この研究は、国立衛生研究所(R37CA228304とR01HL146642からXi Chen、CA148761からジェフリーM)によってサポートされました。 ローゼン、米国国防総省(W81XWH-19-1-0524から西陳へ、W81XWH-19-1-0035からXiangdong Lv)、アメリカ癌学会(RSG-18-181-01-TBEからXi Chen)、癌予防研究所(RR150009 CPRIT研究学者)、チ・シー賞を受賞 ベイラー医科大学の患者由来ゼノグラフトおよびアドバンストインビボモデルコア(RP170691 CPRITコア施設賞とNCI-CA125123 P30がんセンターサポートグラントからの資金提供)。

動物を使用するすべてのプロトコルは、制度的動物管理使用委員会(IACUC)によって審査され、承認されています。腫瘍断片は、約1〜2mm3の大きさで、ベイラー医科大学の患者由来ゼノグラフトおよびアドバンスト・イン・ビボ・モデルズ・コアから得られた凍結ストックから得られた。
1. 凍結保存乳腺腫瘍の移植のための調製
<ol><li>液体窒素から37°Cの水浴に腫瘍断片を含むcryovialを移します。</li>
	<li>解凍中に時折穏やかなフリックでクライボシャルを攪拌します。</li>
	<li>ティッシュが解凍されたら、水浴から凍結を取り出し、穏やかな反転によって混ぜます。</li>
	<li>除く除物の外側を乾燥させ、70%エタノールでスプレーします。バイオセーフティフードに移します。</li>
	<li>解凍した腫瘍組織を、10 mLの冷たいダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)で満たされた15 mLの円錐形の管に移す。チューブを反転させることでよく混ぜます。組織断片をチューブの底に落ち着かせる。</li>
	<li>上清を吸引し、冷たいDMEMの10 mLで再懸濁します。チューブを反転させることでよく混ぜます。組織断片をチューブの底に落ち着かせる。</li>
	<li>上清を吸引し、冷たいDMEMの10 mLで再懸濁します。チューブを氷の上に置きます。 注:組織は移植の準備ができています。</li>
</ol>2. 移植のための新鮮な乳腺腫瘍の採取と調製
<ol><li>乳房腫瘍を持つマウスを安楽死させる。 注:PDXホストは、現在の研究では3〜5週齢の雌Balb/cマウスが使用されている間、SCID /ベージュ、NSGまたはNRG雌マウスであってもよい。</li>
	<li>安楽死させたマウスの腫瘍領域を70%エタノールでスプレーする。 注意:凍結保存や移植のために腫瘍断片の汚染を引き起こす可能性のある腫瘍サンプルで毛髪を避けるようにしてください。</li>
	<li>鋸歯状鉗子を使って腫瘍を取り巻く皮膚をつまんで持ち上げ、はさみを使って短い切開を行う。</li>
	<li>はさみで皮膚から腫瘍を分離し、宿主マウスから腫瘍全体を解剖する。腫瘍の外面から残っているマウス脂肪パッド組織を切り取る。5 mLの冷たいDMEMで満たされた15 mL円錐状のチューブに腫瘍を入れる。 注:大きな腫瘍は壊死性のコアを含む可能性が高いので、直径1cmの最大サイズで腫瘍を使用してください。</li>
	<li>バイオセーフティフードでは、乾燥を防ぐために十分なDMEMを含む滅菌10cmペトリ皿に解剖された腫瘍を移す。</li>
	<li>無菌状態でメスまたはブレードで1mm3 断片に腫瘍を切断します。 注:メスやブレードは、使用前に少なくとも20分間、バイオセーフティフードのUVの下で露出する必要があります。</li>
	<li>腫瘍断片を、冷たいDMEMで満たされた15 mL円錐状のチューブに移す。チューブを氷の上に置きます。 注:組織は移植の準備ができています。ステップ2.4から解剖された腫瘍断片を、 1)タンパク質およびRNA/DNA抽出のために液体窒素中で凍結し、2)4%パラホルムアルデヒド(PFA)または10%中性緩衝ホルマリン(NBF)で固定ヘマトキシおよびエオシン(H&E)および免疫組織化学(IHC)分析、または3)凍結保存中1.25 mL凍結培地(10%ジメチルスルホキシドキシド)[DMSO、2] 40%DMEMおよび50%のウシ血清[FBS])は、一晩で-80°Cの冷凍庫で凍結を遅くし、その後、長期保存のために液体窒素に移すことによって。</li>
</ol>3. 手術のための動物を準備します。
<ol><li>動物の痛みの管理のために, 皮下にブプレノルフィン持続放出 60 1 mg/kg の用量で手術の前に、または鎮痛のカバレッジの 72 時間のための機関のガイドに従ってください。.</li>
	<li>無菌手術のための制度的ガイドラインに従って外科スイートを設定します。</li>
	<li>イゾフルラン麻酔装置の誘導室で4週齢の女性を約11.25 mL/hの割合で麻酔します。マウスを手順領域に移し、滅菌(シリコーンゴム)手術板に移し、そこで小さなフェイスマスクを通して麻酔を受けます。背中にマウスを置き、自然な位置に足をテープダウンします。 注意: SCID/ベージュ、NSGまたはNRGはPDXに使用され、BALB / cはGEMM移植モデルに使用されます。</li>
	<li>目の乾燥を防ぐために眼科軟膏を適用します。</li>
	<li>つまみつまみによって適切なレベルのセドを確認します。 注:動物の応答/動きは、動物が十分に麻酔され、手術の準備ができていることを示しています。</li>
	<li>下腹部、特に手術が行われる4番目の乳首の周りの領域にマウスを剃ります。</li>
	<li>円形運動を使用し、手術部位の中心から始めて、ポビドネヨウ素外科スクラブで外縁に向かって作業し、続いて70%イソプロピルエタノールパッドを使用してポビドネヨウ素を除去する。さらに 2 回繰り返します。</li>
</ol>4. 腫瘍断片の第4(インジュネータル)乳腺脂肪パッドへの移植
<ol><li>切開部位を除く動物の体を覆うために無菌外科用ドレープを使用してください。 注:切開を行う前につまみつまみによって適切なレベルの沈下を確認してください。</li>
	<li>鋸歯状鉗子を使用してピンチし、#4乳首で皮膚を持ち上げます。</li>
	<li>鈍い側面を下にして、頭に向かって#4乳首から短い(約1cm)、パラサジタル切開を作るためにはさみを使用してください。</li>
	<li>綿の先端のアプリケーターを使用して、切開の内側側の腹側から皮膚を分離する。</li>
	<li>切開の側側を保持しながら、同じ綿棒を使用して皮膚から#4乳脂肪パッドを静かに剥がします。</li>
	<li>脂肪パッドが分離されたら、動物の体の近くに27 Gの針で皮膚をピン留めします。</li>
	<li>内在性マウス乳腺上皮の脂肪パッドをクリアすることが実験的に必要である場合は、以下の手順を行う。<ol>
<li>鋸歯状鉗子を使用して、脂肪パッドを身体から離して静かに伸ばし、腺の主要血管の交点の下にあるインギナルリンパ節を見つける(鉗子が腺を保持する場所の近く)。</li>
		<li>慎重にリンパ節に血管を媒介し、脂肪は三角形の領域を形成する第4および第5の脂肪パッドを結合する。 メモ:このステップでは、酸素源を一時的にオフにします。</li>
		<li>マイクロ解剖ハサミを使用して、リンパ節を含む脂肪パッドのセクションが取り除かれるまで、各焼灼された容器を一度に1つずつ切断する(各切り取り後に出血がないことを確認する)。</li>
		<li>「クリアされた」脂肪パッド組織を捨てます。</li>
	</ol></li>
	<li>鈍い分離鉗子を使用して、第4の乳腺脂肪パッドを保持します。一方、角度を付けた細い鉗子の閉じた先端を残りの容器の上の脂肪パッドの中央に挿入し、腹壁に近い。ゆっくりと小さなポケットを作るために鉗子を開きます。脂肪パッドから斜めの細かい鉗子を取り除きます。</li>
	<li>角度付きの細い鉗子を使用して、腫瘍の断片を取り、ポケットに挿入します。</li>
	<li>ゆっくりと鉗子の先端を開き、脂肪パッドポケットに腫瘍片を放出する。</li>
	<li>角度を付けた細かい鉗子を慎重に引き出します。 メモ:ポケットを見て、鉗子を引き出すときに腫瘍片が乳腺脂肪パッドのポケットに残っていることを確認します。実験や銀行業務に過剰な腫瘍組織が必要な場合、腫瘍は両方の対側脂肪パッドに移植され得る。両側移植を行った動物は、対側腫瘍間の相互作用が知られているため、治療研究には推奨されません。あるいは、トロカール装置が移植プロセスに使用される場合があります。</li>
	<li>切開部の基部から始めて、爪と鋸歯状鉗子を用いて両側の皮膚を採取する。両側を一緒に持ち上げ、わずかに持ち上げて、創傷クリップの塗布のために皮膚を準備します。爪の鉗子で切開のエッジをアンカールし、上部に連続した表面を形成するためにエッジを一緒につまみます。</li>
	<li>鋸歯状鉗子と一緒に両側を保持し、切開部の中央に創傷クリップを配置するために創傷クリップアプリケーターを使用します。必要に応じて、切開の端部に組織接着剤を塗布し、密閉して固定します。</li>
	<li>動物を、暖かい表面にあるきれいなケージに入れます。術後の期間に出血、脱ヒスジェンスの徴候、および痛みを監視します。動物は手術後数分以内に立ち上がって動いているはずです。</li>
	<li>手術後少なくとも3日間は、切開部位と動物の全体的な健康状態に細心の注意を払ってください。疼痛管理のための制度ガイドラインに従ってください。</li>
	<li>次の移植を続行する前に、ガラスビーズの滅菌器で10 sの外科用具を洗浄してください。使用する前に、ツールが冷却されるまで待ちます。</li>
	<li>すべてのマウスが移植されるまで、ステップ 4.1~4.15 を繰り返します。 注:エストロゲン補充は、水または遅い放出ペレット59を介して供給することができるER+腫瘍のために必要とされます。</li>
</ol>5. 薬物治療に応答した腫瘍の成長をモニタリングする
注:確立された移植可能なPDXおよびp53-ヌル腫瘍の可知性腫瘍は、内在性腫瘍増殖率に応じて、手術後に発症するのに2週間から8週間かかる。
<ol><li>週2回、カリパーを用いて2次元で腫瘍を測定する。次の式を使用して、体積を計算します。 腫瘍容積(mm3)=W2 x L/2 ここでWは幅、Lは腫瘍の長さである。</li>
	<li>腫瘍容積が150-300 mm3に達すると、薬物治療を開始する。 注:薬物の性質に応じて、経口ギャビンまたは腹腔内注射を使用して薬物を送達してもよい。</li>
	<li>腫瘍サンプルを収集し、IHC染色60、タンパク質およびRNA/DNA単離および免疫フェノタイピング61 を様々な目的のために行う。血液を収集し、免疫のフェノタイピングを実行したり、薬物動態/薬力学研究のためにそれを使用します。.</li>
</ol>

MTLは、StemMed株式会社の限定パートナーの創設者であり、ゼネラルパートナーであるStemMedホールディングスの創設者兼マネージャーです。MTLは、トバルディ・セラピューティクス社の創設者であり、株式会社ステムメドの補償を受けた従業員です。

動物間の腫瘍増殖の変動を減らすためには、移植のために腫瘍組織を1mm3 断片に切断することが重要である。軟組織を成長させるモデルは作業が難しく、腫瘍断片を少し大きく切る必要がある(1-2 mm3)。乳脂肪パッドポケットに組織を配置する場合は、これは複数の小さな腫瘍または奇妙な形の腫瘍をもたらすので、複数の部分に組織を分割しないように注意してください。...

乳癌による死亡の大部分は、従来の治療法1,2に耐性のある再発性疾患に起因する可能性がある。乳癌の腫瘍間および腫瘍内不均一性は、治療抵抗に寄与する。さらに、腫瘍の不均一性は、正確な予後に影響を及ぼし、疾患管理に挑戦する3、4.応答の予測バイオマーカーの同定は、乳癌患者の臨床転帰を有意に改善する。ほとんどの乳癌タイプは免疫療法に反応しない可能性が高い免疫学的に「冷たい」腫瘍であるにもかかわらず、免疫チェックポイント阻害剤は臨床試験2,5で約束を示している。例えば、第III相試験は、アテゾリズマブ(PD-L1に対するモノクローナル抗体)とナブパクリタキセルを組み合わせた予備的証拠を示し、≥1%PD-L1染色6を有する腫瘍におけるナブ・パクリタキセル単独と比較して全体的な生存利益を提供し得る。乳房腫瘍を免疫療法に感作する治療法の開発は、治療レジメンに革命をもたらす。
ヒト乳癌の不均一性と薬物反応を忠実に再現する前臨床モデルは、腫瘍生物学を研究し、標的治療の潜在的なバイオマーカーを同定するために重要である。不死化細胞株は、これらの細胞株が成長しやすく、分子機構を研究するために遺伝的に改変することが容易であるため、乳癌研究に広く使用されています。しかし、インビトロでの長期細胞培養からの選択的な圧力のために、遺伝的ドリフトが経つにつれて起こり、乳癌細胞株は原発性乳房腫瘍7、8、9における収差とは異なる細胞株特異的ゲノム変化を運ぶ可能性がある。
患者由来異種移植片(PDX)腫瘍塊は、ヒト疾患の異質性を再現することができ、起源の腫瘍10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22に組織学的および免疫組織学的に類似している 、23,24,25,26,27,28,29.重要なことに、PDXモデルは、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22によって証明されるように、複数の移植にわたって典型的に安定である、23,24,25,26,27,28,29.PDXモデルは、臨床的に観察されたものに匹敵する治療応答を示す10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24, 25、26、27 、28、29。エストロゲン受容体陽性(ER+)、プロゲステロン受容体陽性(PR+)、上皮成長因子2陽性(ERBB2+、HER2+)およびトリプルネガティブ乳癌(TNBC)PDXモデルが確立されており、内分泌、化学、標的療法を試験するための優れたプラットフォームを提供する。しかし、現在のPDXモデルの主な注意点の1つは、マウスの機能的免疫系の欠如である。
Trp53ホモ接合性ヌル、cMyc、Wnt1、PyMT、またはHer2過剰発現モデルなどの遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、無傷の免疫系の文脈における自発的な腫瘍開始、進行および転移の研究を可能にする。しかし、腫瘍の遅延は長く、複数の腕30、31で前臨床試験を行うことは困難です。しかし、GEMMをシンジニック宿主体に移植して、ヒト腫瘍32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、42、44、45を密接に再現する腫瘍を十分な数の腫瘍を生成することができる。 46,47,48,49,50,51,52 ,53,54,55.例えば、p53-null BALB/cマウスからの乳腺上皮を、同種性野生型レシピエントマウスのクリアされた脂肪パッドに移植して原発性腫瘍を形成し、これはさらに同系宿主56,57に移植することができる。p53-ヌル腫瘍は、ヒト腫瘍の異なるサブタイプを再現した。
PDXモデルと移植可能なGEMMの組み合わせは、乳房腫瘍生物学、薬物応答および抗腫瘍免疫を調査するための貴重な前臨床ツールを提供する。現在のプロトコルでは、マウス乳腺脂肪パッドへのPDXおよびGEMM腫瘍断片の異所移植の方法が記載されている。これらのモデルは、シリアル通路に適しており、通常は安定した表現型を保持します。経時経過を越えて遺伝的ドリフトまたは異種性の喪失のリスクを軽減するために、生物学的または形態学的変化が経時29、58に観察される場合には、その後の移植のために、複数の組織断片が各通路で凍結保存される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mg/mL Buprenorphine-SR</td>
			<td>ZooPharm (via BCM veterinarians)</td>
			<td></td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>148232E</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Scrub</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-027132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Swabs</td>
			<td>VWR International Laboratory</td>
			<td>89031-272</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT 10-013-CM</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Oster</td>
			<td>78005-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads sterilizer (Germinator)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>DS-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant ophthalmic ointment</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>17478-062-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps; Serrated, Angular (regular forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5139</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Spring Scissors (fat pad cutter)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5658BT</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Forceps (tissue placing forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5069</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-757- 100D</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile drape</td>
			<td>Sai Infusion Technology</td>
			<td>PSS-SD1</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5960</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps (claw forceps)</td>
			<td>Roboz Surgical Store</td>
			<td>RS-5158</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip applier</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clip remover</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-15</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound clips</td>
			<td>BD Autoclip Wound System</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td>Sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of breast tumors as preclinical models for breast cancer

腫瘍の不均一性と治療応答を忠実に再現する前臨床モデルは、トランスレーショナル乳癌研究にとって重要です。不死化細胞株は、分子機構を研究するために成長し、遺伝的に改変しやすいが、細胞培養からの選択的圧力はしばしば時間の経過とともに遺伝的およびエピジェネティックな変化をもたらす。患者由来の異種移植片(PDX)モデルは、ヒト乳房腫瘍の異質性および薬物反応を忠実に再現する。PDXモデルは、乳房腫瘍生物学および薬物応答の調査を容易にする整形移植後の比較的短い待ち時間を示す。移植可能な遺伝子操作されたマウスモデルは、乳房腫瘍免疫の研究を可能にする。現在のプロトコルは、乳房腫瘍断片を乳腺脂肪パッドに整所的に移植し、続いて薬物治療を行う方法を説明している。これらの前臨床モデルは、乳房腫瘍生物学、薬物反応、バイオマーカー発見および薬剤耐性のメカニズムを調査するための貴重なアプローチを提供する。

図1 は、装具(図1A)と、交位移植の主要な手順(図1B)を示しています。 図2 は、移植PDX腫瘍(MC1)の特徴を示す。MC1モデルの腫瘍断片(1mm3)をSCID/ベージュマウスの#4脂肪パッドに移植した。1か月後、平均腫瘍サイズは約350mm3に達した。腫瘍容積...

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Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび移植可能な遺伝子組み換えマウスモデルは、ヒト疾患を忠実に再現し、基礎的および翻訳的な乳癌研究のための好ましいモデルである。ここで、乳房腫瘍断片を乳腺脂肪パッドに整形移植して腫瘍生物学を研究し、薬物反応を評価する方法について説明する。

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

orthotopic-transplantation-breast-tumors-as-preclinical-models-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

5.8K ビュー.  Baylor College of Medicine. 患者由来異種移植片(PDX)モデルおよび移植可能な遺伝子組み換えマウスモデルは、ヒト疾患を忠実に再現し、基礎的および翻訳的な乳癌研究のための好ましいモデルである。ここで、乳房腫瘍断片を乳腺脂肪パッドに整形移植して腫瘍生物学を研究し、薬物反応を評価する方法について説明する。

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Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery of the next generation of novel drug targets. It is becoming apparent that more complex models of cancer are required to fully appreciate the contributing factors that drive tumorigenesis in vivo and increase the efficacy of novel therapies that make the transition from pre-clinical models to clinical trials.
Here we present a methodology for generating uniform and reproducible tumor spheroids that can be subjected to siRNA functional screening. These spheroids display many characteristics that are found in solid tumors that are not present in traditional two-dimension culture. We show that several commonly used breast cancer cell lines are amenable to this protocol. Furthermore, we provide proof-of-principle data utilizing the breast cancer cell line BT474, confirming their dependency on amplification of the epidermal growth factor receptor HER2 and mutation of phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) when grown as tumor spheroids. Finally, we are able to further investigate and confirm the spatial impact of these dependencies using immunohistochemistry.

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

癌細胞スフェロイド培養における潜在的に新規薬剤標的を同定するためのスクリーニング機能ゲノミクスを利用

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

がん研究

Ultrasonographic Evaluation of Breast Cancer-related Lymphedema

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet exists. Progressive Resistance Exercise (PRE) is expected to improve lymphedema without additional swelling. This study showed the therapeutic effects of PRE on lymphedema by using ultrasonography to measure the change in thickness of the muscle and subcutaneous tissue. The thickness of subcutaneous tissue decreased more in the PRE group than in the non-PRE group. Ultrasonography is widely used in many clinics because of its easy accessibility, safety, and inexpensiveness. Ultrasound is one of the best tools for diagnosing and determining treatment efficacy on breast cancer-related lymphedema (BCRL).

This study utilized ultrasonography for diagnosis and follow-up tests to confirm treatment efficacy of Progressive Resistance Exercise (PRE) in breast cancer-related lymphedema (BCRL). Ultrasonography can be applied effectively to ensure diagnosis and treatment of lymphedema.

乳がん関連リンパ浮腫の超音波評価

Lymphedema is one of the most common complications after breast cancer surgery. There are many diagnostic tools for lymphedema, but no standard method yet ...

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

破骨細胞形成乳房癌細胞と共培養末梢血単球からの人間の前臨床モデルの開発

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

The Application of 1% Methylene Blue Dye As a Single Technique in Breast Cancer Sentinel Node Biopsy

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery (BCS), a separate incision in the lower axilla hairline was made to find the sentinel nodes (SNs). In mastectomy, the SNs were identified through the same mastectomy incision. The SNs were described as blue nodes or nodes with lymphatic blue channels. An anatomical landmark in the axilla was used to facilitate SNs identification. The SNs metastases were evaluated by intraoperative frozen section analysis and histopathology examination as it is a gold standard. Here, we described the MBD as the lone technique in breast cancer sentinel node biopsy (SNB) which could be useful when radioisotope tracer or patent or isosulfan blue dye (PBD) cannot be provided.

In Indonesia, sentinel node biopsy (SNB) is not routinely performed for breast cancer surgery because of the limitation to provide radioisotope tracer and isosulfan or patent blue dye (PBD). To overcome this obstacle, we applied 1% methylene blue dye (MBD) as a single agent to map the sentinel nodes (SNs).

乳癌センチネルノード生検における単一の技術としての1%メチレン色素の応用

In this study, we injected 1% methylene blue dye (MBD) into the subareolar or peritumoral space of the breast. In the case of breast conserving surgery ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mice Mammary Fat Pad

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, xenografts, genetic manipulation, chemical reagents induction, etc.) have various pathological characters and play important roles in investigating certain aspects of diseases. Although no single model can totally mimic the whole human disease progression, orthotopic organs disease models with a proper stromal environment play an irreplaceable role in understanding diseases and screening for potential drugs. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and follow the metastasis to distant organs. With the proper features of primary tumor growth, breast and nipple pathological changes, and a high occurrence of other organs&#39; metastasis, this model maximumly mimics human breast cancer progression. Primary tumor growth in situ, long-distant metastasis, and the tumor microenvironment of breast cancer can be investigated by using this model.

Here, we present a protocol to implant breast cancer cells into the mammary fat pad in a simple, less invasive, and easy-to-handle way, and this mouse orthotopic breast cancer model with a proper mammary fat pad environment can be used to investigate various aspects of cancer.

マウス乳腺の脂肪パッドに乳癌細胞の同所性同種注入

A proper animal model is crucial for a better understanding of diseases. Animal models established by different methods (subcutaneous injections, ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

婦人科腫瘍および乳がん腫瘍から癌幹細胞球体を取得する

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less aggressive breast tumors, the 5-year survival rate of TNBC patients is 77% due to their characteristic drug-resistant phenotype and metastatic burden. Toward this end, murine models have been established aimed at identifying novel therapeutic strategies limiting TNBC tumor growth and metastatic spread. This work describes a practical guide for the TNBC orthotopic model where MDA-MB-231 breast cancer cells suspended in a basement membrane matrix are implanted in the fourth mammary fat pad, which closely mimics the cancer cell behavior in humans. Measurement of tumors by caliper, lung metastasis assessment via in vivo and ex vivo imaging, and molecular detection are discussed. This model provides an excellent platform to study therapeutic efficacy and is especially suitable for the study of the interaction between the primary tumor and distal metastatic sites.

This work presets an advanced protocol to accurately assess tumor loading by detection of green fluorescent protein and bioluminescence signals as well as the integration of quantitative molecular detection technique.

交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Modeling Breast Cancer in Human Breast Tissue using a Microphysiological System

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs fail clinical trials. Therefore, new models are needed to improve our understanding of the disease. The NIH Microphysiological Systems (MPS) program was developed to improve the clinical translation of basic science discoveries and promising new therapeutic strategies. Here we present a method for generating MPS for breast cancers (BC-MPS). This model adapts a previously described approach of culturing primary human white adipose tissue (WAT) by sandwiching WAT between adipose-derived stem cell sheets (ASC)s. Novel aspects of our BC-MPS include seeding BC cells into non-diseased human breast tissue (HBT) containing native extracellular matrix, mature adipocytes, resident fibroblasts, and immune cells; and sandwiching the BC-HBT admixture between HBT-derived ASC sheets. The resulting BC-MPS is stable in culture ex vivo for at least 14 days. This model system contains multiple elements of the microenvironment that influence BC including adipocytes, stromal cells, immune cells, and the extracellular matrix. Thus BC-MPS can be used to study the interactions between BC and its microenvironment. 
We demonstrate the advantages of our BC-MPS by studying two BC behaviors known to influence cancer progression and metastasis: 1) BC motility and 2) BC-HBT metabolic crosstalk. While BC motility has previously been demonstrated using intravital imaging, BC-MPS allows for high-resolution time-lapse imaging using fluorescence microscopy over several days. Furthermore, while metabolic crosstalk was previously demonstrated using BC cells and murine pre-adipocytes differentiated into immature adipocytes, our BC-MPS model is the first system to demonstrate this crosstalk between primary human mammary adipocytes and BC cells in vitro.

This protocol describes the construction of an in vitro microphysiological system for studying breast cancer using primary human breast tissue with off the shelf materials.

微小生理学的システムを用いたヒト乳房組織における乳癌のモデル化

Breast cancer (BC) remains a leading cause of death for women. Despite more than $700 million invested in BC research annually, 97% of candidate BC drugs ...

Methods Article

乳癌の前臨床モデルとしての乳房腫瘍の移植性