内因性心臓再生は、複数の細胞タイプが協調して協力して、堅牢な再生応答を取り付ける動的プロセスです。損傷に応答してクリアされた心臓の3D画像を介して再生組織をピアリングすることは、この心臓回生応答を導く細胞ダイナミクスの再構築に役立つ可能性がある。当社のプロトコルは、開発中および再生中に細胞を追跡するように特別に設計されています。
私たちは、クリアリング、染色、イメージング技術を他の臓器タイプに広く適用することに制限はないと予見しています。LAD誘発冠動脈閉塞の場合、まず麻酔薬を用いた1日齢の新生児の外科領域を消毒液で殺菌する。胸部領域で横方向の皮膚切開を行います。
皮膚と筋肉を分離するには、ドレッシング鉗子を使用して皮膚を慎重に持ち上げながら、肋間筋に対してはさみを閉じた位置に軽く押し付けます。第4肋間空間を見つけ、内臓を避けるために注意を払って小さな表面穿刺を行うために小さな鉗子を使用する。鈍い解剖とドレッシング鉗子を使用して、指が腹部の左側に適用されるまで肋間筋の間の領域を広げながら、胸腔から心臓を穏やかに導くためにドレッシング鉗子で開いた肋間空間を保持します。
心臓が抽出されたら、心臓が肋間筋の上に休み、LADを血液のプールが少ない心臓の領域として見つけることができます。心筋梗塞を誘発するには、6-0縫合糸を使用して、動脈を切断することなく、血管の周りに正方形の結び目を2回しっかりと結びます。頂点でのブランチングは、直ちに観察する必要があります。
同様の梗塞サイズのために、LADに沿った縫合線配置に一貫性を保ることが重要です。これは、血液がまだ動脈を流れている間に心臓に素早くアクセスすることによって達成されるのが最善です。縫合糸が置かれたら、心臓が胸腔に戻るようにします。
肋骨の上下のセットを通して6-0の縫合を渡しながら肋骨の上のセットを持ち上げるために鈍い鉗子を使用して1人の外科医と1つの正方形の結び目と一緒に肋骨を縫合する。上部腹部に少量の皮膚接着剤を塗布し、細かい鉗子を使用して、露出した胸部領域の上に下腹部の皮膚を配置します。次に、子犬を加熱パッドに置き、次の動物にライゲーションを行います。
すべての手術が行われたら、暖かく移動した子犬を母親の自宅のケージに戻します。収穫された心臓組織の受動的な明瞭さのために、足の指のピンチに対する応答の欠如を確認した後の21日間の手術後、マウスをsupine位置の清潔な外科領域に置き、テープで手足を固定する。ティッシュ鉗子を使用して、シフォイドプロセスのすぐ下に毛皮をつかみ、胸部の幅にまたがる切開を行います。
胸部の遠位部分と一緒にカットし、側面を露出するxiphoidプロセスを持ち上げるために鉗子を使用します。湾曲した鉗子で横隔膜を取り外し、鼓動心臓がアクセス可能になるまで組織を耳に引っ張ります。湾曲した鉗子を使用してベースの心臓をつかみ、虹彩切りはさみを使用して大根と優れた大静脈を切断します。
心臓が保持された血液をポンプアウトするように、鼓動心臓をPBSのペトリ皿に入れます。心筋梗塞は、LAD結紮の正しい解剖学的配置によって確認することができる。心臓が鼓動を止めたら、残りの血液を排出するために鉗子で器官を静かに絞り、2ミリリットルのPBSを含む使い捨ての2.5ミリリットルのガラスシェルバイアルに標本を移す。
溶液が血液から離れるまで、10分ごとにPBS溶液を変える室温で少なくとも30分間シェーカーの上にバイアルを置きます。PBSが明らかになったら、PBSを2ミリリットルの冷たい4%パラホルムアルデヒドに置き換え、室温で4時間のインキュベーションを行い、続いてシェーカーに10分間の洗浄を3回、洗浄ごとに2ミリリットルの新鮮なPBSを使用します。最後の洗浄後、バイアルに4%アクリルアミドの2ミリリットルを充填し、摂氏4度で一晩インキュベーションを行うために0.5%VA-044溶液を補います。
翌日、バイアルを37°Cのヒートブロックに3時間置きます。重合の終わりに、心臓を新しいガラスシェルバイアルに移し、新鮮なPBSの2ミリリットルで心臓組織を10分間洗浄し、すべてのインキュベーションの終わりにPBSをリフレッシュします。PBSが透明になったら、洗浄液を2ミリリットルのクリア液に交換します。
心臓がはっきりするまで数週間摂氏37度で試料をインキュベートし、2~3日ごとにクリア液をリフレッシュします。臓器が透明になったら、37°Cで24時間インキュベーションのために新鮮なPBSでバイアルを補充する前に実証されているようにシェーカー上のPBSで標本を洗います。翌日、PBSをリムスに置き換え、摂氏37度で24時間インキュベーションします。
インキュベーションの終わりに、組織は完全にクリアされます。組織は数週間後に透明になるはずです。心筋梗塞誘導後にクリアされた出生後マウス心臓の画像処理のために、カスタムメイドのうつ病スライドのチャンバーの半分をPBSで満たし、曲がった鉗子を使用してクリアされた心臓をチャンバーに慎重に移します。
チャンバーの残りの容積をPBSで満たします。次に、液体の表面がチャンバの上部の上にドームを形成するまでPBSでチャンバーを充填し、標準的なイメージングプロトコルに従って共焦点顕微鏡で組織をイメージングする前にカバースライドを取り付けます。穿刺と鈍い解剖が胸骨に近すぎると、心臓が胸腔から出ることができない可能性があります。
心臓が空洞から出てこない場合は、左腹部に圧力をかけ、プロセスを容易にします。合併症は、肋間筋に心臓を休ませることから起こり得る。したがって、LADの明確な可視化とアクセシビリティを可能にするために、鈍い解剖を水平方向の最小サイズに保つことが重要です。
表面的な結紮は、最終的な縫合位置で調整する余地が少なく、LADの周りの縫合線は制御された安定した動きで行われるべきであることに注意してください。クリアリングステップの終わりまでに、心臓全体が一貫して中心に変色を伴わない不透明でなければなりません。室温でRIMS溶液で数日後、心臓は完全にクリアされ、いくつかの組織の膨張が観察される可能性があります。
tdTomatoレポータータンパク質発現により観察されるように、心神経は主に外心層に存在する一部の集団と表面的である。重要なことに、レポータータンパク質発現確認は、示されるように明瞭なプロトコルを受けた後に保存される。3D心臓をクリアしてイメージングすると、心臓細胞集団の位置と形態に関する視点が提供されます。
これにより、細胞パターニングや細胞間相互作用の新たな側面を特定することができます。
