Name: application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm
Uploaded: 2020-11-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
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ジュリオ・ディ・ミン博士のphaESCラインの誘導、フローサイトメトリー手術のレモ・フライマン博士に感謝します。また、ミシェル・シャフナー氏とトーマス・M・ヘネク氏が胚移植に関する技術支援を行ったことを認めます。この研究は、スイス国立科学財団(助成金31003A_152814/1)によって支援されました。

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著者らは開示するものは何もない。

体細胞核移動による哺乳類のクローニング(SCNT)は、1990年代、20年、21年に開拓された。これらの開発は、両生類22で30年前に行われたクローニング研究に続いた。かなりの遅延は、哺乳類における発生学およびゲノム刷り込みの難しさを反映している。哺乳類SCNTの開発は、精子を置換するためのhaESCの適用の基礎であり、このプロトコルで詳述されている。
セル周期同期は、SCNT23の成功の重要な要素です。これは、このプロトコルでのhaESCの注入の場合でもあります。レシピエントにドナーゲノムを導入するには、染色体破損や胚の発達を損なう無数化を避けるために、細胞周期相を一致させる必要があります。セミクローニングは、2つのゲノムと細胞トップラストに互換性を持たねねねなくてはないほど複雑です。以前の報告では、M相逮捕アンドロジェネティックhaESCの注入は、卵母細胞へのG1相haESCの注入よりも半クローン胚のより良い発達率をもたらしたことを実証した7。このレポートは、セミクローニングに適した同期点としてM-phaseを提案します。したがって、ファエスクは、デメコルシンとのメタフェーズでマイトサイト的に逮捕され、MII卵母細胞の卵母斑に注入され、これは自然にマイオシスのメタフェーズIIで逮捕された。重要なことに、M相停止は、ドナーとレシピエント細胞サイクル間の優れた同期を提供し、高効率のマウスESCで達成することができます。
有糸分裂の間、核膜は分解し、複製された染色体が付着する紡錘の形をする。M相DKO-phaESCを注入した後、姉妹クロマチは擬似極体とザイゴテ7 に分離される(図3E)。その結果、DKO-phaESCからの染色体の単一のセットは、半クローン胚に寄与する。DKO-phaESC染色体の姉妹染色体は、注射後に正しく分離できることが重要です。無傷のDKO-phaESCの原形質膜は、疑似極性体への分離を防ぎます。DKO-phaESCの原形質膜が破裂せず、胚が注射後に卵母質に無傷のDKO-phesCを示した稀な症例を実際に観察した(図3D)。したがって、ピペット処理によってDKO-phaESCの原形質膜を除去するために注意する必要があります。注射中に、卵母細胞の大腸スピンドルの破壊を避けることも同様に重要であり、染色体分離欠陥を引き起こし、異数化を誘発する可能性もある。
哺乳類では、ゲノムインプリンティングは、精子置換としてのファセスクの適用を制限する。パルテノジェネティックhaESCはゲノムインプリントの母体構成を有し、精子は父親の構成を有する。したがって、精子置換として野生型ファセスクを注射した後、完全な期間の子犬の生成は起こっていない。この制限を克服するために、IG-およびH19-DDRの欠失はファエックで設計される。母体Igf2-H19およびGtl2-Dlk1 lociにおけるインプリント発現の修飾は、転写された2細胞胚に基づいて、5.1%以上の頻度を有する半クローンマウスの生成を可能にするゲノムインプリントの構成を変更するのに十分である。これらの観察は、2つのインプリントされた遺伝子を標的とすることで、phaESCのゲノムをマウスの精子に置き換えることができる機能的な父方構成に切り替えることを示唆している。それにもかかわらず、この戦略にはphaESCの恒久的な遺伝子組み換えが必要です。代替戦略として、アンドロジェネティックhaESCを検討することができます。アンドロジェネティックなHAESCは、精子ゲノムに由来し、父方のインプリントを所有しています。野生型アンドロジェネティックhaESCが精子置換術として寄与し、移された胚4、7、24の1.3%から1.9%の頻度で全期の子犬を生成したという報告がある。フルタームの子犬はまた、IGの欠失を伴うアンドロジェネティックなhaESCを注入することによって得られた - とH19-DDRは、移された2細胞胚の20.2%の頻度で24。改変アンドロジェネティックhaESCを用いたセミクローニングの効率の向上は、インプリントが培養中に不安定になる可能性があるためである可能性が高い。刻印欠陥は、重要なDDRの遺伝的欠失によって修正される。
卵母細胞や精子のゲノムに遺伝子組み換えを直接導入するのが難しいので、haESCは親のゲノムを別々に操作するための貴重なツールです。精子の代用としてhaESCを使用すると、マウス生殖細胞系列におけるゲノム編集に顕著な利点をもたらします。最近の研究では、CRISPR/Cas9ベースのゲノム編集と、胚発生に不可欠なインプリンティング領域の特性評価のためのhaESCの応用を組み合わせたものであった12。本研究では、母性マウスの開発におけるH19-およびIG-DMRとの組み合わせにおけるRasgrf1-DMRの役割と、卵子子の発達における7つの異なるDMRの機能を分析した。精子に対するhaESCの置換方法は、原始胚芽細胞の発達におけるDND1タンパク質内の主要アミノ酸を同定し、骨発達24、25、26における遺伝子を同定するための遺伝子スクリーニングアプローチの基礎を形成した。胚発生の重要な要因を特定するためのゲノムインプリンティングと遺伝子スクリーニングに関する研究は、haESCをガメティックゲノムとして適用するためのかなりのアプローチです。

哺乳類では、次世代に遺伝情報を伝達する唯一の細胞である。卵母細胞と精子の融合は、成虫動物に発達するジプロイドジゴテを形成する。ガメティックゲノムの変異は、それによって子孫によって継承され、種1の遺伝的変異を駆動する。生殖細胞系列の変異の導入は、遺伝子機能の特徴付けや疾患モデリングを含む多様な生物学的研究のための遺伝子組換え動物を生産するために適用されている。卵母細胞と精子の両方が末端分化され、増殖を停止した高度に特殊化された細胞です。そのため、ディステットの直接改変は技術的に難しく、特殊なアプローチが開発されている。遺伝子組み換えは、遺伝子組み換えESCを胚盤胞に注入することによってマウス生殖細胞系列に導入され、そこで発達中の胚に統合され、生殖細胞系列を植民地化する。また、CRISPR/Cas9システムを含むゲノム編集手法を用いた接合体の遺伝子改変が広く採用されている。
近年、ゲーミティックゲノム3、4、5、6、7、8の代替としてhaESCを適用する顕著なアプローチが報告されている。HaESCsは、パルテノジェネティックまたはアンドロジェネティックハプロイド胚盤胞の内側の細胞塊に由来する幹細胞株であり、染色体4、7、9、10の単一のセットを有する。また、検体ゲノムとアンドロジェネティックhaESCの両方が、卵母細胞への細胞質内注射後に半クローンマウスのゲノムに寄与することが実証されている。他のアプローチとは対照的に、haESCのゲノムは自己再生能力のために培養中に直接改変することができる。精子をhaESCsに置き換えることによって生殖細胞系列に遺伝子組換えを導入することは、生物学的研究にとって重要な方法です。これは、それぞれパルテノジェネティックまたはアンドロジェネティックhaESCに由来する母体または父方のゲノムを分離して培養し、操作する可能性を提供します。その後、HaESCは、ゲノムインプリンティング、アレーレ特異的発現、および親固有のプロセスの研究に特に有利な、ガメティックゲノム置換として使用することができます。
マウスでは、正常胚発生11には母体と父方のゲノム情報の両方が必要である。したがって、精子ゲノム5,8を置換するために野生型パルテノジェネティックhaESC(phaESC)を注入した場合、完全な子犬は得ることができなかった。この発達ブロックを克服するためには、パルテノジェネティックhaESCの母体ゲノムのゲノム刷り込みは、父方の構成に修正する必要があります。これは、微分メチル化領域(DDR)の操作によって達成することができる。現在までに、H19-DMR、Gtl2-Dlk1 IG-DMR、およびRasgrf1-DMRの標的欠失が、phaESC3、5、8、12において母体的に発現した遺伝子を抑制することを研究されてきた。 これらの研究は、H19-DMRとIG-DMRの両方の欠失は、精子染色体の代わりにすることができる父方のインプリント構成に母親を変換するのに十分であることを実証した。卵母細胞に2つのDMR欠失を運ぶphaESCの細胞内皮注入は、移された2細胞胚の5.1%から15.5%の頻度を有する半クローンの子犬を生み出した。
このプロトコルは 、H19-DMR と IG-DMR の両方を削除した phaESC の適用に基づいています。我々は、DKO-phaESCラインを確立するためのファエスクにおけるゲノムインプリンティングの改変、精子ゲノムの代替として卵母細胞へのDKO-phesCの注入、半クローン胚の培養、半クローンマウスの取得に関する詳細な指示を提供する。このプロトコルは、父親のゲノムの正確かつ直接的な操作と半クローン胚およびマウスの生成を必要とする研究者のための参照である。

<table><tbody><tr><td>1.5 mLTube</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>15 ml Tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>150628</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol</td><td>Merck</td><td>M6250</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>BSA fraction</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>CHIR 99021</td><td>Axon</td><td>1386</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Demecolcine solution</td><td>Merck</td><td>D1925</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DMEM / F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DR4 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3208</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E5134</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>FBS</td><td>biowest</td><td>S1810-500</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Freezing medium</td><td>amsbio</td><td>11897</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Merck</td><td>G1890</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Hepes solution</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Irradiated MEF</td><td>Gibco</td><td>A34966</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>LIF (Leukemia inhibitory factor)</td><td>(Homemade)</td><td>-</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Lipofection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>NDiff 227</td><td>Takara</td><td>Y40002</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>PD 0325901</td><td>Axon</td><td>1408</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene</td><td>Addgene</td><td>#40973</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>piggyBac transposase plasmid</td><td>System Biosciences</td><td>PB210PA-1</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX330 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#42230</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>pX458 plasmid</td><td>Addgene</td><td>#48138</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>haESC culture</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549S</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0192</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Merck</td><td>109634</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Axon</td><td>A3830</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Merck</td><td>71729</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>106404</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>ThermoMixer</td><td>Epeendorf</td><td>5384000012</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merck</td><td>T1503</td><td>Genotyping</td></tr><tr><td>5 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>5 mL Tube with cell strainer cap</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios EQ</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td>Flow cytometry</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Codan</td><td>62.1640</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>30-gauge 1/2 inch needle</td><td>Merck</td><td>Z192362-100EA</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>B6D2F1 mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>100006</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>hCG</td><td>MSD animal health</td><td>49451</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010015</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Avivasysbio</td><td>OPPA1037 5000 IU</td><td>Superovulation</td></tr><tr><td>10-cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>179830</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>6 cm dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Center-well dish</td><td>Corning</td><td>3260</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Digital rocker</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880020</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>AppliChem</td><td>A0878</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Merck</td><td>H4272</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>KSOM</td><td>Merck</td><td>MR-020P-5F</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M16 medium</td><td>Merck</td><td>M7292</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>M2 medium</td><td>Merck</td><td>M7167</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Merck</td><td>M8410</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Merck</td><td>P1049-1PAK</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>Strontium chloride</td><td>Merck</td><td>13909</td><td>Embryo manipulation</td></tr><tr><td>5ml syringe</td><td>Codan</td><td>62.5607</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Borosilicate glass cappilary</td><td>Science product</td><td>GB100T-8P</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>CellTram 4r Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Fluorinert FC-770</td><td>Merck</td><td>F3556</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Holding pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-U</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microinjection pipette</td><td>BioMedical Instruments</td><td>-</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Microlaoder tips</td><td>Eppendorf</td><td>5252 956.003</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micromanipulaor arms</td><td>Narishige</td><td>NT-88-V3</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PiezoXpert</td><td>Eppendorf</td><td>5194000016</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>PVP (Polyvinylpyrrolidine)</td><td>Merck</td><td>PVP360</td><td>Microinjection</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>SARSTEDT</td><td>83.1826.001</td><td>Microinjection</td></tr></tbody></table>

application of mouse parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute of sperm

性生殖を伴う生物では、生殖細胞は新しい個体に発達する全能性細胞の源である。マウスでは、精子によって卵母細胞の受精は、トーティポテンスの接合子球を作成します。最近、ハプロイド胚性幹細胞(haESC)がガミスティックゲノムの代用となり、マウスに発達する胚に寄与することが報告されています。ここでは、卵母細胞への細胞質注入によって胚を構築する精子の代替としてパルテノジェネティックhaESCを適用するプロトコルを提示する。このプロトコルは、精子置換としてhaESCを調製するためのステップ、卵母細胞へのhaESC染色体の注入、および半クローン胚の培養のためのステップで構成される。胚は、胚移植後に肥沃な半クローンマウスを生み出すことができる。精子置換にHAESCを用い、生殖細胞のゲノム編集、胚発生の研究、ゲノムインプリンティングの研究が容易になります。

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Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

この記事は、半クローン胚の構築のための精子の代わりにパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の使用を実証することを目的としています。

マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

application-mouse-parthenogenetic-haploid-embryonic-stem-cells-as

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4.5K ビュー.  ETH Zurich. この記事は、半クローン胚の構築のための精子の代わりにパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の使用を実証することを目的としています。

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Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

遺伝子組み換えマウスの高効率生産のための凍結解凍胚の使用

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

遺伝学

CRISPR/Cas9-Mediated Highly Efficient Gene Targeting in Embryonic Stem Cells for Developing Gene-Manipulated Mouse Models

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the efficiency in developing gene-knockout mice by inducing small indel mutation would be sufficient enough, the efficiency of embryo genome editing for making large-size DNA knock-in (KI) is still low. Therefore, in contrast to the direct KI method in embryos, gene targeting using embryonic stem cells (ESCs) followed by embryo injection to develop chimera mice still has several advantages (e.g., high throughput targeting in vitro, multi-allele manipulation, and Cre and flox gene manipulation can be carried out in a short period). In addition, strains with difficult-to-handle embryos in vitro, such as BALB/c, can also be used for ESC targeting. This protocol describes the optimized method for large-size DNA (several kb) KI in ESCs by applying CRISPR/Cas9-mediated genome editing followed by chimera mice production to develop gene-manipulated mouse models.

Here we present a protocol for developing genetically modified mouse models using embryonic stem cells, especially for large DNA knock-in (KI). This protocol is tuned up using CRISPR/Cas9 genome editing, resulting in significantly improved KI efficiency compared with the conventional homologous recombination-mediated linearized DNA targeting method.

CRISPR/Cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発

The CRISPR/Cas9 system has made it possible to develop genetically modified mice by direct genome editing using fertilized zygotes. However, although the ...

発生生物学

<meta charset="utf8"></head><body>胚発生を研究するためのマウスラウンド精子細胞注入手順

Mouse Round Spermatid Injection

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of round spermatid injection (ROSI), oocytes can be successfully fertilized and developed into viable fetuses. In a groundbreaking milestone achieved in 1995, the first mouse fetus was born through ROSI technology. ROSI has since emerged as a pivotal tool for unraveling the intricate mechanisms governing embryonic development and holds significant potential in various applications, including the acceleration of mouse generation and the production of genetically modified mice. In 1996, a milestone was reached when the first human fetus was born through ROSI technology. However, the clinical applications of this method have shown a fluctuating pattern of success and failure. To date, ROSI technology has not found widespread application in clinical practice, primarily due to its low birth efficiency and insufficient validation of fetal safety. This article provides a comprehensive account of the precise methods of performing ROSI in mice, aiming to shed new light on basic research and its potential clinical applications.

<meta charset="utf8"></head><body>マウスラウンド精子細胞注射

Here, we introduce a method for performing round spermatid injection (ROSI) in mice, a technique with promising clinical applications and utility for investigating the mechanisms underlying embryonic development.

マウスラウンド精子細胞注射

Round spermatids, characterized by their haploid genetic content, represent the precursor cells to mature spermatozoa. Through the innovative technique of ...

<meta charset="utf8"></head><body>ICSI-ETマウスモデルによる糖代謝への長期的影響の研究

Monitoring Blood Glucose in Mouse Offspring After Intracytoplasmic Sperm Injection

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life roughly equivalent to 40 human years. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) is a commonly used assisted reproductive technology in clinical practice. However, given its relatively recent emergence about 30 years ago, the long-term effects of this technique on human development remain unclear. In this study, we established the ICSI combined with embryo transfer (ET) method using a mouse model. The results demonstrated that normal mouse sperm, after undergoing in vitro culture and subsequent ICSI, exhibited a fertilization rate of 89.57% and a two-cell rate of 87.38%. Following ET, the birth rate of offspring was approximately 42.50%. Furthermore, as the mice aged, fluctuations in glucose metabolism levels were observed, which may be associated with the application of the ICSI technique. These findings signify that the mouse ICSI-ET technique provides a valuable platform for evaluating the impact of sperm abnormalities on embryo development and their long-term effects on offspring health, particularly concerning glucose metabolism. This study provides important insights for further research on the potential effects of the ICSI technique on human development, emphasizing the necessity for in-depth investigation into the long-term implications of this technology.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:細胞質内精子注入の子孫に対する長期的な健康への影響の調査

Here, we present a protocol to establish an intracytoplasmic sperm injection (ICSI)-embryo transfer (ET) mouse model, allowing us to observe age-related changes in glucose metabolism that may be attributed to ICSI, providing insights into its potential long-term impacts on human development.

細胞質内精子注入後のマウス仔の血糖値のモニタリング

Human lifespan is considerably long, while mouse models can simulate the entire human lifespan in a relatively short period, with one year of mouse life ...

シングルセルシーケンシングのためのGastrulating Mouse Embryoの単離とジェノタイピング

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states within samples. Before single-cell advances, the feasibility of capturing the dynamic cellular landscape and rapid cell transitions during early development was limited. In this paper, a robust pipeline was designed to perform single-cell and nuclei analysis on mouse embryos from embryonic day E6.5 to E8, corresponding to the onset and completion of gastrulation. Gastrulation is a fundamental process during development that establishes the three germinal layers: mesoderm, ectoderm, and endoderm, which are essential for organogenesis. Extensive literature is available on single-cell omics applied to wild-type perigastrulating embryos. However, single-cell analysis of mutant embryos is still scarce and often limited to FACS-sorted populations. This is partially due to the technical constraints associated with the need for genotyping, timed pregnancies, the count of embryos with desired genotypes per pregnancy, and the number of cells per embryo at these stages. Here, a methodology is presented designed to overcome these limitations. This method establishes breeding and timed pregnancy guidelines to achieve a higher chance of synchronized pregnancies with desired genotypes. Optimization steps in the embryo isolation process coupled with a same-day genotyping protocol (3 h) allow for microdroplet-based single-cell to be performed on the same day, ensuring the high viability of cells and robust results. This method further includes guidelines for optimal nuclei isolations from embryos. Thus, these approaches increase the feasibility of single-cell approaches of mutant embryos at the gastrulation stage. We anticipate that this method will facilitate the analysis of how mutations shape the cellular landscape of the gastrula.

著者スポットライト:系統特異的変異胚をシングルセル分解能で解析するパイプライン

This paper establishes a pipeline for high-quality single-cell and nuclei suspensions of gastrulating mouse embryos for sequencing of single cells and nuclei.

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

マウスパルテノジェネティックハプロイド胚性幹細胞の精子代替としての応用

要約

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遺伝子組み換えマウスの高効率生産のための凍結解凍胚の使用

CRISPR/Cas9を介した胚性幹細胞における高効率遺伝子ターゲティングによる遺伝子操作マウスモデルの開発

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

マウスラウンド精子細胞注射

細胞質内精子注入後のマウス仔の血糖値のモニタリング

細胞質内精子注入後のマウス仔の血糖値のモニタリング

細胞質内精子注入後のマウス仔の血糖値のモニタリング

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで

変異体全マウス胚のシングルセルRNAシーケンシング:胚盤葉上から胃腸終末まで