このプロトコルは、超長いシーケンス配列を生成する能力の技術的なギャップを埋めます。ゲノミクスにおける現在の短期読み取りアプローチによって制限されているゲノムの複雑さを調べることができます。この方法は、性能、堅牢性、汎用性、および有望な新しいアプリケーションと統合する可能性においてユニークです。
それは異なった材料に適して、異なった即刻サイズのために変調することができる。この技術は、臨床環境に革命を起こす始めました。繰り返し膨張障害におけるその診断の有用性は多くの現在の欠点を克服した。
いくつかの移植登録は、より良い臨床結果のために高解像度HLAタイピングを利用しています。これらのメソッドは、フェージングや複雑な構造分散など、これまでアクセス不可能な長距離情報を提供します。単一のテストでエピジェネティック読み出しと相まって、精密医療を可能にします。
これは、多くの新しい技術を持つ長いプロトコルであり、最終的なシーケンシングまで動作しているかどうかを知るのは難しいです。サンプルを実行する前に、古いフローセルにロードする練習をすることをお勧めします。協力者は、いくつかの技術は短読のアプローチに比べて混乱していると言いました。
具体的には、高い品質、高分子量DNAによる抽出が緩やかである。HMW DNAの抽出を開始するには、まず、細胞懸濁液の200マイクロリットルを50ミリリットルチューブの10ミリリットルのリシスバッファーに加えます。その後、3秒間最高速度で渦を起こします。
そして、1時間摂氏37度で溶液をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、2マイクロリットルのRNS-Aをライセートに加える。50ミリリットルのチューブをそっと回してサンプルを混ぜ、摂氏37度で1時間インキュベートします。
インキュベーション後、フェノール-クロロホルム-イソアミルアルコール混合物のフェノール層の10ミリリットルをリセートに加える。そして、フュームフードの下に10分間、20 rpmで回転器の上にチューブを置きます。ゲルチューブで遠心分離した後、上清を新しい50ミリリットルチューブに慎重に注ぎます。
その後、25ミリリットルの氷冷100%エタノールを加え、DNAが沈殿するまでチューブを手で軽く回転させます。フックを作るために20マイクロリットルの先端を曲げる。フックを使用して、HMW DNAを慎重に取り出し、液体を落とします。
次に、70%エタノールの40ミリリットルを含む50ミリリットルのチューブにDNAを入れ、チューブを3回軽く反転してDNAを洗浄します。機械的剪断ベースのライブラリを準備するには、まず100ミリリットルの針を含まない注射器を使用して、すべてのDNAを熱望します。その後、注射器に27ゲージの針を置き、すべてのDNAを優しくゆっくりと皿に排出します。
29回繰り返します。次に、再懸濁された磁気ビーズの143マイクロリットルと143マイクロリットルのDNA修復反応混合物をチューブに加える。チューブを6回フリックして穏やかに混ぜ、20rpmの回転器に30分間チューブを置きます。
チューブを室温で2秒間遠心分離し、サンプルをスピンダウンし、チューブを磁気ラックに10分間置きます。次に、チューブがラック上にある間に上清を捨てます。400マイクロリットルの作りたての70%エタノールを加えます。
30 秒間待ちます。その後、エタノールを除去します。次いで、チューブを1000Gで室温で2秒間遠心し、試料を回転させます。
チューブを磁気ラックに戻し、残留エタノールを取り除きます。ペレットを30秒間エアドライします。次に、マグネットラックからチューブを取り外し、103マイクロリットルのT-Eバッファを追加します。
次に、ビーズがバッファーに覆われていることを確認するためにチューブを軽くフリックし、30分間室温で回転器にチューブを置きます。最後に、チューブを磁気ラックに10分間戻してビーズをペレットにします。P200ワイドボアチップを使用して溶出液の100マイクロリットルを0.2ミリリットルチューブに移し、dA-tailingおよびアダプタライゲーション反応を終了修復に進みます。
トランスポザーゼ断片化ベースのライブラリを調製するために、まず、HMW DNAの22マイクロリットル、10ミリモルトリスの1マイクロリットル、pH 8、0.02%トリトンX-100、断片化ミックスの1マイクロリットルを0.2ミリリットルチューブに加えてDNAタグメント反応を行う。次に、P200ワイドボアチップを使用して反応を6回混合し、摂氏30度で1分間インキュベートし、続いて摂氏80度で1分間インキュベートします。摂氏4度で保持します。
最後に、P200ワイドボアチップを使用して、反応を1.5ミリリットルのチューブに移し、1マイクロリットルのラピッドアダプターミックスを素早く追加します。P200ワイドボアチップを使用して、反応を6回混合します。反応を室温で1時間インキュベートし、シーケンシングに進みます。
シーケンスを開始するには、まず Nanopore デバイスのチャネルの 1 つに新しいフローセルを挿入します。次に、付属のシーケンス制御ソフトウェアで、フローセルの位置ボックスを確認します。正しいフローセルタイプを選択し、チェックフローセルのワークフローをクリックします。
[テスト開始]ボタンをクリックして、フローセルQC解析を開始します。次に、P1000ピペットを100マイクロリットルに設定して、30マイクロリットル未満のバッファーを引き戻し、フローセルから気泡を除去する。気泡を導入しないようにプライミングポートの上部をカバーするためにプライミングミックスの30マイクロリットルを追加します。
次いで、プライミングポートにプライミングミックスのピペット800マイクロリットルをフローセルをロードする。約50マイクロリットルのプライミングミックスが残っている場合は先端を取り出し、残りのプライミングミックスをプライミングポートの上部に追加します。次に、P1000ピペットを使用して、フローセルにプライミングミックスの200マイクロリットルを加えます。
次に、ロードの直前に、80マイクロリットルに設定されたP200ピペットを使用して、DNAライブラリを6回上下にピペットします。最後に、ライブラリミックスをサンプルポートを通してフローセルにドロップワイズロードし、シーケンス処理とデータ分析に進みます。機械的剪断ベースのライブラリ構築に対応できるDNAのQC分析により、約1.9の純度比は260~280、260~230の比は約2.3で、良好なDNAサンプルを示しました。
同じ結果は、DNAレディ・フォー・トランスポザーゼ断片化ベースのライブラリ構築を使用して見られた。パルスフィールドゲル電気泳動による針状HMW DNAのサイズ品質管理は、HMW DNAの大部分が50キロベースより大きいことを示した。HG00733セルを用いた4回の実行の結果は、機械的剪断ベースのライブラリのN50がトランスポザーゼ断片化ベースのライブラリよりも短いことを示した。
また、4つのランはすべて100キロベースを超える長さの2300以上の読み取り値を持っていました。トランスポザーゼ断片化ベースのライブラリでは、機械的なせん断ベースのライブラリと比較して、準備時間が短い長さが最大長でした。機械的せん断ベースのライブラリは、トランスポザーゼの断片化ベースのライブラリと比較して、より多くの総読み取りを生成し、より高い収率を示しています。
両方のライブラリは一貫した高品質を示し、その総塩基の97%以上がヒト参照ゲノムと一致していた。予想されるサイズ分布は、4つのランすべてが50キロベースを超えるデータの割合が大きく、トランスポザーゼの断片化ベースのライブラリは超長い読み取りの比率が高いことを示しました。全体的な目標はDNAをそのまま維持することですので、DNAの過酷な取り扱いを避けることが重要です。
メソッドの値を最大化できる重要な要因は、計算分析です。私たちのチームは、高感度でSVの全範囲を検出できるPICKYと呼ばれる長時間読み取り分析パイプラインを開発しました。これは、複雑なSVを検出し、単一分子レベルでの再調整や修正を行うなどのエキサイティングな分野への新しい道を開きます。
これはゲノムアーキテクチャの理解を大きく向上させます。フェノールは非常に腐食性です。手袋、安全メガネ、ラボコート、ロングパンツ、シューズなど、個人的な保護具を備えたヒュームフードで作業する必要があります。
