המחברים מבקשים להודות לננדיני נאלאפן ולשרון יאו על סיועם בצעדים הטכניים. המחקר מומן על ידי מענק סטארט-אפ ל- KGC מבית הספר לרפואה של לי קונג צ&#39;יאן, אוניברסיטת נניאנג טכנולוגית ועל ידי פרס מדען בכיר של המועצה הלאומית למחקר רפואי במשרד הבריאות של סינגפור (NMRC) ל- LT (NMRC / CSA / 045/2012) ועל ידי מענק מן NMRC ו מנוהל על ידי המרכז הלאומי לחדשנות בריאות כדי KGC ו LT (NHIC-12D-1409007).

כל הדגימות העין ששימשו במחקר זה נאספו מהמכון לבריאות העין במרכז הסינגפור הלאומי Eye Eye אושרה על-ידי המועצה המרכזית לבדיקות מוסדיות של סינגה-אינל (NH). הערה: נבדקים עברו בדיקות קליניות על מנת להעריך את מידת הדלקת ואת חומרת התפקוד לקוי לפני ביצוע IC. המבחנים הקליניים כללו, בין היתר, בדיקות לאבחון פולשני לא-פולשני (NI-TBUT), 14 ו- Redmology (hyperemia) 15 , 16 שהוערכו באמצעות מכשיר אבחון, בדיקה של Schirmer 17 , בדיקת החולה הסטנדרטית של שאלת יובש העין (SPEED) 18 וקרנית מכתים 19 . 1. אוסף של דוגמאות עיניים על ידי IC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קביעת הסטטוס הקליני, להרדיםהעיניים של המשתתף על ידי יישום 1 - 2 טיפות של הרדמה מקומית, proparacaine hydrochloride, כדי הלחמית בולב מעולה נחות. המתן 4 - 5 דקות עבור תחושת עקצוץ של ההרדמה ללבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דגימות משני הלחמית האף הזמני ואת הזרוע עם שני התקני cytology הופעה. הערה: מכשיר אחד משמש לאיסוף שני דגימות רושם. כאן, שני מכשירים שימשו אוסף של ארבעה קרום הופעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום מכשיר cytology הרושם משיק על הלחמית. לחץ על לחצן הדחיפה בעדינות והחזק ל 2 - 3 שניות. הערה: ההתקן מגיע עם הממברנה. הלחץ משוחרר באופן אוטומטי לאחר לחיצה על הכפתור. זה לוקח רק כמה שניות כדי לשחרר את הלחץ להסיר את המכשיר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את הממברנה לתוך צינור microcentrifuge המכיל 1 מ&quot;ל של התקשורת בתקשורת (Roswell Park Memorial Institute בינוני (RPMI) + 10% בסרום שור עוברית(FBS) + 1% פניצילין סטרפטומיצין (עט דלקת)) על ידי איזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לבודד מן הממברנה של המכשיר על ידי שריטות רציפה במשך כ 1 דקות עם עצה 10 פיפטה μL. הערה: גירוד הושלמה כאשר פני השטח של הממברנה הופך אחיד. מספרי התא מכל קרום הוא משתנה (100 - 500 תאים / קרום). תהליך דגימות בתוך 2 - 3 שעות של אוסף. </li></ol> 2. תאים Immunophenotyping ידי cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את התקשורת. Resuspend תא גלולה עם μL 50 של cytometry חיץ מכתים זרימה (פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) + 0.05% אלבומין בסרום שור (BSA)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים של כתם עם פאנל של נוגדנים ( למשל , CD3 מבריק violet (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanine-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 phycoerythrin (PE) -A, CD45RO PE- ציאנין 7 (PE- Cy7) -A, ו חי / מת סימן נייד 7-ADD) בטמפרטורת החדר למשך 20 - 30 דקות באפל. השתמש נוגדנים ישירות מהמלאי על פי פרוטוקול של היצרן. הערה: עבור ריכוז הנוגדן, השתמש 2.5 μL של CD3-BV510, 1.25 μL של CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD ו 10 μL של CCR7-PE. השתמש בתאי mononuclear דם היקפיים (PBMCs) כדי טיטרציה ריכוזים שונים של נוגדנים. עבור טיטרציה, לקחת את הריכוז נוגדנים המוזכרים בפרוטוקול של היצרן ולהשתמש חצי ורבע הריכוז המומלץ. השתמש ריכוז מינימלי של נוגדנים כדי למנוע-לשפוך על ערוצי fluorochrome אחרים. אותות ברורים נצפו עם הריכוזים הנ&quot;ל של נוגדנים. הפיצוי בוצע על ידי בדיקות PBMCs בתחילה על פי הפרוטוקול שהוזכר ויליאמס et al . 20 לבדיקות, PBMCs הודגרו עם אותה קבוצה של נוגדנים בשימוש כאן פיצוי על ידי השוואת כתמי נוגדנים בודדים מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה periעוד, להוסיף 1 מ&quot;ל של חיץ מכתים לצינור, לערבב היטב, צנטריפוגה ב XG 450 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. תאים Resuspend μL 200 של חיץ מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דוגמאות על מכונת cytometry זרימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני רכישת הנתונים, לכייל את המתח זרימת cytometer ערוץ עם הגדרת cytometer ומעקב (CS &amp; T) חרוזים לנרמל את רכישת הנתונים על ימים שונים לפי ההוראות של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את זרימת cytometry נתונים אוסף תוכנה, לחץ על &quot;הגדר &amp; QC&quot; כפתור, לבחור את הנכון CS &amp; T חרוז מספר רב, לטעון את החרוזים, ולאחר מכן לחץ על כפתור &quot;התחל&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים על ידי הקשה עדינה על הצינור לפני טעינת דגימות למכונה. פתח את תוכנת איסוף הנתונים ולחץ על &quot;תצוגה מקדימה&quot;. כאשר קצב הסף יציב, לחץ על &quot;רכש&quot;. צג רמת המדגם ולחץ על &quot;עצור&quot; כאשר דגימות נגמרים. הערה: רכישת 10,000 אירועים לכל מדגם. </lI <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רכישת 10,000 אירועים, ליצור SSC-A ו FSC-A נקודה העלילה בגליון העבודה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &quot;מצולע שער&quot; וצייר שער (זה P1) על כל האירועים עם ערך FSC-A&gt; 5 x 10 4 כדי להוציא פסולת. לחץ על &quot;יצירת נקודה עלילה&quot; כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר &quot;מאפיינים&quot; כדי לפתוח את &quot;עורך מגרש&quot;, ולאחר מכן לבחור &quot;P1&quot;. לחץ על FSC-A על ציר ה- X של מגרש P1 נקודה, לשנות את זה ל- CD3-BV510. צייר &#39;&#39; שער מצולע &#39;&#39; כדי לבחור את האוכלוסייה + CD3 בשם &#39;P2&#39; &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;יצירת נקודה עלילה&quot; כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר &quot;מאפיינים&quot; כדי לפתוח את &quot;עורך מגרש&quot; חלון. לחץ על FSC-A על ציר ה- X של מגרש P2 נקודה ולשנות אותו ל -7 AAD. צייר &#39;&#39; שער מצולע &#39;&#39; עבור 7-AAD - האוכלוסייה ובחר &#39;&#39; P3 &#39;&#39;. P3 כאן הוא CD3 +תאים חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;יצירת נקודה עלילה&quot; כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר &quot;מאפיינים&quot; כדי לפתוח את &quot;עורך מגרש&quot; חלון. לחץ על CD3-BV510 על ציר x ו- CD4-APCH7 על ציר y של מגרש נקודה P3. צייר שערי מלבן על החלק העליון והתחתון של הרבע ובחר &#39;P4&#39; ו- &#39;P5&#39; בהתאמה. P4 הוא חי CD3 + CD4 + ו P5 הוא חי CD3 + CD4 - T תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;יצירת נקודה עלילה&quot; כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר &quot;מאפיינים&quot; כדי לפתוח את &quot;עורך מגרש&quot; חלון. לחץ על CD45RO PE-Cy7 על ציר x ו- CCR7-PE על ציר ה- y של P4 ו P5 חלקות. צייר &#39;&#39; קוואד שער &#39;&#39; על מגרש זה נקודה. הערה: הצד השמאלי השמאלי העליון, הצד הימני העליון, הצד הימני התחתון בצד שמאל והרביע השמאלי בצד שמאל כאן הם נאיביים, זיכרון מרכזי (T CM ), eזיכרון Ffector (T EM ), זיכרון משפיע מובחן באופן סופי (T EMRA ) תאי T, בהתאמה. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+impression+cytology.">Conjunctival impression cytology.</a> Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).</li><li>Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+conjunctival+biopsy.">A simple conjunctival biopsy.</a> Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).</li><li>Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+dry+eye.">The pathology of dry eye.</a> Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).</li><li>Nelson, J. D., Wright, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+goblet+cell+densities+in+ocular+surface+disease.">Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease.</a> Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).</li><li>Brignole, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Fas-Fas+ligand+antigens+and+apoptotic+marker+APO2.7+by+the+human+conjunctival+epithelium.+Positive+correlation+with+class+II+HLA+DR+expression+in+inflammatory+ocular+surface+disorders.">Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders.</a> Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).</li><li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eye-associated+lymphoid+tissue+in+corneal+immune+protection.">The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection.</a> J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).</li><li>Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Collection+From+Human+Conjunctival+Epithelial+Cells+Obtained+With+a+New+Device+for+Impression+Cytology.">RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology.</a> Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).</li><li>Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+EyePRIM+Device+for+Conjunctival+impression+for+Flow+Cytometry.">Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry.</a> Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).</li><li>Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+in+the+evaluation+of+ocular+surface+tumors:+review+article.">Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article.</a> Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).</li><li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+of+the+ocular+surface:+a+review.">Impression cytology of the ocular surface: a review.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).</li><li>Haller-Schober, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+an+impression+cytology+grading+system+(IC+score)+in+patients+with+dry+eye+syndrome.">Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome.</a> Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).</li><li>Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+of+the+ocular+surface.">Impression cytology of the ocular surface.</a> Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).</li><li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+Neutrophils+Predict+Progressive+Scarring+in+Ocular+Mucous+Membrane+Pemphigoid.">Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).</li><li>Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+of+the+Oculus+Keratograph.">Clinical evaluation of the Oculus Keratograph.</a> Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).</li><li>Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+ocular+bulbar+redness:+a+comparison+of+methods.">Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods.</a> Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).</li><li>Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ocular+Redness+Index:+a+novel+automated+method+for+measuring+ocular+injection.">The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).</li><li>Shapiro, A., Merin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schirmer+test+and+break-up+time+of+tear+film+in+normal+subjects.">Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects.</a> American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).</li><li>Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+OSDI+and+SPEED+questionnaires+for+the+evaluation+of+dry+eye+disease+in+clinical+routine.">Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine.</a> Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).</li><li>Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+tear+syndrome:+a+Delphi+approach+to+treatment+recommendations.">Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations.</a> Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).</li><li>Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+production+and+antigen+recognition+by+human+mucosal+homing+conjunctival+effector+memory+CD8++T+cells.">Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells.</a> Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).</li><li>Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+memory+T+cells+in+the+human+conjunctiva+and+immune+signatures+in+human+dry+eye+disease.">Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease.</a> Sci Rep. 7, 45312 (2017).</li><li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta++T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4++T+cells+increases.">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li><li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis.">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li></ol>

המחברים אינם מכריזים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

זוהי טכניקה קלה, מהירה ופחות פולשנית, שניתן להשתמש בה במרפאות החוץ של המטופלים לצורך איתור פרופיל החיסוני המהיר יחסית לטכניקות הקונבנציונאליות כגון גירוד, ניסור, פיפטינג או נייר סינון סופג 1 , 2 . וריאציה של טכניקה זו כבר בשימוש הגדרות המחקר 22 . היישום העתידי של המתודולוגיה המוצעת הוא עבור ריבוד המטופל בניסויים קליניים עם מחלות עיניים, במיוחד אלו הדורשות אימונופנוטיפינג. האתגר העיקרי עם טכניקה זו היא תאים חיסוניים מעטים יחסית לאחזר לאחר אוסף רושם ו scraping. המספר הכולל של תאי T3 CD3 התאושש מארבע הופעות לכל אדם מגוון מ ~ 500-1000 תאים. דגימות העין נשטפו לפני ניתוח cytometry זרימה עבור מספר מינימלי של פעמים, כדי למנוע אובדן נוסף של התאS. צעדים קריטיים ואתגרים שנותרו בפרוטוקול הם אוסף יעיל של דגימות עיניים וגירוד הנכון של הממברנה כדי להשיג מספרי תאים גבוהים יותר. עם זאת, הגבלה זו אינה צפויה הטיה כלפי כל פנוטיפ החיסונית ספציפי. פתרון הבעיות שבוצע כאן כדי למקסם את התשואה של התאים היה להפחית את מספר צעדים כביסה לאחר הדגירה של נוגדנים. קיימות מגבלות אחרות לשימוש ב- IC. בחולים עם משטח העין הקרטני או קשות, כמו בתסמונת סטיבן ג&#39;ונסון, התשואה הסלולרית עשויה להיות אפילו נמוכה מזו שבמחקר זה. חלקם של תאים החיסון עשוי להשתנות אם הדגימות מאוחסנים במקום לנתח באותו יום. קשה לנבא אם סוגי תאים מסוימים עמידים יותר לאחסון מאשר לאחרים. מחקרים קודמים דיווחו על רמות גבוהות של ביטוי HLA-DR בתאי אפיתל הלחמית 23 , כך שזה יהיה interEsting כדי להעריך את המתאם בין HLA-DR לבין רמות של תאים חיסוניים ספציפיים. תאים חיסוניים עשויים להיות קשורים גם עם רמת הביטוי של chemokines. יש להתייחס לנושאים אלה במחקרים עתידיים.

Cytology ההופעה (IC) בוצעה לראשונה בשנת 1977 על ידי תאצ&#39;ר ואח &#39; . הם השתמשו תקליטור פלסטיק כדי לאסוף תאים conjunctival מחולים במקום טכניקות אחרות הזמינות באותו זמן כגון גירוד, swabbing או pipetting 1 . הטכניקה הנוכחית של IC משתמשת נייר מסנן סופג 2 כדי להטביע את הנורה ואת הלחמית palpebral ולאסוף את השכבה השטחית ביותר של תאים conjunctival. תאים אלה, לאחר שהגיעו לשלב הסופי של ההבחנה שלהם, נשפכים ללא הרף בדמעות 3 . שלוש אוכלוסיות גדולות של תאים נמצאים דגימות IC: תאים אפיתל 4 , גביע תאים 3 , 5 , ואת רירית הלימפוזות הקשורים לימפויז דהינו אפיתל הקשורים המשפיע T תאים או תאים דנדריטים 6 . תאים פנימיים של העין ב- IC SamPles ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופיה, חיסון סופג לאחור transcriptase פולימראז התגובה שרשרת (RT-PCR) 7 . זרימת cytometry שימש לאחרונה כדי לנתח תאים חיסוניים שנאספו על ידי שריטות קרום IC 8 . מעניין, IC 6 , 9 נעשה שימוש כדי להעריך הרבה מחלות פני השטח של העין כולל ceratoconjunctivitis sicca, מחסור בוויטמין A, pemphigoid cicatricial, מחלה atopic, מעולה keratoconctivivivivitis לימבית, דלקת קרטוקונאנגיוויטיס, ו metaplasia קשקשים אפיתל. IC שימש גם כדי להעריך את ההשפעה של עדשות מגע, גילוי חיידקי משטח העין, ובדיקת יעילות טיפולית וסובלנות של התערבויות טיפוליות במחקרים אורכיים 10 , 11 , 12 . המכשיר הרפואי (EyePrim) נתמך על ידי סוג של פוליEthersulfone (PES) 0.2-מיקרומטר קרום, אשר כבר תוקף בעבר עבור הטכניקה של cytology ההופעה העין עם cytometry זרימה (זרימת OSIC) ופותח הזדמנויות להשתמש דגימה אורך כדי לפקח על התקדמות המחלה בתגובה לטיפול ( למשל , מפורט ניתוח של leukocytes intraepithelial שהוגדרו סמנים מחלה משוערת עבור פיברוזיג המפרק פרוגרסיבי ב פמפיגואיזם ממברנה רירית) 13 . חוקרים מוקדמים השתמשו במסנני PES אוטוקלאב הדורשים הופעה ידנית. כתוצאה מכך, התשואה הייתה משתנה ותלויית המשתמש. היתרון של מכשיר רפואי זה הוא קלות שימוש, לחץ סטנדרטי (Pa או N / m 2 ), ומאפשר שחזור, שחזור, והתאוששות סלולרית עקבית. טכניקה זו שימושית במרפאת החוץ כי זה לא כירורגי, קל לביצוע מהיר. זהו מכשיר רפואי מסוג I (סטרילי) לפי ההוראה 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). זה רק דורשS ההרדמה אקטואלי במהלך ההליך, אשר מבטיח שמירה על שלמות של משטח העין. בעקבות IC, תאים ניתן לעבד מיד cytometry הזרימה. יתר על כן, זה אפשרי עבור אופתלמולוגיה טכנאים ואחיות להיות מאומן למדגם את פני העין. למרות השיפור של IC על פני טכניקות אחרות, נותרו מספר אתגרים. לדוגמה, ייתכן שיש וריאציה עקב אזור הדגימה והבדלים אזוריים של הלחמית bulbar בהתאם למיקום של IC. מקור נוסף של וריאציה נובע מיישום של לחצים שונים במהלך IC. בעיות מתודולוגיות אחרות כרוכות בסטנדרטיזציה של עיבוד התאים: אלה כרוכות בשיטה ובשיטה של ​​קיבוע, ובתנאי אחסון אפשריים, העלולים להשפיע על היציבות של החומר שנדגמו. המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לפתח שיטה של ​​בידוד של דגימות הרושם העין thaT הוא קל לשימוש, לא פולשני והוא יכול להיות מיושם על אפיון אימונולוגי של דגימות קליניות.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Local Anaesthesia</td><td>Alcaine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium solution</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Slit lamp BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Softwares&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse analysis software</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva

באופן מסורתי, cytology פני העין נלמד עם טכניקות כגון טכנולוגיית מרית ומברשת הטכנולוגיה. הבעיה עם טכניקות אלה היא שהם עלולים לגרום נגעים טראומטיים על פני העין, אשר יכול להתקדם הצטלקות, עיוות עפעף, חוסר תאי גזע limbal ובמקרים מסוימים, לגרום אי נוחות רבה לנושא. כדי למנוע בעיות קליניות אלו, פיתחה ציטולוגיה של הרושם (IC) לאבחון מחלות עיניים יבשות ומאוחר יותר נאופלזיה, מחלה אטופית, דלקת קרטוקונאנגיוויטיס ורידית וקרטוקו-גונקטיטיס סיקה. בדרך כלל, קלינאים לחתוך ידנית מסננים נייר לתוך צורות הנדרשים וליישם אלה על פני העין. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע IC באמצעות מכשיר רפואי זמין מסחרית. טכניקה זו מוסברת כאן ואחריו immunophenotyping על ידי cytometry הזרימה. טכניקה זו דורשת טיפול ידני פחות גורם פחות פציעה על פני העין.

IC על ידי מכשיר קליני זה אפשרה לנו לבודד את תאי החיסון של פני העין, תוך שמירה על פני העין ללא פגע. איור 1 מתאר כיצד בוצע ה- IC. האתרים השונים של העין ממקום איסוף הדגימות מסומנים. איור 2 מציג תוצאה נציג של cytometry הזרימה שנאספו 10 פקדים בריאים. עבור gating, להשתמש SSC ו 7-AAD להבחין בין תאים חיים מתים. 7-AAD - תאים מזוהים כתאים חיים. תאים חיים אלה מאופיינים עוד יותר על ידי CD3 + ו CD4 + סמנים. יתר על כן, CD4 + ו CD4 - אוכלוסיות היו כל עוד מאופיינים כמו Naïve, T EM , T CM ו T EMRA עם CCR7 ו CD45RO סמנים. בין תאי CD3 + T, זיכרון T ממריץ תאים שולטים על פני העין האנושית. בXperiments, זה הוכח גם כי תאים CD8 + זיכרון הם האוכלוסיות העיקריות בתאי T אפיתל T בציבור בקרב אנשים בריאים 20 . איור 3 מראה כי CD4 + ו CD8 + זיכרון זיכרון תאים T (T EM ו- T EMRA ) הם המשנה העיקרית של פני העין האנושית ב -10 בקרות בריא למד. כל האוכלוסייה שהוזכרו בדמות מקבלים הודעה עם הפנוטיפ שלהם ואת השמות שלהם (נאיבי, T CM , T EM , T EMRA ). המספרים באדום מציינים את אחוז האוכלוסייה. הנתונים בנתון זה מיוצגים כ- ± SEM ממוצע <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> איור 1: אוסף של דגימות IC מן משטח העין על ידי מכשיר cytology ההופעה. דוגמאות נאספו מהנורה הזמניתבאזור ar כמוצג. <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> איור 2: תרשים גרף נקודה באמצעות cytometry זרימה. Live 7-AAD - תאים נבחרו. תאי ה- CD3 + היו נשלטים תחילה, ואז אוכלוסייה זו נשלטה לתוך תת-מערכות CD4 + ו- CD4. הפרופורציות של נאיבי (CCR7 + CD45RO - ), זיכרון מרכזי (CCR7 + CD45RO + ) וזיכרון זיכרון (CCR7 - CD45RO +) ; CCR7 - CD45RO - ) תת קבוצות נקבעה בעזרת CCR7 ו CD45RO סמנים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FIgure 3: תאים חיסוניים תת סוגי CD4 + ו CD8 + T תאים של פני אדם בריאים אנושיים. התפלגות CD4 + ו CD8 + זיכרון נאיבי, זיכרון מרכזי (T CM ), וזיכרון זיכרון (T EM ו- T EMRA ) תת שולט בבקרות אנושיות בריאים; כל נקודת נתונים מייצג יחיד בודדת מתכוון ± SEM מוצג. אחוז האוכלוסייה מסומן באדום מתחת לשמה של כל אחת מהאוכלוסיות. האחוז הכולל של האוכלוסייה הוא 98%, משום שאוכלוסיית CD4 + T EMRA לא נכללה במפזר הנ&quot;ל (שונה מ- Bose et al 21 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva at JoVE.com

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

משטח העין הרגיל שנחשף מורכב קרנית ו הלחמית. תאי אפיתל, תאי גביע ותאי חיסון נמצאים בחניך. הנה, לא פולשנית, טכניקה של cytology הופעת מתואר באמצעות מכשיר cytology הרושם cytometry זרימה לנתח את תאי החיסון ב הלחמית.

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

a-non-invasive-way-to-isolate-and-phenotype-cells-from-the-conjunctiva

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K Views.  Nanyang Technological University.  משטח העין הרגיל שנחשף מורכב קרנית ו הלחמית. תאי אפיתל, תאי גביע ותאי חיסון נמצאים בחניך. הנה, לא פולשנית, טכניקה של cytology הופעת מתואר באמצעות מכשיר cytology הרושם cytometry זרימה לנתח את תאי החיסון ב הלחמית. 

Video: A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Bioengineering

Impression Cytology of the Lid Wiper Area

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.

We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.

ציטולוגיה רושם של פינת מגב ומכסה

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The ...

Medicine

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

בידוד וזיהוי הלחמית בעכברים

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular surface gland network. Meibomian glands (MG) secrete lipids that create a covering layer that prevents the evaporation of the aqueous part of the tear film. Neutrophils and extracellular DNA traps populate MG and the ocular surface in a mouse model of allergic eye disease. Aggregated neutrophil extracellular traps (aggNETs) formulate a mesh-like matrix composed of extracellular chromatin that occludes MG outlets and conditions MG dysfunction. Here, a method for inducing ocular surface inflammation and MG dysfunction is presented. The procedures for collecting organs related to the ocular surface, such as the cornea, conjunctiva, and eyelids, are described in detail. Using established techniques for processing each organ, the major morphological and histopathological features of MG dysfunction are also shown. Ocular exudates offer the opportunity to assess the inflammatory state of the ocular surface. These procedures enable the investigation of topical and systemic anti-inflammatory interventions at the preclinical level.

Ocular surface inflammation harms the ocular surface tissues and compromises vital functions of the eye. The present protocol describes a method to induce ocular inflammation and collect compromised tissues in a mouse model of Meibomian gland dysfunction (MGD).

אינדוקציה של דלקת פני השטח של העין ואיסוף של רקמות מעורבות

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular ...

פרוטוקול לבידוד, תרבית וזיהוי תאי נישה לימבליים אנושיים

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used for LNCs isolation. The tissue was divided into 12 pieces under aseptic conditions and digested for 18 h at 37 &#176;C in the cell culture incubator using collagenase A to obtain cell clusters with LNCs and limbal&#160;epithelial progenitor cells. The cell clusters were further digested for 15 min at 37 &#176;C using 0.25% trypsin-EDTA to obtain single cells and then cultured in modified embryonic stem cell medium (MESCM) on a plastic surface coated with 5% Matrigel. Cells were passaged upon 70% confluence, and LNCs were identified using immunofluorescence, real-time quantitative PCR (qPCR), and flow cytometry. Primary LNCs were isolated and passaged more than 12 times. The proliferation activity of LNCs from P4 to P6 was the highest. LNCs expressed higher stem cell markers than BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, and PDGFR&#946;). Furthermore, results showed that P4 LNCs uniformly expressed VIM, CD90, CD105, and PDGFR&#946;, but not Pan-CK, which could be used as a marker for the identification of LNCs. Flow cytometric analysis showed that approximately 95%, 97%, 92%, and 11% of LNCs expressed CD73, CD90, CD105, and SCF respectively, while they were&#160;68%, 99%, 20%, and 3% in&#160;BMMSCs. The standard process for LNC&#160;isolation and identification could provide&#160;a reliable laboratory basis for the widespread use of LNCs.

Author Spotlight: Standardizing Limbal Niche Cell (LNC) בידוד ואפיון לתמיכה במחקר LNC נרחב 

Here, we present a protocol to isolate and identify the human limbal niche cells.

בידוד וזיהוי תאי נישה לימבליים

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

בידוד של גלגל שלם כדי להשיג רקמת פני השטח העינית אינטגרלי לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Biology

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin that is secreted by conjunctival goblet cells (CGCs) onto the ocular surface contributes to multiple ocular surface diseases. The elimination of exogenous sex hormones is essential to obtain consistent results during in vitro study of sex-based differences in CGCs. This paper describes a method to minimize the presence of exogenous hormones in the study of sex-based differences in CGCs while maintaining their physiological function. CGCs from postmortem human donors of both sexes were cultured from pieces of the conjunctiva in RPMI medium with 10% fetal bovine serum (FBS) (referred to as the complete medium) until confluency. Nearly 48 h before the start of the experiments, CGCs were transferred to RPMI medium without phenol red or FBS but with 1% BSA (referred to as phenol-red-free medium). The normal cellular function was studied by measuring the increase in intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) after carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulation using fura 2/acetoxymethyl (AM) microscopy. The result shows that CGCs maintained normal function in the phenol-red-free media after 48 h. No significant difference in [Ca2+]i response was observed between phenol red-free RPMI medium and complete medium upon Cch stimulation. Therefore, we recommend using the phenol-red free RPMI medium with 1% BSA to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of CGCs in the study of sex-based differences.

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Phenol red-free/fetal bovine serum-free medium is a better option than advanced RPMI to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of conjunctival goblet cells in the study of sex-based differences.

במבחנה שיטה לחקר הבדלים מבוססי מין בתאי גביע הלחמית

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin ...

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי

בידוד של תאים ראשיים Murine הרשתית גנגליון (RGCs) על ידי זרימת cytometry

ציטולוגיה רושם של פינת מגב ומכסה

בידוד וזיהוי הלחמית בעכברים

אינדוקציה של דלקת פני השטח של העין ואיסוף של רקמות מעורבות

בידוד וזיהוי תאי נישה לימבליים

בידוד וזיהוי תאי נישה לימבליים

בידוד וזיהוי תאי נישה לימבליים

בידוד של גלגל שלם כדי להשיג רקמת פני השטח העינית אינטגרלי לבדיקה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה

במבחנה שיטה לחקר הבדלים מבוססי מין בתאי גביע הלחמית