culturing의 하루 전에 준비 : <ul><li> 무균 해부 솔루션 (DS)를 준비합니다. </li><li> NBM/B27 (B27 보충제로 Neurobasal Mediom)를 준비합니다. </li><li> 필요한 경우 압력솥 ddH 2 O가 있으며, 유리 coversilps을 소독. </li><li> 폴리 - D - 라이신과 코트 조직 문화 요리 또는 유리 coverslips. </li></ul> 폴리 - D - 라이신 코팅 : 무균 조건 하에서 culturing 전에 하루를 준비합니다. <ul><li> 얼음 10X PDL 장소의 해동의 나누어지는. </li><li> PDL 1 ML 9 ML 살균 울트라 필터 물을 추가하고 (1X) 잘 섞는다. </li><li> 다음과 같이 실온에서 하룻밤 1X PDL로 코트 표면 : <ul><li> 유리 coverslips (Bellco 유리 주식 회사 캣 # 1943-00012.) : 75 μl / coverslip 또는 </li><li> 24 잘 문화 플레이트 : 잘 300 μl / 또는 </li><li> 35mm 문화 요리 : 1ml/dish </li></ul></li><li> 멸균 물 (액체를 대기음으로 살균 파스퇴르 pipettes를 사용)으로 5 배 헹굼. </li><li> 표면이 완전히 건조 될 때까지 물을 제거합니다. </li></ul> Culturing 절차 (무균 조건 하에서 층류 후드에서 수행) <ol><li> 슈퍼 접착제를 사용하여 마이크로톰 Vibraslicer (캠덴 인 스트 루먼트 (주))의 지원 블록에 한천과 접착제 그것 블록을 잘라 버릴거야. </li><li> 늦은 배아 단계 (E17 - 18) 마우스 fetuses, euthanise ​​댐을 사용하는 경우, 배아 자루에서 자궁 무료 개인 fetuses를 제​​거합니다. 플레이스 멸균 페트리 접시에 fetuses 계속은 아래에 설명했다. </li><li> 참살 마우스 태아 또는 펍 (귀하의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회의 승인에 따라 지침). </li><li> 감기 DS 가득한 60mm 배양 접시에있는 왓먼 필터 종이 디스크에 피부와 두개골과 장소의 두뇌를 제거합니다. </li><li> 멸균 면도날을 사용하여 소뇌를 잘라. </li><li> 주걱을 사용하여 두뇌를 들고 필터 종이에 여분의 액체를 배수, 다음 장소에서 Vibraslicer 지원 블록과 접착제의 뇌 (꼬리 쪽 위쪽 및 한천에 직면하고 복부 부분)에 머리를 전송할 수 있습니다. </li><li> 감기 DS와 챔버를 입력합니다. 8-9로 속도 선택을 설정합니다. </li><li> 후각 망울에서 시작, 200-400 μm의 섹션을 잘라 버릴거야. Vibraslicer의 날개가 피질를 입력하면, 600μm 코로나 섹션을 절단 시작합니다. P0 마우스 두뇌 4-5 사용 가능한 조각 산출 동안 E17 - 18 마우스 두뇌는 일반적으로 3-4 사용 가능한 조각 산출. </li><li> 10 ML 유리 파스퇴르 pipet을 취소 - 연결의 리버스 엔드를 사용하여 DS 2 분류 35mm 페트리 접시에 뇌 조각을 전송합니다. </li><li> 피질을 절개하다 및 모세관 튜브에서 나온 유리 바늘을 사용하여 meninges를 제​​거합니다. </li><li> 작은 조각, 길이 0.5-1 mm로 대뇌 피질의 rinds 컷. </li><li> 0.2 μm의를 통해 필터 ES는 35mm 페트리 접시에 5 CC 주사기에 부착된 필터. </li><li> 필터 ES를 포함하는 페트리 접시에 대뇌 피질의 조직 조각을 전송합니다. </li><li> 37 ° C 30 분 알을 품다. </li></ol> 그 동안에 : <ol><li> 후드, Vibraslicer 및 해부 도구를 청소하십시오. </li><li> 60mm 페트리 접시에 따뜻한 NBM/B27 5 ML을 추가합니다. </li></ol> 30 분 후. 부화 : <ol><li> 10 ML의 DS에 조직을 전송합니다. 1 분에 대한 청산하자. </li><li> 첫째 안녕 튜브 소용돌이 모양으로 조직을 전송 후 2-3 분 쉬라 구. </li><li> 초 하이로 전송합니다. 위에서 반복합니다. </li><li> 첫째 리로 전송합니다. 위에서 반복합니다. </li><li> 둘째 리로 전송합니다. 위에서 반복합니다. </li><li> 셋째 리로 전송합니다. 위에서 반복합니다. </li><li> 미디어와 60mm 요리에 조직을 전송합니다. </li></ol> 해부 현미경 아래에서 : <ol><li> 깨끗한 조직의 파편과 부드럽게 조직을 느슨하게하기 위해 가져온 유리 pipet (구멍 크기를 감소 사용)을 통과하여 각 조각을 씹다. </li><li> NBM + B27의 나머지 부분을 (. - 35mm 요리 부드럽게 믹스 및 정착에 조직의 대형 조각 기다리는 5 24 잘 접시 또는 11 ML 13 ML 총 만들기)이있는 15 ML 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 전송 세포 현탁액 (24 잘 접시 또는 2 ML / 35mm 문화 요리 / 음 0.5 ML). </li><li> 유리 coverslips를 사용하는 경우, coverslip 당 80 μl 세포 현탁액을 추가하고 세포가 더 많은 NBM​​/B27 미디어 챔버 홍수 전에 준수하는 조직 문화 인큐베이터에서 1 시간을 허용합니다. </li><li> 37 ° C와 5% CO 2의 문화를 유지합니다. </li></ol> 내일 24 잘 플레이트 (cNBM/B27; cNBM/B27 매체의 준비 프로토콜 아래에 나타납니다) NBM/B27 매체를 갖추 0.5 ML 이외의 연결을 세포와 각 잘 피드 35mm 요리 : cNBM/B27 매체 0.5 ML를 교체하십시오. 신선한 cNBM/B27 모든 2~3일과 매체의 0.5ml을 대체하여 문화를 유지합니다. 문화 미디어가 glia 세포의 증식을 촉진하지는 않지만, 문화가 필요한 경우 추가로 glial 세포의 수를 줄이기 위해 문화의 일 3-5에서 5μM FDU (5 - 플루오로 - 2&#39; - deoxyuridine, 시그마 F0503)로 치료하실 수 있습니다. SET<html> - UP 해부 문화 70 % EtOH에서 해부 도구를 소독하거나 압력솥 : <ul><li> 가위 (med. 작은) Spatulas (med. 작은) </li><li> 핀셋 (med. 작은) 면도날 </li><li> vibraslicer 버퍼 목욕 블레이드 </li><li> 두뇌를위한 블레이드 지원 작은 금속 웨지 </li></ul> 기타 자료 : <ul><li> 페트리 요리 (60 ㎜) </li><li> 페트리 요리 (35 ㎜) </li><li> 필터 용지 </li><li> 유리 pipet 10 ML </li><li> 멸균 일회용 pipets, 5,10, 25 ML </li><li> 주사기 필터, 0.2 μm의 </li><li> 주사기 5 CC </li><li> 원심 분리기 튜브 15 ML </li><li> 무균 파스퇴르 유리 pipets </li><li> PDL 코팅 문화 요리 또는 유리 coverslips </li></ul> 라벨 육 15 ML의 원심 분리기 튜브와 준비를 따르십시오 : 지하철 # 1 : 효소 솔루션 : 포함 5 ML의 DS에 papain (워싱턴 LS 03,126) 50 U를 추가합니다 <ul><li> L - cystein의 100μl (0.8mg) </li><li> 7 μl 0.1N NaOH </li><li> 50 μl APV (5mM) </li></ul> 취소하고 실온에서 솔루션을 둡니다. 그 효소 솔루션은 처음에는 &#39;흐리고&#39;표시 및 사용하기 전에 명확해야합니다합니다. 튜브 # 2 &amp; # 3 : 히 효소 억제제 : 3 ML DS + 300 μl BSA / 티 + 30 μl APV (5mM). 거품을 피하기 위해 부드럽게 믹스 살다가 두 1.5ml aliquots로 나눕니다. 튜브 # 4 - # 6 : 낮음 효소 억제제 : 8 ML DS + 80 μl BSA / 티 + 80 μl APV (5mM). 거품을 피하기 위해 부드럽게 믹스 세 2.6 ML aliquots로 나눕니다. 플레이스 튜브 얼음이 # 6을 통해 # 2 번호. 튜브 # 1 (효소 솔루션) 실온에서 둡니다. 솔루션과 ALIQUOTS <ul><li> 솔루션 A (살린 버퍼) 시그마 공식 WT 500 ML [CONC.] </li><li> 염화나트륨 (소금) NaCl S - 9625 58.45 80.0g 137mM </li><li> 염화칼륨 KCl P - 4504 74.56 4.0g 5.4mM </li><li> 나트륨 인산 이염 무수 나 2 HPO 4 S - 0876 142.0 0.24g 0.17mM </li><li> 인산 칼륨 일염기의 무수 KH 2 PO 4 P - 5379 136.09 0.3g 0.22mM </li></ul> 400 ML 울트라 필터링 물에 용해까지 모든 재료와 혼합을 나가는거야. 500 ML에 마지막으로 볼륨을 가져와. 깨끗한 병에과 압력솥에 넣습니다. 4 ° C 보관 및 레이블 &quot;DS 솔루션&quot;. <ul><li> 솔루션 B (Hepes) 시그마 공식 WT 250 ML [CONC.] </li><li> Hepes Hepes H - 3375 283.3 20.97g 9.9mM </li></ul> 200 ML에 울트라 필터 물을 추가합니다. 해산까지 믹스 250 ML에 최종 볼륨을 가지고. 깨끗한 병에과 압력솥에 넣습니다. 4 ° C 보관 및 레이블 &quot;DS 솔루션 B&quot;. <ul><li> 워킹 솔루션 500 ML [CONC.] </li><li> 울트라 여과 물 400 ML </li><li> 증권 솔루션 25 ML </li><li> 증권 솔루션 B 14 ML </li><li> D (+) - 포도당 시그마 G - 8270 3.0 g 33.3mM </li><li> 자당 시그마 S - 0389 7.5 g 43.8 MM </li></ul> 1N NaOH와 7.4으로 산도를 조정합니다. 울트라 여과 물 500 ML에 마지막으로 볼륨을 가져와. 깨끗한 유리병과 압력솥에 가만히 따르다. 4 스토어 ° C. 라벨 &#39;분석 해 봅시다 솔루션 &quot;. 폴리 - D - 라이신 준비 : <ol><li> 1mg/ml에서 무균 H 2 O에서, 폴리 - D - 라이신의 10X 재고 솔루션 (시그마 P - 7280 PDL)를 준비합니다. </li><li> 1.0 ML의 aliquots을 만듭니다. 이 솔루션은 최대 3 개월까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 미디어 <ol><li> 의 10ml 추가 B - 27 보충 (Gibco 17504-044) 500 ML의 NBM 병 (Neurobasal 매체, Gibco 21103-049)에 적용됩니다. </li><li> 4 40 ML aliquots하고 저장하십시오 ° C. </li></ol> APV <ol><li> 10 MG APV의 유리병 10 ML 살균 H 2 O를 추가 (2 - 아미노 -5 - phosphonopentanoic 초산, 시그마 A - 5282)과 철저히 섞는다. </li><li> -20 ° C.에 180 μl aliquots 및 상점 준비 </li></ol> BSA / 티 <ol><li> 10 ML의 DS에 1g BSA (보빈 알부민. 시그마 A - 7030)과 1g 트립신 억제제 (시그마 T - 9253)을 디졸브. </li><li> 1N NaOH와 7.4으로 산도를 조정합니다. </li><li> 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 필터링하여 소독. </li><li> -20 ° C. 400 μl aliquots 및 저장소로 나눌 </li></ol> L - 시스테인 Eppendorf 튜브에 200 μl DS에 0.​​6 MG L - 시스테인 (시그마 C - 7755)를 해산. 한천 (4 %) <ol><li> 100 ML 멸균 물의 Bacto 아가르 4 G (Difco 0140-01)을 디졸브. 문화 필요한 ° C까지 4 계속. </li><li> 전자 아가르는 35mm 페트리 접시 녹으 입력합니다. 진정 및 중합에 앉아 보자. </li></ol> PAPAIN (워싱턴 LS 03,126) NUNC 문화 병에 e_title &quot;&gt; 비상의 연결을 문화 코팅 문화 병 (4 Nunc 병) <ol><li> 1X PDL를 만들기 위해 10X PDL 3 튜브에 각각 9 ML 멸균 물을 추가합니다. </li><li> 첫번째 병 30 ML 1X PDL을 전송합니다. </li><li> 모든 성장 표면이 덮여 때까지 약간 이동합니다. 1 분 앉아 보자. </li><li> 둘째 병 1X PDL을 전송합니다. 1 분 앉아 보자. </li><li> 포스 세번째 병 반복합니다. </li><li> 150 ML 무균 H 2 O.와 배 모두 네 병을 씻어 </li></ol> 효소 솔루션 (ES)를 준비 : <ol><li> 결정이 녹아 때까지 0.6 ML의 원심 분리기 튜브 무게 0.8 아웃 MG L - 시스테인 (시그마 C7755)은 150ml DS와 와동를 추가합니다. </li><li> 15 ML 원뿔 관 5 ML의 DS를 전송 후, L - 시스테인 150ml를 추가합니다. </li><li> 50 단위 Papain를 추가합니다. (워싱턴 LS 03,126) </li><li> 7ml 0.1N NaOH를 추가합니다. </li></ol> 준비 멤 (GIBCO # 11090-081) <ol><li> 500 ML의 멤 병에서 65 ML을 제거합니다. 포도당 준비 10 ML을 저장합니다. </li><li> 5 ML 펜 / Strep을 (Gibco # 15070-063) 추가합니다. </li><li> 10 ML 1M 포도당 (시그마 G - 8270) (1.8 g / 10 ML 멤)를 추가 </li><li> 50 ML 태아 소 혈청 (Gibco # 16140-071) 또는 보빈 카프 세럼 (오메가 BC - 04)를 추가합니다. </li><li> 4 잘 섞어서 나누어지는 및 저장 ° C. </li></ol> NEUROBASAL MEDIUM/B-27 보충 (NBM/B27) NBM 500 ML (Gibco # 21103-049), B - 27 (50X), 10 ML (Gibco # 17504-044) <ol><li> NBM 병 및 혼합에 B - 27 유리병의 전체 내용을 추가합니다. </li><li> 4 ° C.에서 나누어지는 및 저장 </li></ol> 뇌 조직의 해부 <ol><li> 드라이 해부하기 전에 70 % EtOH에서 도구를 해부. </li><li> 3-15 ML 튜브의 각 10 ML의 DS를 전송합니다. </li><li> 마우스 새끼를 (P0 - P3)을 선택, 당신은 4 병 세 두뇌가 필요합니다. </li><li> 35mm 페트리 접시에 차가운 DS를 추가합니다. </li><li> 마우스 강아지 참살하고 머리를 절개하다. </li><li> 감기에 DS를 포함하는 페트리 접시에 플레이스 두뇌. </li><li> 유리 피펫을 통과하기 위해 충분히 작은 조각으로 조직을 잘라. </li></ol> 효소 분리 <ol><li> 파스퇴르 피펫으로 접시에서 가능한 한 많은 DS로 제거합니다. </li><li> 0.2 μm의 필터와 5cc 주사기를 통해 필터 ES. </li><li> 조직과 함께 접시에 ES를 배치합니다. </li><li> 37 조직을 품어 30 분 ° C 배양기 (CO 2 무료). </li></ol> 조직 워싱 <ol><li> 가능한 작은 ES로 받아보실하는 최초의 DS 튜브에 유리 피펫로 전송 조직. </li><li> 1,500 rpm으로 30 초위한 원심 분리기. </li><li> 조직 및 반복 절차를 두 번 더 전송합니다. </li></ol> 가루약 <ol><li> 50ml 원심 튜브에 멤 / FBS 38 ML을 플레이스 </li><li> 이 배양 접시에 35mm 요리 및 전송 조직에 멤 / FBS 3 ML을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 1000μl eppendorf의 pipet 팁 통해 triturating하여 조직을 떼어 놓다. </li><li> 멤 / FBS의 38ml를 포함하는 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 잘 섞는다. </li></ol> 도금 <ol><li> 각 병의 세포 현탁액 및 미디어 동등한 금액을 얻기 위해서는 수직으로 문화 병 스탠드. </li><li> 각각의 문화 병에 멤 / FBS 90 ML 놔. </li><li> 각 병의 세포 현탁액의 10 ML을 추가합니다. </li><li> 레이블 : 비의 연결, 이니셜 및 날짜. 37 ° C와 5% CO 2 알을 품다. </li></ol> 수유 <ol><li> 에서 3 일 또는 4, 따뜻한 멤 / FBS (가만히 따르다 모든 미디어 및 멤 / FBS 100 ML로 대체)로 피드 세포. 문화 합류 될 70-10일 걸릴 수 있습니다. </li><li> 일 7-10에 NBM/B27에 대한 미디어를 변경합니다. </li><li> 다음날, 미디어를 수집합니다. 0.22μm로 필터 </li><li> 40 ML의 aliquots을 만들어 멤 / FBS와 문화를 피드. </li><li> 2 삼일 다음 NBM/B27 미디어를 변경 </li><li> 다음날, 수집 및 절차를 반복합니다. </li><li> 약 미디어를 수집 보관. 이주. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>5-Fluoro-2'-deoxyuridine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>F0503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S9625</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vibraslicer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Campden Instruments Ltd.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassim Chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4504</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0876</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P5379</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H3375</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D (+)-Glucose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8270</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-Lysine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P7280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobasal Media (NBM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invirtogen (Gibco)</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-Amino-5-phosphonopentanoic acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A5282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bovine Albumin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A7030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin Inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T9253</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Hydroxide, 1N solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SS266-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Cysteine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7755</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bacto Agar</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Difco</td>
<td>0140-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Papain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Worthington </td>
<td>LS 03126</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sterile 0.2 &micro;m Syringe Filter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>DDA02025S0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass Coverslips, No1, &#216;12mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bellco Glass Inc.</td>
<td>1943-00012</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Minimum Essential Media (MEM)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>11090-081</td>
<td>with Earle's salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>15070-063</td>
<td>for non-neuronal culture</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>16140-071</td>
<td>needed for non-neuronal cultures</td>
</tr>
<tr>
<td>Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>12-565-25</td>
<td>Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass bottom "Imaging dishes"</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MatTek Corp.</td>
<td>P35G-1.5-10-C</td>
<td>Glass bottomed, &#216;35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures

이 비디오는 후반 배아와 초기 출생 후의 마우스 두뇌의 대뇌 피질의 연결을 문화를 생성하는 과정을 통해 여러분을 안내할 것입니다. 이러한 문화가 immunocytochemistry, 생화학, 전기 생리학, 칼슘, 나트륨 이미징, 단백질 및 / 또는 RNA 격리를 포함하여 다양한 어플 리케이션에 사용될 수 있습니다. 이 문화는 또한 늦은 배아 또는 출생 후의 치명적인 유전자 변이를 가지고 유전자 변형 동물의 개발의 연결을 연구하는 플랫폼을 제공합니다. 절차는 상대적으로 바로 전달됩니다 조직 문화 기술의 경험을 필요로하고 당신이 제대로 준비가되어있다면 더 이상보다 두세 시간 걸릴 안됩니다. thalamo - 피질 섬유 트랙트에서 대뇌 피질의 껍질주의 분리 원치 않는 비의 연결을 세포의 수를 줄일 수 있습니다. 의 연결을 세포의 수율은 효소 인큐베이션 단계 뒤에 부드럽게 피질 조직의 조각을 씹다 증가합니다. 그것이 세포 상조의 연결을 세포 죽음에 불필요한 부상을 방지 등이 필수적입니다. 이러한 문화가 glia 피더 세포의 부재로 유지되므로, 그들은 또한 뉴런에서 풍부한 성장 문화의 추가 혜택을 제공합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures at JoVE.com

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

이 비디오는 후반 배아와 초기 출생 후의 마우스 피질에서 문화의 연결을 생성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 문화가 immunocytochemistry, 생화학, 전기 생리학, 칼슘, 나트륨 이미징에 사용되며 출생 후의 치명적인 유전자 변이를 가지고 유전자 변형 동물의 개발의 연결을 연구하는 플랫폼을 제공하실 수 있습니다.

Dissociated 마우스 두피 신경 세포 배양의 준비

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

preparation-of-dissociated-mouse-cortical-neuron-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

43.2K 조회수.  University of California, Irvine (UCI). 이 비디오는 후반 배아와 초기 출생 후의 마우스 피질에서 문화의 연결을 생성하는 절차를 보여줍니다. 이러한 문화가 immunocytochemistry, 생화학, 전기 생리학, 칼슘, 나트륨 이미징에 사용되며 출생 후의 치명적인 유전자 변이를 가지고 유전자 변형 동물의 개발의 연결을 연구하는 플랫폼을 제공하실 수 있습니다.

비디오: Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

연구

생물학

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Cultures

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the physiological property to generate a wide array of differentiated cell types, including neurons, nerve supporting cells, smooth muscle cells, bone/cartilage cells and melanocytes. EPI-NCSC are easily accessible in the hairy skin and can be isolated as a highly pure population of stem cells. This video provides a detailed protocol for preparing mouse EPI-NCSC cultures from whisker follicles. The whisker pad of an adult mouse is removed, and whisker follicles dissected. The follicles are then cut longitudinally and subsequently transversely above and below the bulge region. The bulge is removed from the collagen capsule and placed in a culture plate. EPI-NCSC start to emigrate from the bulge explants 3 to 4 days later.

Mouse Epidermal Neural Crest Stem Cell EPI-NCSC Cultures

Here we show our method to isolate mouse epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC). Technique involves micro-dissecting whisker follicles, isolating the bulge and placeing it into tissue culture. EPI-NCSC start to emigrate from bulge explants onto the substratum within 3 - 4 days.

마우스 표피 신경 크레스트 줄기 세포 (에피 NCSC) 문화

EPI-NCSC are remnants of the embryonic neural crest in an adult location, the bulge of hair follicles. They are multipotent stem cells that have the ...

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

쥐 Neonates에서 기본 Dissociated Midbrain의 도파민 세포 문화

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

2 dGuo - 치료 Thymus 오르간 문화의 준비

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for neuronal survival and function. Neurotrophins are specifically required to maintain the survival and differentiation of innervating sensory neurons but the question of how these target-derived neurotrophins communicate to the cell body of innervating neurons has been an area of active research for over 30 years. The most commonly accepted model of how neurotrophin signals reach the cell body proposes that signaling endosomes carry this signal retrogradely along the axon. In order to study retrograde transport, a culture system was originally devised by Robert Campenot, in which cell bodies are isolated from their axons. The technique of preparing these compartmented chambers for culturing sensory neurons recapitulates the selective stimulation of neuron terminals that occurs in vivo following release of target-derived neurotrophins. Retrograde signaling events that require long-range microtubule dependent retrograde transport have important implications for the treatment of neurodegenerative disorders.

Here we describe the technique of preparing and maintaining compartmented chambers for culturing sensory neurons of the dorsal root ganglia.

Compartmented 문화의 도설 루트 신경의 뉴런의 준비 및 유지 관리

Neurons extend axonal processes that are far removed from the cell body to innervate target tissues, where target-derived growth factors are required for ...

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

포스트 - 나탈 마우스 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포 뉴런의 분리 및 문화

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

신경 세포와 Glia 개발 연구 랫 두뇌 집계 문화의 준비

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

의 준비 Aplysia 감각 - 모터의 연결을 셀 문화

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to immortalized cell lines. However, the post-mitotic nature of primary neurons prevents effective heterologous protein expression using common procedures such as electroporation or chemically-mediated transfection. Thus, other techniques must be employed in order to effectively express proteins in these non-dividing cells.
In this article, we describe the steps required to perform intranuclear injections of cDNA constructs into dissociated adult sympathetic neurons. This technique, which has been applied to different types of neurons, can successfully induce heterologous protein expression. The equipment essential for the microinjection procedure includes an inverted microscope to visualize cells, a glass injection pipet filled with cDNA solution that is connected to a N2(g) pressure delivery system, and a micromanipulator. The micromanipulator coordinates the injection motion of microinjection pipet with a brief pulse of pressurized N2 to eject cDNA solution from the pipet tip. 
This technique does not have the toxicity associated with many other transfection methods and enables multiple DNA constructs to be expressed at a consistent ratio. The low number of injected cells makes the microinjection procedure well suited for single cell studies such as electrophysiological recordings and optical imaging, but may not be ideal for biochemical assays that require a larger number of cells and higher transfection efficiencies. Although intranuclear microinjections require an investment of equipment and time, the ability to achieve high levels of heterologous protein expression in a physiologically relevant environment makes this technique a very useful tool to investigate protein function.

Direct intranuclear injection of cDNA is an effective transfection technique for post-mitotic cells. This method provides high levels of heterologous protein expression from single or multiple cDNA constructs and enables protein function to be studied in a physiologically relevant environment with a variety of single cell assays.