します。通常、細胞が十分に濃縮されている場合、約10個の細胞を排出するには1回の穏やかな回転で十分です。
毛細血管の先端を中大脳静脈のすぐ上の左視蓋に近づけます。皮膚膜が壊れるまで毛細血管を幼虫にそっと押し付けます。視蓋の適切な位置に到達したら、細胞を排出します。
毛細血管の先端を注意深く観察して、動物の中に入る細胞の流れを視覚化し、それによって注射が成功するようにします。必要な数の動物に対して手順を繰り返します。実験者の注入速度に応じて、毛細血管内の細胞が急速に凝集するため、10〜20匹の幼虫ごとに針の交換が必要になる場合があります。
異種移植が完了したら、マイクロインジェクションプレートから幼虫を取り除き、ミネラル源水PTUとメチレンブルー培地で満たされた24ウェルプレートでそれらを選び出します。1%低融点AH-KROH溶液を調製します。沸騰した1%低融点AH-KROH溶液500マイクロリットルを1.5ミリリットルの遠沈管に移し、ヒートブロック上で摂氏37度で冷却します。
トリカイン1リットルあたり160マイクログラムをAH-KROHSに加え、よく混ぜます。1〜4匹の異種移植幼虫を、ミネラル源水PTUとトリカイン1リットルあたり160マイクログラムで補完されたメチレン培地で満たされた3.5センチメートルのペトリ皿に移します。幼虫が麻酔をかけられ、触覚に完全に反応しなくなったら、細い先端トランスファーピペットを使用してAH-KROHSとトリカインを含むチューブに慎重に移します。
幼虫をAH-KROHSと穏やかに混ぜます。大きな電球トランスファーピペットを使用して、AH-KROHSに混合された幼虫をガラス底の3.5センチメートルのビデオイメージング皿の中央に置きます実体顕微鏡下で幼虫を背中にすばやく配置します。マイクロローディングチップを使用して余分なAH-KROHSを取り除き、可能な限り薄いAH-KROHS層を維持します。
AH-KROHSが固まったら、2.5ミリリットルのイメージング培地を加えます。浸潤した膠芽腫細胞における微小管動態のin vivoライブイメージングでは、AH-KROHS包埋異種異種移植幼虫を含むビデオイメージング皿を、温度を摂氏32度に設定した倒立共焦点顕微鏡の環境チャンバーに入れます。電動XYステージを使用して、10倍の対物レンズを備えたビデオイメージング皿で幼虫を見つけます。
エスケープを押して対物レンズの砲塔を下げ、60倍の対物レンズに鉱物油を追加し、エスケープを押して最初の焦点位置に戻ります。561ナノメートルのレーザー光源、20%のレーザー出力、および200ミリ秒の時間曝露に設定された赤色チャネルで浸潤する膠芽腫細胞を観察します。次に、微小管ネットワークが広がり、微小管フィラメントを簡単に区別できる細胞を選択します。
Zシリーズの設定を行います。200マイクロメートルの範囲のピエゾステージを使用して、10〜30マイクロメートルの深さのZスタックで十分な微小管ネットワークの上部と下部の位置を選択し、0.3マイクロメートルのZスライスステップで移動する細胞の突起内の微生物ネットワークを視覚化します。タイムラプス取得設定を設定して、取得速度、Zスタック深度、蛍光シグナルの最適なバランスを取り、急速な光退色を回避します。
微小管の画像を5〜10秒ごとに数分間取得し、5Dハイパースタックを保存します。微小管のダイナミクスは、成長および収縮する微小管に沿ってカイモグラフを構築し、個々の微小管エッジを経時的に手動で追跡することによって測定されました。幼虫培地に投与される薬物処置および微小管ネットワーク組織に対するその可逆的効果は、200ナノモル用量のノコダゾールで処理することによって評価した。
これにより、微小管ネットワークの漸進的な収縮と4時間後に膠芽腫細胞の突出が消失しました。薬物を洗い流すと、膠芽腫細胞が突起を形成する能力が回復した。細胞は、ウォッシュアウトの12時間後に血管系に沿って移動を再開し、200ナノモルのノコダゾール投与量で微小管ネットワークを破壊し、in vivo膠芽腫細胞の浸潤を迅速にブロックするのに十分であることを示しています。
世界的な膠芽腫細胞浸潤に関する同じ治療法の3日間の分析により、ノコダゾールは対照と比較して魚の一般的な健康に影響を与えることなく、in vivoで長期の膠芽腫細胞浸潤を停止させることが明らかになりました。受精後3日目の健康な幼虫から始めて、細胞を毛細血管に集中させ、脳に注入される量を最小限に抑え、独特の腫瘍塊を形成し、脳室への注入を避けるようにしてください。
