המחברים מבקשים להודות לננדיני נאלאפן ולשרון יאו על סיועם בצעדים הטכניים. המחקר מומן על ידי מענק סטארט-אפ ל- KGC מבית הספר לרפואה של לי קונג צ&#39;יאן, אוניברסיטת נניאנג טכנולוגית ועל ידי פרס מדען בכיר של המועצה הלאומית למחקר רפואי במשרד הבריאות של סינגפור (NMRC) ל- LT (NMRC / CSA / 045/2012) ועל ידי מענק מן NMRC ו מנוהל על ידי המרכז הלאומי לחדשנות בריאות כדי KGC ו LT (NHIC-12D-1409007).

כל הדגימות העין ששימשו במחקר זה נאספו מהמכון לבריאות העין במרכז הסינגפור הלאומי Eye Eye אושרה על-ידי המועצה המרכזית לבדיקות מוסדיות של סינגה-אינל (NH). הערה: נבדקים עברו בדיקות קליניות על מנת להעריך את מידת הדלקת ואת חומרת התפקוד לקוי לפני ביצוע IC. המבחנים הקליניים כללו, בין היתר, בדיקות לאבחון פולשני לא-פולשני (NI-TBUT), 14 ו- Redmology (hyperemia) 15 , 16 שהוערכו באמצעות מכשיר אבחון, בדיקה של Schirmer 17 , בדיקת החולה הסטנדרטית של שאלת יובש העין (SPEED) 18 וקרנית מכתים 19 . 1. אוסף של דוגמאות עיניים על ידי IC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קביעת הסטטוס הקליני, להרדיםהעיניים של המשתתף על ידי יישום 1 - 2 טיפות של הרדמה מקומית, proparacaine hydrochloride, כדי הלחמית בולב מעולה נחות. המתן 4 - 5 דקות עבור תחושת עקצוץ של ההרדמה ללבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דגימות משני הלחמית האף הזמני ואת הזרוע עם שני התקני cytology הופעה. הערה: מכשיר אחד משמש לאיסוף שני דגימות רושם. כאן, שני מכשירים שימשו אוסף של ארבעה קרום הופעות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום מכשיר cytology הרושם משיק על הלחמית. לחץ על לחצן הדחיפה בעדינות והחזק ל 2 - 3 שניות. הערה: ההתקן מגיע עם הממברנה. הלחץ משוחרר באופן אוטומטי לאחר לחיצה על הכפתור. זה לוקח רק כמה שניות כדי לשחרר את הלחץ להסיר את המכשיר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את הממברנה לתוך צינור microcentrifuge המכיל 1 מ&quot;ל של התקשורת בתקשורת (Roswell Park Memorial Institute בינוני (RPMI) + 10% בסרום שור עוברית(FBS) + 1% פניצילין סטרפטומיצין (עט דלקת)) על ידי איזמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לבודד מן הממברנה של המכשיר על ידי שריטות רציפה במשך כ 1 דקות עם עצה 10 פיפטה μL. הערה: גירוד הושלמה כאשר פני השטח של הממברנה הופך אחיד. מספרי התא מכל קרום הוא משתנה (100 - 500 תאים / קרום). תהליך דגימות בתוך 2 - 3 שעות של אוסף. </li></ol> 2. תאים Immunophenotyping ידי cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את התקשורת. Resuspend תא גלולה עם μL 50 של cytometry חיץ מכתים זרימה (פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) + 0.05% אלבומין בסרום שור (BSA)). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים של כתם עם פאנל של נוגדנים ( למשל , CD3 מבריק violet (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanine-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 phycoerythrin (PE) -A, CD45RO PE- ציאנין 7 (PE- Cy7) -A, ו חי / מת סימן נייד 7-ADD) בטמפרטורת החדר למשך 20 - 30 דקות באפל. השתמש נוגדנים ישירות מהמלאי על פי פרוטוקול של היצרן. הערה: עבור ריכוז הנוגדן, השתמש 2.5 μL של CD3-BV510, 1.25 μL של CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD ו 10 μL של CCR7-PE. השתמש בתאי mononuclear דם היקפיים (PBMCs) כדי טיטרציה ריכוזים שונים של נוגדנים. עבור טיטרציה, לקחת את הריכוז נוגדנים המוזכרים בפרוטוקול של היצרן ולהשתמש חצי ורבע הריכוז המומלץ. השתמש ריכוז מינימלי של נוגדנים כדי למנוע-לשפוך על ערוצי fluorochrome אחרים. אותות ברורים נצפו עם הריכוזים הנ&quot;ל של נוגדנים. הפיצוי בוצע על ידי בדיקות PBMCs בתחילה על פי הפרוטוקול שהוזכר ויליאמס et al . 20 לבדיקות, PBMCs הודגרו עם אותה קבוצה של נוגדנים בשימוש כאן פיצוי על ידי השוואת כתמי נוגדנים בודדים מרובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה periעוד, להוסיף 1 מ&quot;ל של חיץ מכתים לצינור, לערבב היטב, צנטריפוגה ב XG 450 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. תאים Resuspend μL 200 של חיץ מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דוגמאות על מכונת cytometry זרימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני רכישת הנתונים, לכייל את המתח זרימת cytometer ערוץ עם הגדרת cytometer ומעקב (CS &amp; T) חרוזים לנרמל את רכישת הנתונים על ימים שונים לפי ההוראות של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את זרימת cytometry נתונים אוסף תוכנה, לחץ על &quot;הגדר &amp; QC&quot; כפתור, לבחור את הנכון CS &amp; T חרוז מספר רב, לטעון את החרוזים, ולאחר מכן לחץ על כפתור &quot;התחל&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים על ידי הקשה עדינה על הצינור לפני טעינת דגימות למכונה. פתח את תוכנת איסוף הנתונים ולחץ על &quot;תצוגה מקדימה&quot;. כאשר קצב הסף יציב, לחץ על &quot;רכש&quot;. צג רמת המדגם ולחץ על &quot;עצור&quot; כאשר דגימות נגמרים. הערה: רכישת 10,000 אירועים לכל מדגם. </lI <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רכישת 10,000 אירועים, ליצור SSC-A ו FSC-A נקודה העלילה בגליון העבודה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור &quot;מצולע שער&quot; וצייר שער (זה P1) על כל האירועים עם ערך FSC-A&gt; 5 x 10 4 כדי להוציא פסולת. לחץ על &quot;יצירת נקודה עלילה&quot; כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר &quot;מאפיינים&quot; כדי לפתוח את &quot;עורך מגרש&quot;, ולאחר מכן לבחור &quot;P1&quot;. לחץ על FSC-A על ציר ה- X של מגרש P1 נקודה, לשנות את זה ל- CD3-BV510. צייר &#39;&#39; שער מצולע &#39;&#39; כדי לבחור את האוכלוסייה + CD3 בשם &#39;P2&#39; &#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;יצירת נקודה עלילה&quot; כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר &quot;מאפיינים&quot; כדי לפתוח את &quot;עורך מגרש&quot; חלון. לחץ על FSC-A על ציר ה- X של מגרש P2 נקודה ולשנות אותו ל -7 AAD. צייר &#39;&#39; שער מצולע &#39;&#39; עבור 7-AAD - האוכלוסייה ובחר &#39;&#39; P3 &#39;&#39;. P3 כאן הוא CD3 +תאים חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;יצירת נקודה עלילה&quot; כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר &quot;מאפיינים&quot; כדי לפתוח את &quot;עורך מגרש&quot; חלון. לחץ על CD3-BV510 על ציר x ו- CD4-APCH7 על ציר y של מגרש נקודה P3. צייר שערי מלבן על החלק העליון והתחתון של הרבע ובחר &#39;P4&#39; ו- &#39;P5&#39; בהתאמה. P4 הוא חי CD3 + CD4 + ו P5 הוא חי CD3 + CD4 - T תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;יצירת נקודה עלילה&quot; כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר &quot;מאפיינים&quot; כדי לפתוח את &quot;עורך מגרש&quot; חלון. לחץ על CD45RO PE-Cy7 על ציר x ו- CCR7-PE על ציר ה- y של P4 ו P5 חלקות. צייר &#39;&#39; קוואד שער &#39;&#39; על מגרש זה נקודה. הערה: הצד השמאלי השמאלי העליון, הצד הימני העליון, הצד הימני התחתון בצד שמאל והרביע השמאלי בצד שמאל כאן הם נאיביים, זיכרון מרכזי (T CM ), eזיכרון Ffector (T EM ), זיכרון משפיע מובחן באופן סופי (T EMRA ) תאי T, בהתאמה. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Thatcher, R. W., Darougar, S., Jones, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+impression+cytology.">Conjunctival impression cytology.</a> Arch Ophthalmol. 95 (4), 678-681 (1977).</li><li>Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+conjunctival+biopsy.">A simple conjunctival biopsy.</a> Am J Ophthalmol. 84 (6), 798-801 (1977).</li><li>Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathology+of+dry+eye.">The pathology of dry eye.</a> Surv Ophthalmol. 45, S211-S220 (2001).</li><li>Nelson, J. D., Wright, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+goblet+cell+densities+in+ocular+surface+disease.">Conjunctival goblet cell densities in ocular surface disease.</a> Arch Ophthalmol. 102 (7), 1049-1051 (1984).</li><li>Brignole, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Fas-Fas+ligand+antigens+and+apoptotic+marker+APO2.7+by+the+human+conjunctival+epithelium.+Positive+correlation+with+class+II+HLA+DR+expression+in+inflammatory+ocular+surface+disorders.">Expression of Fas-Fas ligand antigens and apoptotic marker APO2.7 by the human conjunctival epithelium. Positive correlation with class II HLA DR expression in inflammatory ocular surface disorders.</a> Exp Eye Res. 67 (6), 687-697 (1998).</li><li>Knop, E., Knop, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+eye-associated+lymphoid+tissue+in+corneal+immune+protection.">The role of eye-associated lymphoid tissue in corneal immune protection.</a> J Anat. 206 (3), 271-285 (2005).</li><li>Lopez-Miguel, A., Gutierrez-Gutierrez, S., Garcia-Vazquez, C., Enriquez-de-Salamanca, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Collection+From+Human+Conjunctival+Epithelial+Cells+Obtained+With+a+New+Device+for+Impression+Cytology.">RNA Collection From Human Conjunctival Epithelial Cells Obtained With a New Device for Impression Cytology.</a> Cornea. 36 (1), 59-63 (2017).</li><li>Tomlins, P., Roy, P., Cunow, J., Rauz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+EyePRIM+Device+for+Conjunctival+impression+for+Flow+Cytometry.">Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival impression for Flow Cytometry.</a> Invest Opthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).</li><li>Barros Jde, N., Almeida, S. R., Lowen, M. S., Cunha, M. C., Gomes, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+in+the+evaluation+of+ocular+surface+tumors:+review+article.">Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article.</a> Arq Bras Oftalmol. 78 (2), 126-132 (2015).</li><li>Calonge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+of+the+ocular+surface:+a+review.">Impression cytology of the ocular surface: a review.</a> Exp Eye Res. 78 (3), 457-472 (2004).</li><li>Haller-Schober, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+an+impression+cytology+grading+system+(IC+score)+in+patients+with+dry+eye+syndrome.">Evaluating an impression cytology grading system (IC score) in patients with dry eye syndrome.</a> Eye (Lond). 20 (8), 927-933 (2006).</li><li>Singh, R., Joseph, A., Umapathy, T., Tint, N. L., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impression+cytology+of+the+ocular+surface.">Impression cytology of the ocular surface.</a> Br J Ophthalmol. 89 (12), 1655-1659 (2005).</li><li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjunctival+Neutrophils+Predict+Progressive+Scarring+in+Ocular+Mucous+Membrane+Pemphigoid.">Conjunctival Neutrophils Predict Progressive Scarring in Ocular Mucous Membrane Pemphigoid.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (13), 5457-5469 (2016).</li><li>Best, N., Drury, L., Wolffsohn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+evaluation+of+the+Oculus+Keratograph.">Clinical evaluation of the Oculus Keratograph.</a> Cont Lens Anterior Eye. 35 (4), 171-174 (2012).</li><li>Downie, L. E., Keller, P. R., Vingrys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+ocular+bulbar+redness:+a+comparison+of+methods.">Assessing ocular bulbar redness: a comparison of methods.</a> Ophthalmic Physiol Opt. 36 (2), 132-139 (2016).</li><li>Amparo, F., Wang, H., Emami-Naeini, P., Karimian, P., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ocular+Redness+Index:+a+novel+automated+method+for+measuring+ocular+injection.">The Ocular Redness Index: a novel automated method for measuring ocular injection.</a> Investigative ophthalmology &amp; visual science. 54 (7), 4821-4826 (2013).</li><li>Shapiro, A., Merin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schirmer+test+and+break-up+time+of+tear+film+in+normal+subjects.">Schirmer test and break-up time of tear film in normal subjects.</a> American journal of ophthalmology. 88 (4), 752-757 (1979).</li><li>Finis, D., Pischel, N., Konig, C., Hayajneh, J., Borrelli, M., Schrader, S., Geerling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+OSDI+and+SPEED+questionnaires+for+the+evaluation+of+dry+eye+disease+in+clinical+routine.">Comparison of the OSDI and SPEED questionnaires for the evaluation of dry eye disease in clinical routine.</a> Ophthalmologe. 111 (11), 1050-1056 (2014).</li><li>Behrens, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+tear+syndrome:+a+Delphi+approach+to+treatment+recommendations.">Dysfunctional tear syndrome: a Delphi approach to treatment recommendations.</a> Cornea. 25 (8), 900-907 (2006).</li><li>Williams, G. P., Pachino, A., Long, H. M., Rauz, S., Curnow, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+production+and+antigen+recognition+by+human+mucosal+homing+conjunctival+effector+memory+CD8++T+cells.">Cytokine production and antigen recognition by human mucosal homing conjunctival effector memory CD8+ T cells.</a> Invest Opthalmol Vis Sci. 55 (12), 8523-8530 (2014).</li><li>Bose, T., Lee, R., Hou, A., Louis, T., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+resident+memory+T+cells+in+the+human+conjunctiva+and+immune+signatures+in+human+dry+eye+disease.">Tissue resident memory T cells in the human conjunctiva and immune signatures in human dry eye disease.</a> Sci Rep. 7, 45312 (2017).</li><li>Williams, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dominant+human+conjunctival+epithelial+CD8alphabeta++T+cell+population+is+maintained+with+age+but+the+number+of+CD4++T+cells+increases.">The dominant human conjunctival epithelial CD8alphabeta+ T cell population is maintained with age but the number of CD4+ T cells increases.</a> Age (Dordr). 34 (6), 1517-1528 (2012).</li><li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis.">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li></ol>

המחברים אינם מכריזים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

זוהי טכניקה קלה, מהירה ופחות פולשנית, שניתן להשתמש בה במרפאות החוץ של המטופלים לצורך איתור פרופיל החיסוני המהיר יחסית לטכניקות הקונבנציונאליות כגון גירוד, ניסור, פיפטינג או נייר סינון סופג 1 , 2 . וריאציה של טכניקה זו כבר בשימוש הגדרות המחקר 22 . היישום העתידי של המתודולוגיה המוצעת הוא עבור ריבוד המטופל בניסויים קליניים עם מחלות עיניים, במיוחד אלו הדורשות אימונופנוטיפינג. האתגר העיקרי עם טכניקה זו היא תאים חיסוניים מעטים יחסית לאחזר לאחר אוסף רושם ו scraping. המספר הכולל של תאי T3 CD3 התאושש מארבע הופעות לכל אדם מגוון מ ~ 500-1000 תאים. דגימות העין נשטפו לפני ניתוח cytometry זרימה עבור מספר מינימלי של פעמים, כדי למנוע אובדן נוסף של התאS. צעדים קריטיים ואתגרים שנותרו בפרוטוקול הם אוסף יעיל של דגימות עיניים וגירוד הנכון של הממברנה כדי להשיג מספרי תאים גבוהים יותר. עם זאת, הגבלה זו אינה צפויה הטיה כלפי כל פנוטיפ החיסונית ספציפי. פתרון הבעיות שבוצע כאן כדי למקסם את התשואה של התאים היה להפחית את מספר צעדים כביסה לאחר הדגירה של נוגדנים. קיימות מגבלות אחרות לשימוש ב- IC. בחולים עם משטח העין הקרטני או קשות, כמו בתסמונת סטיבן ג&#39;ונסון, התשואה הסלולרית עשויה להיות אפילו נמוכה מזו שבמחקר זה. חלקם של תאים החיסון עשוי להשתנות אם הדגימות מאוחסנים במקום לנתח באותו יום. קשה לנבא אם סוגי תאים מסוימים עמידים יותר לאחסון מאשר לאחרים. מחקרים קודמים דיווחו על רמות גבוהות של ביטוי HLA-DR בתאי אפיתל הלחמית 23 , כך שזה יהיה interEsting כדי להעריך את המתאם בין HLA-DR לבין רמות של תאים חיסוניים ספציפיים. תאים חיסוניים עשויים להיות קשורים גם עם רמת הביטוי של chemokines. יש להתייחס לנושאים אלה במחקרים עתידיים.

Cytology ההופעה (IC) בוצעה לראשונה בשנת 1977 על ידי תאצ&#39;ר ואח &#39; . הם השתמשו תקליטור פלסטיק כדי לאסוף תאים conjunctival מחולים במקום טכניקות אחרות הזמינות באותו זמן כגון גירוד, swabbing או pipetting 1 . הטכניקה הנוכחית של IC משתמשת נייר מסנן סופג 2 כדי להטביע את הנורה ואת הלחמית palpebral ולאסוף את השכבה השטחית ביותר של תאים conjunctival. תאים אלה, לאחר שהגיעו לשלב הסופי של ההבחנה שלהם, נשפכים ללא הרף בדמעות 3 . שלוש אוכלוסיות גדולות של תאים נמצאים דגימות IC: תאים אפיתל 4 , גביע תאים 3 , 5 , ואת רירית הלימפוזות הקשורים לימפויז דהינו אפיתל הקשורים המשפיע T תאים או תאים דנדריטים 6 . תאים פנימיים של העין ב- IC SamPles ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופיה, חיסון סופג לאחור transcriptase פולימראז התגובה שרשרת (RT-PCR) 7 . זרימת cytometry שימש לאחרונה כדי לנתח תאים חיסוניים שנאספו על ידי שריטות קרום IC 8 . מעניין, IC 6 , 9 נעשה שימוש כדי להעריך הרבה מחלות פני השטח של העין כולל ceratoconjunctivitis sicca, מחסור בוויטמין A, pemphigoid cicatricial, מחלה atopic, מעולה keratoconctivivivivitis לימבית, דלקת קרטוקונאנגיוויטיס, ו metaplasia קשקשים אפיתל. IC שימש גם כדי להעריך את ההשפעה של עדשות מגע, גילוי חיידקי משטח העין, ובדיקת יעילות טיפולית וסובלנות של התערבויות טיפוליות במחקרים אורכיים 10 , 11 , 12 . המכשיר הרפואי (EyePrim) נתמך על ידי סוג של פוליEthersulfone (PES) 0.2-מיקרומטר קרום, אשר כבר תוקף בעבר עבור הטכניקה של cytology ההופעה העין עם cytometry זרימה (זרימת OSIC) ופותח הזדמנויות להשתמש דגימה אורך כדי לפקח על התקדמות המחלה בתגובה לטיפול ( למשל , מפורט ניתוח של leukocytes intraepithelial שהוגדרו סמנים מחלה משוערת עבור פיברוזיג המפרק פרוגרסיבי ב פמפיגואיזם ממברנה רירית) 13 . חוקרים מוקדמים השתמשו במסנני PES אוטוקלאב הדורשים הופעה ידנית. כתוצאה מכך, התשואה הייתה משתנה ותלויית המשתמש. היתרון של מכשיר רפואי זה הוא קלות שימוש, לחץ סטנדרטי (Pa או N / m 2 ), ומאפשר שחזור, שחזור, והתאוששות סלולרית עקבית. טכניקה זו שימושית במרפאת החוץ כי זה לא כירורגי, קל לביצוע מהיר. זהו מכשיר רפואי מסוג I (סטרילי) לפי ההוראה 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). זה רק דורשS ההרדמה אקטואלי במהלך ההליך, אשר מבטיח שמירה על שלמות של משטח העין. בעקבות IC, תאים ניתן לעבד מיד cytometry הזרימה. יתר על כן, זה אפשרי עבור אופתלמולוגיה טכנאים ואחיות להיות מאומן למדגם את פני העין. למרות השיפור של IC על פני טכניקות אחרות, נותרו מספר אתגרים. לדוגמה, ייתכן שיש וריאציה עקב אזור הדגימה והבדלים אזוריים של הלחמית bulbar בהתאם למיקום של IC. מקור נוסף של וריאציה נובע מיישום של לחצים שונים במהלך IC. בעיות מתודולוגיות אחרות כרוכות בסטנדרטיזציה של עיבוד התאים: אלה כרוכות בשיטה ובשיטה של ​​קיבוע, ובתנאי אחסון אפשריים, העלולים להשפיע על היציבות של החומר שנדגמו. המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לפתח שיטה של ​​בידוד של דגימות הרושם העין thaT הוא קל לשימוש, לא פולשני והוא יכול להיות מיושם על אפיון אימונולוגי של דגימות קליניות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="940">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Reagents</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD3 BV510</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">563109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD4 APCH7</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">641398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CD45RO PECy7</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">337168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">7-AAD solution</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">555816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">anti-human CCR7 PE</td>
			<td style="width:300px;">BD Biosciences</td>
			<td align="right">552176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Pippetes</td>
			<td style="width:300px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Local Anaesthesia</td>
			<td style="width:300px;">Alcaine</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fluorescein sodium solution</td>
			<td style="width:300px;">Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Equipments</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Keratograph 5M</td>
			<td>Oculus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Slit lamp BioMicroscope</td>
			<td>Haag Streit</td>
			<td>BM900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:331px;">EyePrim</td>
			<td>Opia Technologies</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACS Verse</td>
			<td style="width:300px;">BD BioSciences</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:331px;">Name</td>
			<td style="width:300px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Softwares</td>
			<td style="width:300px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">GraphPad 6.0</td>
			<td style="width:300px;">Prism</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACSVerse analysis software</td>
			<td style="width:300px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva

באופן מסורתי, cytology פני העין נלמד עם טכניקות כגון טכנולוגיית מרית ומברשת הטכנולוגיה. הבעיה עם טכניקות אלה היא שהם עלולים לגרום נגעים טראומטיים על פני העין, אשר יכול להתקדם הצטלקות, עיוות עפעף, חוסר תאי גזע limbal ובמקרים מסוימים, לגרום אי נוחות רבה לנושא. כדי למנוע בעיות קליניות אלו, פיתחה ציטולוגיה של הרושם (IC) לאבחון מחלות עיניים יבשות ומאוחר יותר נאופלזיה, מחלה אטופית, דלקת קרטוקונאנגיוויטיס ורידית וקרטוקו-גונקטיטיס סיקה. בדרך כלל, קלינאים לחתוך ידנית מסננים נייר לתוך צורות הנדרשים וליישם אלה על פני העין. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע IC באמצעות מכשיר רפואי זמין מסחרית. טכניקה זו מוסברת כאן ואחריו immunophenotyping על ידי cytometry הזרימה. טכניקה זו דורשת טיפול ידני פחות גורם פחות פציעה על פני העין.

IC על ידי מכשיר קליני זה אפשרה לנו לבודד את תאי החיסון של פני העין, תוך שמירה על פני העין ללא פגע. איור 1 מתאר כיצד בוצע ה- IC. האתרים השונים של העין ממקום איסוף הדגימות מסומנים. איור 2 מציג תוצאה נציג של cytometry הזרימה שנאספו 10 פקדים בריאים. עבור gating, להשתמש SSC ו 7-AAD להבחין בין תאים חיים מתים. 7-AAD - תאים מזוהים כתאים חיים. תאים חיים אלה מאופיינים עוד יותר על ידי CD3 + ו CD4 + סמנים. יתר על כן, CD4 + ו CD4 - אוכלוסיות היו כל עוד מאופיינים כמו Naïve, T EM , T CM ו T EMRA עם CCR7 ו CD45RO סמנים. בין תאי CD3 + T, זיכרון T ממריץ תאים שולטים על פני העין האנושית. בXperiments, זה הוכח גם כי תאים CD8 + זיכרון הם האוכלוסיות העיקריות בתאי T אפיתל T בציבור בקרב אנשים בריאים 20 . איור 3 מראה כי CD4 + ו CD8 + זיכרון זיכרון תאים T (T EM ו- T EMRA ) הם המשנה העיקרית של פני העין האנושית ב -10 בקרות בריא למד. כל האוכלוסייה שהוזכרו בדמות מקבלים הודעה עם הפנוטיפ שלהם ואת השמות שלהם (נאיבי, T CM , T EM , T EMRA ). המספרים באדום מציינים את אחוז האוכלוסייה. הנתונים בנתון זה מיוצגים כ- ± SEM ממוצע <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> איור 1: אוסף של דגימות IC מן משטח העין על ידי מכשיר cytology ההופעה. דוגמאות נאספו מהנורה הזמניתבאזור ar כמוצג. <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> איור 2: תרשים גרף נקודה באמצעות cytometry זרימה. Live 7-AAD - תאים נבחרו. תאי ה- CD3 + היו נשלטים תחילה, ואז אוכלוסייה זו נשלטה לתוך תת-מערכות CD4 + ו- CD4. הפרופורציות של נאיבי (CCR7 + CD45RO - ), זיכרון מרכזי (CCR7 + CD45RO + ) וזיכרון זיכרון (CCR7 - CD45RO +) ; CCR7 - CD45RO - ) תת קבוצות נקבעה בעזרת CCR7 ו CD45RO סמנים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FIgure 3: תאים חיסוניים תת סוגי CD4 + ו CD8 + T תאים של פני אדם בריאים אנושיים. התפלגות CD4 + ו CD8 + זיכרון נאיבי, זיכרון מרכזי (T CM ), וזיכרון זיכרון (T EM ו- T EMRA ) תת שולט בבקרות אנושיות בריאים; כל נקודת נתונים מייצג יחיד בודדת מתכוון ± SEM מוצג. אחוז האוכלוסייה מסומן באדום מתחת לשמה של כל אחת מהאוכלוסיות. האחוז הכולל של האוכלוסייה הוא 98%, משום שאוכלוסיית CD4 + T EMRA לא נכללה במפזר הנ&quot;ל (שונה מ- Bose et al 21 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva at JoVE.com

A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

משטח העין הרגיל שנחשף מורכב קרנית ו הלחמית. תאי אפיתל, תאי גביע ותאי חיסון נמצאים בחניך. הנה, לא פולשנית, טכניקה של cytology הופעת מתואר באמצעות מכשיר cytology הרושם cytometry זרימה לנתח את תאי החיסון ב הלחמית.

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

a-non-invasive-way-to-isolate-and-phenotype-cells-from-the-conjunctiva

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.2K Views.  Nanyang Technological University.  משטח העין הרגיל שנחשף מורכב קרנית ו הלחמית. תאי אפיתל, תאי גביע ותאי חיסון נמצאים בחניך. הנה, לא פולשנית, טכניקה של cytology הופעת מתואר באמצעות מכשיר cytology הרושם cytometry זרימה לנתח את תאי החיסון ב הלחמית. 

Video: A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 to 40% attributable mortality6. Systemic candidiasis is normally controlled by innate immunity, and individuals with genetic defects in innate immune cell components such as phagocyte NADPH oxidase are more susceptible to candidemia7-9. Very little is known about the dynamics of C. albicans interaction with innate immune cells in vivo. Extensive in vitro studies have established that outside of the host C. albicans germinates inside of macrophages, and is quickly destroyed by neutrophils10-14. In vitro studies, though useful, cannot recapitulate the complex in vivo environment, which includes time-dependent dynamics of cytokine levels, extracellular matrix attachments, and intercellular contacts10, 15-18. To probe the contribution of these factors in host-pathogen interaction, it is critical to find a model organism to visualize these aspects of infection non-invasively in a live intact host. 
The zebrafish larva offers a unique and versatile vertebrate host for the study of infection. For the first 30 days of development zebrafish larvae have only innate immune defenses2, 19-21, simplifying the study of diseases such as disseminated candidiasis that are highly dependent on innate immunity. The small size and transparency of zebrafish larvae enable imaging of infection dynamics at the cellular level for both host and pathogen. Transgenic larvae with fluorescing innate immune cells can be used to identify specific cells types involved in infection22-24. Modified anti-sense oligonucleotides (Morpholinos) can be used to knock down various immune components such as phagocyte NADPH oxidase and study the changes in response to fungal infection5. In addition to the ethical and practical advantages of using a small lower vertebrate, the zebrafish larvae offers the unique possibility to image the pitched battle between pathogen and host both intravitally and in color. 
The zebrafish has been used to model infection for a number of human pathogenic bacteria, and has been instrumental in major advances in our understanding of mycobacterial infection3, 25. However, only recently have much larger pathogens such as fungi been used to infect larva5, 23, 26, and to date there has not been a detailed visual description of the infection methodology. Here we present our techniques for hindbrain ventricle microinjection of prim25 zebrafish, including our modifications to previous protocols. Our findings using the larval zebrafish model for fungal infection diverge from in vitro studies and reinforce the need to examine the host-pathogen interaction in the complex environment of the host rather than the simplified system of the Petri dish5.

The rapid development, small size and transparency of zebrafish are tremendous advantages for the study of innate immune control of infection1-4. Here we demonstrate techniques for infecting zebrafish larvae using the fungal pathogen Candida albicans by microinjection, methodology recently used to implicate phagocyte NADPH oxidase activity in control of fungal dimorphism5.

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

Disseminated candidiasis caused by the pathogen Candida albicans is a clinically important problem in hospitalized individuals and is associated with a 30 ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease1. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans7, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin8. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging8. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space8, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 &mu;l) of ICG (645 &mu;M) or cABD-IRDye800 (200 &mu;M) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 &mu;g/kg for ICG or 113-1,700 &mu;g/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired9. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

Recently developed imaging techniques using near-infrared fluorescence (NIRF) may help elucidate the role the lymphatic system plays in cancer metastasis, immune response, wound repair, and other lymphatic-associated diseases.

דימות אופטי לא פולשנית של כלי דם הלימפה של עכבר

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; זיהום בעכברוש הילודים

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Complete Thymectomy in Adult Rats with Non-invasive Endotracheal Intubation

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and pneumothorax from pleural disruption can result in a significant mortality rate. This protocol is a simple method of rat thymectomy that utilizes a mini-sternotomy and endotracheal intubation. Intubation is accomplished with a non-invasive and easily reproducible method and allows for positive pressure ventilation to prevent pneumothorax and a controlled airway that allows sufficient time for careful thymus dissection to minimize pleural disruption. A 1.5 cm sternal incision decreases contact with mediastinal vessels and pleura, while still providing full visualization of the thymus. Following exposure of the mediastinum, the thymus is removed by blunt dissection under magnification. The pleural space is then sealed by suture closure of the pre-tracheal muscles followed by the application of surgical glue. The thorax is then closed by suture closure of the sternum, followed by suture closure of the skin. All thymectomies were complete as evidenced by immunohistochemical (IHC) staining of mediastinal tissue, and absence of na&#239;ve T-cells by flow cytometry, and the procedure had a 96% survival rate. This method is suitable when complete thymectomy with minimal complications is desired for further immunological studies in athymic adult rats.

Rodent thymectomy is a valuable technique in immunological research. Here, a protocol for complete thymectomy in adult rats using a mini-sternotomy along with non-invasive intubation and positive pressure ventilation to minimize perioperative morbidity and mortality is described.

Thymectomy מלא בחולדות מבוגרות עם לא פולשני endotracheal אינטובציה

Thymectomy in neonatal rodents is an established and reliable procedure for immunological studies. However, in adult rats, complications of hemorrhage and ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA טיהור מן intracellularly Grown<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; בתאי Macrophage

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

הדמיה לא פולשנית של פטרת מופצת הזחלים דג הזברה

דימות אופטי לא פולשנית של כלי דם הלימפה של עכבר

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ

דגם לא פולשנית של Neuropathogenic

Thymectomy מלא בחולדות מבוגרות עם לא פולשני endotracheal אינטובציה

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של

RNA טיהור מן intracellularly Grown