Gli autori vorrebbero ringraziare Nandini Nallappan e Sharon Yeo per aver contribuito con i passi tecnici. Lo studio è stato finanziato da una concessione di start-up per KGC presso la Lee Kong Chian School of Medicine, l&#39;Università Tecnologica di Nanyang e da un Senior Clinician Scientist Award del National Medical Research Council (NMRC) di Singapore Ministry of Health a LT (NMRC / CSA / 045/2012) e da una sovvenzione del NMRC e somministrata dal National Health Innovation Centre a KGC e LT (NHIC-12D-1409007).

Tutti i campioni oculari utilizzati in questo studio sono stati raccolti dalla Clinica Occhio Dell&#39;occhio presso il National Eye Center di Singapore approvato da SingHealth Centralized Institutional Review Board e dal Nanyang Technological University Institutional Review Board di Singapore. NOTA: I soggetti sono stati sottoposti a test clinici per valutare l&#39;entità dell&#39;infiammazione e la gravità della disfunzione della lacrima prima dell&#39;esecuzione dell&#39;IC. I test clinici hanno incluso il tempo di rottura non strappante (NI-TBUT) 14 e l&#39;arrossamento congiuntivale (iperemia) 15,16 valutati con uno strumento diagnostico, il test di Schirmer 17 , il questionario 18 di valutazione del paziente standard di secchezza d&#39;occhio (SPEED) e corneali Colorazione 19 . 1. Raccolta di campioni Ocular da IC <ol><li> Dopo la determinazione dello stato clinico, anestetizzanoGli occhi del partecipante applicando 1 - 2 gocce di anestesia topica, proparacaina cloridrato, alla congiuntiva bulbar superiore e fornix inferiori. Attendere 4 - 5 minuti per la sensazione di stinging dell&#39;anestesia da indossare. </li><li> Raccogliere campioni sia dalla congiuntiva bulbare nasale che temporale con due dispositivi di citologia impressionante. NOTA: Un dispositivo è utilizzato per la raccolta di due campioni di impressioni. Qui sono stati utilizzati due dispositivi per la raccolta di quattro membrane di impressione. <ol><li> Posizionare il dispositivo della citologia di impressione tangenzialmente sulla congiuntiva. Premere delicatamente il pulsante e tenere premuto per 2 - 3 secondi. NOTA: Il dispositivo viene fornito con la membrana. La pressione viene rilasciata automaticamente dopo aver premuto il pulsante. Ci vogliono pochi secondi per liberare la pressione e rimuovere il dispositivo. </li></ol></li><li> Rilasciare la membrana in un tubo di microcentrifuga contenente 1 mL di supporto di coltura (Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) + 10% di siero fetale fetale(FBS) + 1% Penicillina-Streptomicina (Pen Strep)) da un bisturi. </li><li> Isolare le cellule dalla membrana del dispositivo mediante strisciamento continuo per circa 1 min con una punta pipetta da 10 μL. NOTA: il raschiamento è completato quando la superficie della membrana diventa irregolare. I numeri delle cellule da ogni membrana sono variabili (100-500 cellule / membrana). Processare i campioni entro 2 - 3 ore di raccolta. </li></ol> 2. Cellule di immunofenotipizzazione mediante citometria di flusso <ol><li> Centrifugare le cellule a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente per rimuovere il supporto. Resuspendere il pellet cellulare con 50 μl di buffer di colorazione citometrica (fosfato tamponato salina (PBS) + 0,05% albumina bovina serba (BSA)). </li><li> Le cellule macchie con un pannello di anticorpi ( ad esempio , CD3 brillante violetta (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanine-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 phycoerythrin (PE) -A, CD45RO PE-cianina 7 (PE- Cy7) -A, e segnale di cellule vivo / morte 7-ADD) a temperatura ambiente per 20 - 30 minbuio. Usare gli anticorpi direttamente dalla scorta secondo il protocollo del produttore. NOTA: Per la concentrazione di anticorpi, utilizzare 2,5 μL di CD3-BV510, 1,25 μL di CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD e 10 μL di CCR7-PE. Utilizzare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per titolare le diverse concentrazioni degli anticorpi. Per la titolazione, prendere la concentrazione di anticorpi menzionata nel protocollo del produttore e utilizzare metà e un quarto della concentrazione raccomandata. Utilizzare la concentrazione minima di anticorpi per evitare lo spargimento di altri canali fluorochromici. Sono stati osservati segnali chiari con le citate concentrazioni di anticorpi. La compensazione è stata effettuata sperimentando inizialmente PBMC secondo il protocollo citato in Williams et al . 20 Per la sperimentazione, i PBMCs sono stati incubati con lo stesso insieme di anticorpi utilizzati qui e compensati confrontando singole e multiple anticorpi. </li><li> Dopo il periodo di incubazioneAggiungere 1 ml di tampone di colorazione al tubo, mescolare bene e centrifugare a 450 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Riposizionare le cellule in 200 μl di tampone di colorazione. </li><li> Eseguire campioni su una macchina di citometria a flusso. <ol><li> Prima di acquisire i dati, calibrare le tensioni del canale del citometro di flusso con le perle di configurazione e tracciamento dei citometri (CS &amp; T) per normalizzare l&#39;acquisizione di dati in giorni diversi secondo le istruzioni del produttore. <ol><li> Aprire il software di raccolta dati di cytometria a flusso, fare clic sul pulsante &quot;Imposta e QC&quot;, scegliere il numero corretto di lotto per CS &amp; T, caricare le sfere e quindi fare clic sul pulsante &quot;Avvio&quot;. </li></ol></li><li> Riposizionare le celle premendo delicatamente il tubo prima di caricare i campioni sulla macchina. Aprire il software di raccolta dati e fare clic su &quot;Anteprima&quot;. Quando la soglia di soglia è stabile, fare clic su &quot;Acquisisci&quot;. Monitorare il livello del campione e fare clic su &quot;Stop&quot; quando i campioni esauriscono. NOTA: acquisire 10.000 eventi per campione. </li&gt; <li> Dopo aver acquisito 10.000 eventi, generare un diagramma a punti SSC-A e FSC-A nel foglio di lavoro. <ol><li> Fai clic sul pulsante &quot;Polygon Gate&quot; e disegna una porta (questo è P1) su tutti gli eventi con un valore FSC-A&gt; 5 x 10 4 per escludere i detriti. Fai clic su &quot;Crea un grafico a punti&quot; per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli &quot;Proprietà&quot; per aprire la finestra &quot;Plot Editor&quot; e quindi scegliere &quot;P1&quot;. Fai clic sul FSC-A sull&#39;asse x del puntino P1, cambialo su CD3-BV510. Disegna un &#39;&#39; Polygon Gate &#39;&#39; per scegliere la popolazione CD3 + e denominarla &#39;&#39; P2 &#39;&#39;. </li><li> Fai clic su &quot;Crea un grafico a punti&quot; per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli &quot;Proprietà&quot; per aprire la finestra &quot;Plot Editor&quot;. Fai clic sul FSC-A sull&#39;asse x della trama del puntino P2 e cambiala in 7-AAD. Disegna un &#39;&#39; Polygon Gate &#39;&#39; per 7-AAD - popolazione e scegli &#39;&#39; P3 &#39;&#39;. P3 qui è CD3 +Cellule vive. </li><li> Fai clic su &quot;Crea un grafico a punti&quot; per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli &quot;Proprietà&quot; per aprire la finestra &quot;Plot Editor&quot;. Fare clic sul CD3-BV510 sull&#39;asse x e sul CD4-APCH7 sull&#39;asse y del tracciato dot P3. Disegnare i Rectangle Gates sui lati superiore e inferiore del quadrante e scegliere rispettivamente &quot;P4&quot; e &quot;P5&quot;. P4 è live CD3 + CD4 + e P5 è CD3 + CD4 - T live. </li><li> Fai clic su &quot;Crea un grafico a punti&quot; per generare un nuovo grafico a punti, fai clic destro sulla macchia di punti, scegli &quot;Proprietà&quot; per aprire la finestra &quot;Plot Editor&quot;. Fare clic sul CD45RO PE-Cy7 sull&#39;asse x e sul CCR7-PE sull&#39;asse y di entrambe le tracce P4 e P5. Disegna &quot;Quad Gate&quot; su questa trama di punti. NOTA: Il lato superiore destro, il lato destro superiore, il lato inferiore destro e i quadranti laterali inferiori a sinistra sono ingenui, la memoria centrale (T CM ), e(T EM ), rispettivamente, le cellule T EMRA (TEMRA) differenziate terminalmente. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Mrugacz, M., Zak, J., Bakunowicz-Lazarczyk, A., Wysocka, J., Minarowska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+HLA-DR+antigen+in+conjunctival+epithelial+cells+of+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of HLA-DR antigen in conjunctival epithelial cells of patients with cystic fibrosis.</a> Eye (Lond). 21 (8), 1062-1066 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.

Si tratta di una tecnica facile, veloce e meno invasiva che può essere utilizzata nelle cliniche di out-patient per una profilatura immunitaria relativamente veloce in contrasto con le tecniche convenzionali come il raschiamento, la tamponatura, la pipettazione o la carta filtrante assorbente 1 , 2 . Una variante di questa tecnica è già stata utilizzata nelle impostazioni di ricerca 22 . La futura applicazione della metodologia proposta è quella di stratificare pazienti in studi clinici con malattie oculari, in particolare quelle che richiedono l&#39;immunofenotipizzazione. Una grande sfida con questa tecnica è la relativamente poche cellule immunitarie recuperate dopo la raccolta e lo strappo delle impressioni. Il numero totale di CD3 + T cellule recuperate da quattro impressioni per singolo varia da ~ 500 a 1.000 cellule. I campioni oculari sono stati lavati prima dell&#39;analisi della citometria di flusso per un numero minimo di volte per evitare ulteriori perdite di celluleS. I passi critici e le sfide che rimangono all&#39;interno del protocollo sono una raccolta efficiente di campioni oculari e una corretta raschiatura della membrana per ottenere numeri superiori di cellule. Tuttavia, questa limitazione è improbabile che si propaghi verso un determinato fenotipo immunitario. La risoluzione dei problemi effettuata qui per massimizzare la resa delle cellule era ridurre il numero di passi di lavaggio dopo e prima dell&#39;incubazione degli anticorpi. Ci sono altre limitazioni per l&#39;utilizzo dell&#39;IC. Nei pazienti con superficie oculare gravemente cheratinizzata o fibrose, come nella sindrome di Steven Johnson, il rendimento cellulare può essere anche inferiore a quello di questo studio. La percentuale di cellule immunitarie può cambiare se i campioni vengono memorizzati anziché analizzati nello stesso giorno. È difficile prevedere se determinati tipi di cellule sono più resistenti all&#39;archiviazione rispetto ad altri. Studi precedenti hanno riportato elevati livelli di espressione HLA-DR nelle cellule epiteliali congiuntivali 23 , pertanto sarebbe interPer valutare la correlazione tra HLA-DR e livelli di cellule immunitarie specifiche. Le cellule immunitarie possono anche essere associate al livello di espressione delle chemochine. Questi temi dovrebbero essere affrontati negli studi futuri.

La citologia di impressione (IC) è stata eseguita per la prima volta nel 1977 da Thatcher et al . Hanno usato un disco di impressione in plastica per raccogliere le cellule congiuntivali dai pazienti anziché altre tecniche disponibili in quel momento come raschiatura, svuotamento o pipettatura 1 . La tecnica attuale di IC utilizza una carta filtrante assorbente 2 per imprimere la bulbar e la congiuntiva palpebrale e raccogliere lo strato superficiale delle cellule congiuntivali. Queste cellule, dopo aver raggiunto la loro fase finale di differenziazione, vengono continuamente sparse in lacrime 3 . Tre principali popolazioni di cellule sono presenti nei campioni IC: cellule epiteliali 4 , cellule calde 3 , 5 e tessuto linfoidale associato alla mucosa, ovvero cellule T efficaci associate all&#39;epitelio o cellule dendritiche 6 . Cellule di superficie oculari in IC samPossono essere analizzati mediante microscopia, reazione a catena di polimerasi di polimerasi a reazione inversa-transcriptasi (RT-PCR) 7 . La citometria a flusso è stata recentemente usata per analizzare le cellule immunitarie raccolte raschiando la membrana IC 8 . È interessante notare che IC 6 , 9 è stato usato per valutare molte malattie della superficie oculare, tra cui la cheratoconjunctivitis sicca, la carenza di vitamina A, la pemfigoide cicatrici, la malattia atopica, la cheratoconjunctivite limbica superiore, la cheratoconjunctivite viverna e la metaplasia squamosa epiteliale. IC è stato utilizzato anche per valutare l&#39;impatto delle lenti a contatto usurate, rilevare microbi superficiali oculari e verificare l&#39;efficacia terapeutica e la tolleranza degli interventi terapeutici negli studi longitudinali 10 , 11 , 12 . Il dispositivo medico (EyePrim) è supportato da un tipo di poliEterosolfone (PES) membrana da 0,2 μm, precedentemente convalidata per la tecnica della citometria oculare con citometria a flusso (flusso OSIC) e apre opportunità di utilizzare campionamenti longitudinali per monitorare la progressione della malattia e la risposta al trattamento ( ad es . Analisi dei leucociti intraepiteliali definiti come marker di malattia supposto per la fibrosi progressiva congiuntivale nella pemfigoide della membrana mucosa) 13 . I primi ricercatori hanno utilizzato filtri PES autoclavati che richiedevano l&#39;impressione manuale. Di conseguenza, la resa era variabile e dipendente dall&#39;utente. Il vantaggio di questo dispositivo medico è la facilità d&#39;uso, la pressione standardizzata (Pa o N / m 2 ) e consente ripetibilità, riproducibilità e recupero cellulare coerente. Questa tecnica è utile in una clinica out-patient perché non è chirurgica, è facile da eseguire e veloce. Si tratta di un dispositivo medico di classe I (sterile) secondo la direttiva 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). Richiede soloL&#39;anestesia topica durante la procedura, che garantisce la manutenzione dell&#39;integrità della superficie oculare. Dopo IC, le cellule possono essere trattate immediatamente per la citometria a flusso. Inoltre, è possibile che i tecnici e gli infermieri non oftalmologici siano addestrati per campionare la superficie oculare. Nonostante il miglioramento del CI rispetto ad altre tecniche, rimangono diverse sfide. Ad esempio, potrebbero esservi variazioni dovute all&#39;area del campionamento e alle differenze regionali nella congiuntiva bulbar a seconda della posizione dell&#39;IC. Un&#39;altra fonte di variazione è dovuta all&#39;applicazione di diverse quantità di pressione durante l&#39;IC. Altre questioni metodologiche riguardano la standardizzazione dell&#39;elaborazione delle cellule: queste riguardano la durata e il metodo di fissazione e le condizioni di possibili stoccaggi che possono influenzare la stabilità del materiale campionato. L&#39;obiettivo generale di questa tecnica è quello di sviluppare un metodo di isolamento dei campioni di impressione oculare thaT è facile da usare, non invasivo e può essere applicato alla caratterizzazione immunologica dei campioni clinici.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD3 BV510</td><td>BD Biosciences</td><td>563109</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD4 APCH7</td><td>BD Biosciences</td><td>641398</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CD45RO PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>337168</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555816</td><td></td></tr><tr><td>anti-human CCR7 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>552176</td><td></td></tr><tr><td>Pippetes</td><td>Eppendorf</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Local Anaesthesia</td><td>Alcaine</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium solution</td><td>Bausch &amp;amp; Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Keratograph 5M</td><td>Oculus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Slit lamp BioMicroscope</td><td>Haag Streit</td><td>BM900</td><td></td></tr><tr><td>EyePrim</td><td>Opia Technologies</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACS Verse</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Softwares&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad 6.0</td><td>Prism</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse analysis software</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

a non-invasive way to isolate and phenotype cells from the conjunctiva

Tradizionalmente, la citologia di superficie oculare viene studiata con tecniche come la tecnica della spatola e la tecnologia a spazzola. Il problema con queste tecniche è che possono indurre lesioni traumatiche sulla superficie dell&#39;occhio, che possono progredire per la cicatrice, la deformità delle palpebre, la carenza di cellule staminali limbali e in alcuni casi causare grande disagio al soggetto. Per evitare questi problemi clinici, è stata sviluppata la citologia di impronta (IC) per diagnosticare la malattia degli occhi asciutti e successivamente la neoplasia, la malattia atopica, la cheratoconjunctivite vera e la keratoconjunctivitis sicca. Tipicamente i medici tagliano manualmente i filtri nelle forme richieste e applicarle alla superficie oculare. Qui descriviamo come eseguire IC utilizzando un dispositivo medico disponibile in commercio. Qui viene spiegata questa tecnica seguita da immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso. Questa tecnica richiede meno movimentazione manuale e provoca minori lesioni alla superficie oculare.

IC da questo dispositivo clinico ci ha permesso di isolare le cellule immunitarie della superficie oculare, mantenendo intatte la superficie oculare. La Figura 1 descrive come è stata eseguita l&#39;IC. Sono contrassegnati i diversi siti dell&#39;occhio da dove sono stati raccolti i campioni. La Figura 2 mostra il risultato rappresentativo della citometria a flusso prelevata da 10 controlli sani. Per il gating, utilizzare SSC e 7-AAD per distinguere tra cellule vive e morte. 7-AAD - le cellule sono identificate come cellule vive. Queste cellule vive sono ulteriormente caratterizzate da marker CD3 + e CD4 + . Inoltre, le popolazioni CD4 + e CD4 sono state ulteriormente caratterizzate come Naïve, TEM , T CM e T EMRA con i marcatori CCR7 e CD45RO. Tra le cellule CD3 + T, le cellule T della memoria efficace predominano nella superficie umana umana. In precedenza eXperimenti, è stato anche dimostrato che le cellule di memoria CD8 + sono le principali popolazioni nelle cellule T epiteliali congiuntivali tra le persone sane 20 . La Figura 3 mostra che le cellule T (T EM e T EMRA ) di memoria efficace CD4 + e CD8 + sono il principale sottoinsieme della superficie umana umana in 10 controlli sani studiati. Ogni popolazione menzionata nella figura viene notificata con il loro fenotipo di marcatori e con i nomi (Naïve, T CM , T EM , T EMRA ). I numeri in rosso indicano la percentuale della popolazione. I dati in questa figura sono rappresentati come media ± SEM <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig1.jpg" /> Figura 1: Raccolta di campioni IC dalla superficie dell&#39;occhio dal dispositivo di citologia di impressione. I campioni sono stati raccolti dalla lampadina temporaleRegione dell&#39;ar come mostrato. <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig2.jpg" /> Figura 2: Grafico a punti con la citometria di flusso. Sono state selezionate le cellule live 7-AAD. Le cellule CD3 + sono state prima gated, e questa popolazione è stata gated in CD4 + e CD4 - subsets. Le proporzioni di sottoinsiemi naïve (CCR7 + CD45RO - ), memoria centrale (CCR7 + CD45RO + ) e memoria degli effetti (CCR7 - CD45RO + ; CCR7 - CD45RO - ) sono stati determinati con l&#39;aiuto di marcatori CCR7 e CD45RO. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55591/55591fig3.jpg" /> FIgure 3: sottotipi di cellule immunitarie in cellule CD4 + e CD8 + T di sana superficie umana umana. Distribuzione di sottoinsiemi di CD4 + e CD8 + congiunti, memoria centrale (T CM ) e memoria degli effetti (T EM e T EMRA ) in controlli umani sani; Ogni punto dati rappresenta una media individuale separata ± SEM mostrata. La percentuale della popolazione è contrassegnata come rosso sotto il nome di ciascuna delle popolazioni. La percentuale totale della popolazione è del 98%, poiché la popolazione CD4 + T EMRA non è stata inclusa nella suddetta scatterplot (modificata da Bose et al. 21 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55591/55591fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Non-invasive Way to Isolate and Phenotype Cells from the Conjunctiva

La superficie oculare normale esposta è costituita da cornea e congiuntiva. Le cellule epiteliali, le cellule calde e le cellule immunitarie sono presenti nella congiuntiva. Qui viene descritta una tecnica non invasiva di citologia di impronta usando un dispositivo di citologia di impressione e una citometria a flusso per analizzare le cellule immunitarie nella congiuntiva.

Un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della Conjunctiva

Traditionally, ocular surface cytology is studied with techniques such as spatula technology and brush technology. The problem with these techniques is ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.3K Views.  Nanyang Technological University.  La superficie oculare normale esposta è costituita da cornea e congiuntiva. Le cellule epiteliali, le cellule calde e le cellule immunitarie sono presenti nella congiuntiva. Qui viene descritta una tecnica non invasiva di citologia di impronta usando un dispositivo di citologia di impressione e una citometria a flusso per analizzare le cellule immunitarie nella congiuntiva. 

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Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Bioingegneria

Impression Cytology of the Lid Wiper Area

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.

We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.

Citologia ad impressione del coperchio Area Wiper

Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The ...

Medicina

Conjunctival Commensal Isolation and Identification in Mice

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. Identification and monitoring of bacterial species at the ocular mucosa have been challenging due to their low abundance and limited availability of appropriate methodology for commensal growth and identification. There are two standard approaches: culture based or DNA sequencing methods. The first method is problematic due to the limited recoverable bacteria and the second approach identifies both live and dead bacteria leading to an aberrant representation of the ocular space. We developed a robust and sensitive method for bacterial isolation by building upon standard microbiological culturing techniques. This is a swab-based technique, utilizing an &#8220;in-lab&#8221; made thin swab that targets the lower conjunctiva, followed by an amplification step for aerobic and facultative anaerobic genera. This protocol has allowed us to isolate and identify conjunctival species such as Corynebacterium spp., Coagulase Negative Staphylococcus spp., Streptococcus spp., etc. The approach is suitable to define commensal diversity in mice under different disease conditions.

Presented here is a protocol for the isolation and amplification of aerobic and facultative anaerobic mouse conjunctival commensal bacteria using a unique eye swab and culture-based enrichment step with subsequent identification by microbiological based methods and MALDI-TOF mass spectrometry.

Isolamento e identificazione congiuntivale dei commensali nei topi

The ocular surface was once considered immune privileged and abiotic, but recently it appears that there is a small, but persistent commensal presence. ...

Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular surface gland network. Meibomian glands (MG) secrete lipids that create a covering layer that prevents the evaporation of the aqueous part of the tear film. Neutrophils and extracellular DNA traps populate MG and the ocular surface in a mouse model of allergic eye disease. Aggregated neutrophil extracellular traps (aggNETs) formulate a mesh-like matrix composed of extracellular chromatin that occludes MG outlets and conditions MG dysfunction. Here, a method for inducing ocular surface inflammation and MG dysfunction is presented. The procedures for collecting organs related to the ocular surface, such as the cornea, conjunctiva, and eyelids, are described in detail. Using established techniques for processing each organ, the major morphological and histopathological features of MG dysfunction are also shown. Ocular exudates offer the opportunity to assess the inflammatory state of the ocular surface. These procedures enable the investigation of topical and systemic anti-inflammatory interventions at the preclinical level.

Ocular surface inflammation harms the ocular surface tissues and compromises vital functions of the eye. The present protocol describes a method to induce ocular inflammation and collect compromised tissues in a mouse model of Meibomian gland dysfunction (MGD).

Induzione dell'infiammazione della superficie oculare e raccolta dei tessuti coinvolti

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular ...

Un protocollo per isolare, coltivare e identificare le cellule di nicchia limbare umana

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used for LNCs isolation. The tissue was divided into 12 pieces under aseptic conditions and digested for 18 h at 37 &#176;C in the cell culture incubator using collagenase A to obtain cell clusters with LNCs and limbal&#160;epithelial progenitor cells. The cell clusters were further digested for 15 min at 37 &#176;C using 0.25% trypsin-EDTA to obtain single cells and then cultured in modified embryonic stem cell medium (MESCM) on a plastic surface coated with 5% Matrigel. Cells were passaged upon 70% confluence, and LNCs were identified using immunofluorescence, real-time quantitative PCR (qPCR), and flow cytometry. Primary LNCs were isolated and passaged more than 12 times. The proliferation activity of LNCs from P4 to P6 was the highest. LNCs expressed higher stem cell markers than BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, and PDGFR&#946;). Furthermore, results showed that P4 LNCs uniformly expressed VIM, CD90, CD105, and PDGFR&#946;, but not Pan-CK, which could be used as a marker for the identification of LNCs. Flow cytometric analysis showed that approximately 95%, 97%, 92%, and 11% of LNCs expressed CD73, CD90, CD105, and SCF respectively, while they were&#160;68%, 99%, 20%, and 3% in&#160;BMMSCs. The standard process for LNC&#160;isolation and identification could provide&#160;a reliable laboratory basis for the widespread use of LNCs.

Autore in primo piano: Standardizzazione dell'isolamento e della caratterizzazione delle cellule di nicchia limbare (LNC) per supportare la ricerca diffusa sui LNC 

Here, we present a protocol to isolate and identify the human limbal niche cells.

Isolamento e identificazione delle cellule di nicchia limbari

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. Disruption of OS would lead to keratitis, conjunctivitis or both (keratoconjunctivitis). In experimental animal models with certain genetic modifications or artificial operations, it is useful to examine all parts of the OS epithelial sheet to evaluate relative pathogenetic changes of each part in parallel. However, dissection of OS tissue as a whole without distortion or damage has been challenging, primarily due to the softness and thinness of the OS affixed to physically separate yet movable eyelids and eyeball. Additionally, the deep eye socket formed by the hard skull/orbital bones is fully occupied by the eyeball leaving limited space for operating dissections. As a result, direct dissection of the eyeball with associated OS tissues from the facial side would often lead to tissue damages, especially the palpebral and bulbar conjunctiva. In this protocol, we described a method to remove the skull and orbital bones sequentially from a bisected mouse head, leaving eyelids, ocular surface, lens and retina altogether in one piece. The integrity of the OS sheet was well preserved and could be examined by histology or immunostaining in a single section.

This protocol describes a method for the isolation of the mouse eyeball with eyelid, ocular surface, anterior and posterior segments in relatively intact position.

Isolamento di Intact EyeBall per ottenere tessuto di superficie oculare integrale per l'esame istologico e l'immunoistochimica

Ocular surface (OS) consists of an epithelial sheet with three connected parts: palpebral conjunctiva, bulbar conjunctiva and corneal epithelium. ...

Biologia

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin that is secreted by conjunctival goblet cells (CGCs) onto the ocular surface contributes to multiple ocular surface diseases. The elimination of exogenous sex hormones is essential to obtain consistent results during in vitro study of sex-based differences in CGCs. This paper describes a method to minimize the presence of exogenous hormones in the study of sex-based differences in CGCs while maintaining their physiological function. CGCs from postmortem human donors of both sexes were cultured from pieces of the conjunctiva in RPMI medium with 10% fetal bovine serum (FBS) (referred to as the complete medium) until confluency. Nearly 48 h before the start of the experiments, CGCs were transferred to RPMI medium without phenol red or FBS but with 1% BSA (referred to as phenol-red-free medium). The normal cellular function was studied by measuring the increase in intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) after carbachol (Cch, 1 x 10-4 M) stimulation using fura 2/acetoxymethyl (AM) microscopy. The result shows that CGCs maintained normal function in the phenol-red-free media after 48 h. No significant difference in [Ca2+]i response was observed between phenol red-free RPMI medium and complete medium upon Cch stimulation. Therefore, we recommend using the phenol-red free RPMI medium with 1% BSA to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of CGCs in the study of sex-based differences.

In Vitro Method to Study Sex-Based Differences in Conjunctival Goblet Cells

Phenol red-free/fetal bovine serum-free medium is a better option than advanced RPMI to eliminate exogenous hormones without altering the normal function of conjunctival goblet cells in the study of sex-based differences.

In vitro Metodo per studiare le differenze basate sul sesso nelle cellule caliciformi congiuntivali

Dry eye is a multi-factorial disease affecting ocular surface health, with a profoundly higher prevalence in women. Disruption of the gel-forming mucin ...

Un modo non invasivo per isolare e fenotipo le cellule della Conjunctiva

Riepilogo

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