このプロトコルは、多数の培養研究を調査し、直接細胞コミュニケーションを調査するための新しいツールを提供するために使用できます。この新しいデバイスは、培養モデルの確立にかかる時間を大幅に節約し、特定のコーティングを必要とするかどうかにかかわらず、さまざまな細胞タイプに適用できます。実際、3Dプリントされたインサートの4つのコンパートメントにより、異なる細胞タイプを単層で、または異なる組み合わせで同じ方法で3Dで培養することができます。
3Dプリントされたインサートは、より耐久性、柔軟性、拡張性があり、免疫学やアンドロジェネシスなどの生理病理学の研究のための実験モデルの設計に使用できます。まず、製造元の指示に従って、10%エタノール滅菌スパチュラを使用して、キットに付属の70つの成分、食品シリコン、および触媒を70:70の比率で混合します。ピンセットでシリコーンミックスにインサートを適用し、混合物がインサートの下端に均一に分布するようにします。
インサートを6ウェルプレートのウェルに入れ、細胞培養培地の漏れを防ぐために、インサートがプレートに密着するように穏やかな圧力をかけます。プレートを摂氏37度にして、シリコンの凝固プロセスを1時間サポートします。固化後、プレートを70%エタノール浴に30分から1時間浸して、インサートで滅菌します。
次に、ピペッティングによってアルコールを捨て、細胞培養フードでプレートを一晩乾燥させます。外根鞘のケラチノサイトおよびヒト皮膚微小血管内皮細胞を培養するには、フラスコから培地を捨て、5ミリリットルのトリプシンを加えて細胞を剥離する。外根鞘のケラチノサイトを入れたフラスコを摂氏37度で5%二酸化炭素で5分間置き、ヒト皮膚微小血管内皮細胞を入れたフラスコを室温で5分間インキュベートします。
15ミリリットルの滅菌コニカルチューブ内で、外根鞘のケラチノサイトを含むトリプシン溶液を、5%FBSおよび成長因子を添加した5ミリリットルの間葉系幹細胞培地と混合し、ヒト皮膚微小血管内皮細胞を5%FBSおよび成長因子を添加した5ミリリットルの内皮細胞培地と混合する。外根鞘のケラチノサイトおよびヒト皮膚微小血管内皮細胞懸濁液を200Gで室温で5分間遠心分離する。上清を捨てた後、細胞をそれぞれの培地の2ミリリットルに再懸濁します。
10マイクロリットルの細胞懸濁液を10マイクロリットルのトリパンブルー色素と混合し、10マイクロリットルの混合物を計数スライドのチャンバーに加える。カウントスライドをセルカウントシステムに挿入し、細胞数と生存率を検出します。それぞれの培地中に1ミリリットル当たり50, 000細胞の濃度で細胞懸濁液を調製した後、800マイクロリットル〜1ミリリットルの細胞懸濁液を個々の大きな区画に、そして100〜150マイクロリットルをピペットで個々の小さな区画に分配する。
5%FBSと成長因子を添加した間葉系幹細胞培地中のケラチノサイトと、内皮細胞培地中のヒト皮膚微小血管内皮細胞、5%FBSおよび成長因子を添加した小コンパートメントおよびその他の大きなコンパートメントを参照してください。細胞培養プレートを5%二酸化炭素を含む摂氏37度で、または通常の条件下で置き、細胞の接着および/または成熟を可能にします。ピペットを使用して、インサートの異なるコンパートメントの培地を空にします。
次に、大きなコンパートメントで摂氏37度の温かいPBSを1ミリリットル、小さなコンパートメントで200マイクロリットルの細胞をすすぎます。すべての細胞タイプに適合するように選択された3ミリリットルの共通培地を追加します。共培養を含むプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で24〜48時間置きます。
細胞懸濁計数のためにトリプシンを使用して細胞を剥離し、トリパンブルー染色を使用して生存率を確認します。形態を観察した後、インキュベーションの24〜48時間後に光学顕微鏡下で実験中に異なる区画の細胞数をカウントする。まず、実験の最後に6ウェルプレートからインサートを少しひねって取り外し、次にシリコンをインサートから引き抜いて取り外します。
従来の細胞培養用洗剤と洗浄剤でインサートを洗浄します。次に、オートクレーブで将来使用するために、または70%エタノール浴に1時間浸して、インサートを滅菌します。表現型と細胞生存率を比較し、6つのウェルプレートのウェルで90%の生存率が観察され、外根鞘のケラチノサイトの3Dプリントインサートで91%が観察されました。
ヒト皮膚微小血管内皮細胞の生存率は、6ウェルプレートのウェルで85%であったのに対し、3Dプリントインサートでは86%でした。3Dプリントされたインサート内のケラチノサイトと内皮細胞間の間接的な細胞コミュニケーションは、インサートにケラチノサイトが存在する場合、ヒト皮膚微小血管内皮細胞の増殖が対照と比較して24時間後に1.5倍、48時間後に3.1倍に有意に増加したことを示しました。しかし、外根鞘条件培地のケラチノサイトは、ヒト皮膚微小血管内皮細胞の増殖を24時間後に1.5倍、48時間後に2.1倍に有意に増加させることが示された。
3Dプリントされたインサート共培養モデルを試験して、ヒト皮膚微小血管内皮細胞遊走に対するケラチノサイトの影響を決定した。対照条件では、内皮細胞が遊走し、24時間後に創傷領域の約44%を覆った。ケラチノサイトの存在下では、ヒト皮膚微小血管内皮細胞遊走の有意な増加が観察され、これは創傷領域の43%67%および99%がそれぞれ3時間、12時間および24時間後に覆われたことを示している。
同様に、HDMECsの移動は、外根鞘条件培地のケラチノサイトの存在下で増加する。ある区画から別の区画への細胞の培地の漏れを防ぐために、プレートへのインサートのシールを確実にすることが重要です。増殖、遊走、鎮静形成アッセイDNA、RNA、タンパク質、その他の分析など、いくつかのアプリケーションを行うことができます。
