脳への薬物送達は依然として課題でした。脳への送達を改善するための新しいナノ材料の大きなパネルの開発は、前臨床アッセイの枠組みで脳の浸透を予測するための実際のin vitroマイクロシステムの必要性を浮き彫りにしています。この技術の主な利点は、血液脳関門の遊離疼痛細胞アクセルアクチュアルを同じシステム内で氷結させ、血液脳関門表現型の誘導に必要な細胞細胞通信を可能にすることである。
さらに、各細胞タイプを別々に分離して、さらなる分子分析を行うことができます。このモデルは、健康および病理学的条件での広範な実験に使用でき、分子および粒子輸送、ならびに細胞間および細胞内輸送の前臨床評価のための貴重なツールとなります。手順を実演するのは、クレマンス・デリーニュ博士とエレオノーラ・リッツィ博士です。
500マイクロリットルの2マイクログラム/平方センチメートルのPoly-L-リジン溶液でウェルをコーディングすることから始めます。摂氏37度で一晩または最低1時間インキュベートし、吸引システムに接続されたガラスピペットでPoly-L-リジン溶液を慎重に除去します。その後、滅菌水で2回すすいでください。
星状細胞を収集するには、まず10ミリリットルの温かい1X PBS CMFで星状細胞を1回洗浄します。10ミリリットルの温かい20%トリプシンEDTA溶液で、5%二酸化炭素と21%酸素の下で摂氏37度で3分間インキュベートします。細胞をフラスコから機械的に切り離し、懸濁液を5ミリリットルの温かい希釈されていないFCSを含む円錐形のチューブに移します。
懸濁液を190倍Gで摂氏20度で5分間遠心分離する。細胞ペレットを5ミリリットルの温かい星状細胞培地に再懸濁し、次に20マイクロリットルの細胞懸濁液を80マイクロリットルの1X PBS CMFで希釈します。顕微鏡下で手動計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。
1平方センチメートルあたり約40, 000細胞を、1.5ミリリットルの温かい星状細胞培地の容量でよく事前にコードした各Poly-L-リジンにプレートします。元に戻したインサートフィルターを高さ25mmのカバー付き皿の周囲に置き、250マイクロリットルのコラーゲンタイプ1溶液をインサートフィルターに加えます。室温で1時間インキュベートします。
次に、吸引システムに接続されたガラスピペットでコラーゲンタイプ1溶液を慎重に除去します。室温で250マイクロリットルのDMEM高グルコースで2回洗浄し、インサートフィルターからすべての溶液を慎重に取り除きます。周皮細胞を10ミリリットルの温かい1X PBS CMFで2回洗浄し、2ミリリットルの温かいトリプシンで細胞をインキュベートします。
顕微鏡下で細胞を観察し、トリプシンの作用を監視します。細胞が剥離し始めたら、トリプシンを除去し、5ミリリットルの温かい内皮細胞基礎培地またはECMを細胞に加え、機械的解離を開始します。20マイクロリットルの細胞懸濁液を80マイクロリットルの1X PBS CMFで希釈し、前に示したように顕微鏡下で手動計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。
事前にコードされた元に戻されたインサートフィルターに250マイクロリットルの容量でセンチメートル四方あたり44, 500セルを播種します。インサートフィルターを加湿インキュベーターに入れ、摂氏37度で5%の二酸化炭素と21%の酸素の下で3時間保管します。滅菌ピンセットを使用して、インサートフィルターをウェルあたり1.5ミリリットルの温かいECMを含む12ウェルプレートに慎重に戻します。
これで、インサートフィルターを反対側にコーティングする準備が整いました。上側とインサートフィルターを500マイクロリットルの細胞外マトリックスベースのヒドロゲルでコーティングします。インサートフィルターを加湿インキュベーターに入れ、摂氏37度、二酸化炭素5%、酸素21%下で1時間放置します。
室温で500マイクロリットルのDMEM高グルコースで一度洗浄します。内皮細胞培養液を10ミリリットルの温かい1X PBS CMFで1回洗浄し、2ミリリットルの温かいトリプシンで細胞をインキュベートします。細胞が剥離し始めたらトリプシンを除去し、5ミリリットルの温かいECMを加えて機械的解離を開始します。
20マイクロリットルの細胞懸濁液を80マイクロリットルの1X PBS CMFで希釈し、手動計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。内皮細胞を、事前にコードされたインサートフィルター上に71, 500細胞/センチメートル四方の密度で、500マイクロリットルの温かいECMで播種します。アストロサイト培地をウェルあたり1.5ミリリットルの温かいECMと交換します。
次に、播種したインサートフィルターをアストロサイトを含むウェルに移します。三培養細胞系を、5%の二酸化炭素と21%の酸素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターに入れます。吸引システムに接続されたガラスピペットを使用して、上部と下部のコンパートメントから培地を慎重に取り出します。
培地を、上部コンパートメントで500マイクロリットル、下部コンパートメントで1.5ミリリットルの容量の温かいECMと交換します。同じ手順を繰り返して、6日目まで1日おきに培地を更新します。最後に、細胞を5%の二酸化炭素と21%の酸素の下で摂氏37度の加湿インキュベーターに戻します。
免疫細胞化学データは、周皮細胞については血小板由来成長因子受容体βおよびデスミン、アストロサイトについてはグリア原線維酸性タンパク質などの従来のマーカーの発現を確認した。したがって、周皮細胞および星状細胞との6日間の培養後、Ve-Cadherinの接着接合染色で視覚化された脳様内皮細胞またはBLECの単層は、細胞境界におけるTJタンパク質CLD5およびZ-01の連続的な局在を示す。蛍光BBB完全性マーカー、フルオレセインナトリウムおよびFITCデキストランに対するBLECSの傍細胞透過性をここに示す。
BLECにおけるR123細胞内蓄積は、排出ポンプ阻害剤Elacrdarの存在が、その不在の対照条件と比較して有意な増加を示した。これは、BLECに活性排出ポンプ分子、すなわちP糖タンパク質および乳がん耐性タンパク質またはBCRPが存在することを示しています。ここでは、RPLP0の発現によって正規化されたタイトジャンクションタンパク質、トランスポーター、および高分子受容体の遺伝子発現を示します。
ここで、1より大きい値は、三重培養モデルにおけるより高い遺伝子発現に対応する。赤い線は、2つのモデルの発現レベルが同等である1の値に対応します。代表的な画像は、タイトジャンクションタンパク質、トランスポーター、ベータアクチンの発現によって正規化された大分子受容体におけるタンパク質レベルを示す。
蛍光タグ付きNIPAMベースの中性ポリマーナノゲルの輸送を評価した。時間ゼロにおいて、ポリマーナノゲルを1ミリリットル当たり0.1ミリグラムの濃度で管腔区画に入れた。24時間のインキュベーション後、ポリマーナノゲルの5.82%がアブミナルコンパートメントに見つかり、BLECを通過する能力が証明されました。
元に戻されたフィルター上の周皮細胞の正しいコーティングと播種は極めて重要です。重要なのは、細胞培養システムの汚染を避けるために、構造の無菌性と完全性を維持することです。
