この方法は、細胞細胞接触の特性が組織形態形成中の空間および時間でどのように変化するかを含む組織力学の主要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、弱侵襲性であり、軽シート顕微鏡などのライブイメージングと互換性があることです。この技術は、組織にビーズの注入を必要としません。
通常、フラスを得るためにデミエールプローブとして使用され、私は興奮しています。このプロセスを実証するには、エンジニアのシャルデスと、私のレベルの地形の研究科学者ラファエル・クレメントです。まず、水平平野に光シート顕微鏡用の直立顕微鏡を設置し、光学ピンセットとして機能するようにレーザーと光学を準備します。
次に、500ナノメートルの蛍光ビーズを1マイクロリットルのガラスキュベットにパイプアウトし、10ミリリットルの蒸留水を加えます。キュベットを目的のキュベットホルダーに置き、目的が水面に触れるように目的の焦点を調整します。次に、取得ソフトウェアの制御に使用する統合開発環境 QT Creator を開きます。
マイクロRheoを開いて取得ソフトウェアを開きます。ライブを選択して、ライブ取得モードをオンにします。レーザーのスイッチを入れる前に、安全ゴーグルを置き、レーザーパワーを1ワットに調整し、レーザーのスイッチを入れます。
ライブフィードは、レーザーの焦点に閉じ込められたビーズを表示する必要があります。必要に応じて、第2の望遠鏡レンズの位置を調整し、ビーズが焦点を合わせて観察する。また、画像内のビードを中央に配置するために、ペリスコープの操縦角度を調整する必要がある場合もあります。
付属のテキストプロトコルの図3に示すように、データ取得ボードと縁石接続を準備します。光シャッターインターフェイスで、時間オープンsecパラメータを000.000、000.000に終了時間秒パラメータ、モードパラメータをシングルに、トリガパラメータをEXTに調整します。設定したら、[有効] ボタンを選択します。
QTクリエイターで、オットを開きます。をクリックしてプロジェクトを開きます。aogenerator での入出力の名前を変更します。
cpp ファイルは、セットアップで使用された MI カードと一致します。最後に、光ピンセットソフトウェアをコンパイルして実行します。取得ソフトウェアでは、目的の露光時間、ゲーム、2つの画像間の時間、取得する画像の数、およびレーザーのパワーを選択します。
次に、光ピンセットソフトウェアで、ここで示す光ピンセットパラメータを設定し、円をトレースする。次に、AIパラメータボックス、ウェイトフォワードボックスをチェックし、レコード押しボタンを押して、画像取得を開始します。光ピンセットのスイッチを入れ、生成ボタンを選択し、トラップされたビーズが少なくとも2つの完全な円を完了できるようにし、生成ボタンの選択を解除して光学ピンセットを停止します。
最後に、画像取得を停止します。tiff ムービーとガルバノ電圧のテキスト ファイルがデフォルト フォルダに作成されることに注意してください。Matlabを開き、キャリブレーションフォルダに移動し、位置2テンションスクリプトを実行スクリプトは、ガルバノメータ電圧を光トラップ位置に変換し、補間関数を計算します。
次に、付属のテキストプロトコルに従って、キャリブレーションムービーを設定します。X および Y レーザー位置の補間マップが計算され、スクリプトによって正しく表示されているかどうかを確認します。マップ内の空白の領域を確認します。
大きな白い領域がある場合は、新しいキャリブレーションムービーで操作を繰り返します。ここに示すキャリブレーションムービーは、十分なデータを持つ映画を表しています。パイク、または湿ったブラシを使用して、所望の段階で約10個の胚を選択し、それらを整列させる。
その後、ダイヤモンドマーキングペンを使用して、ガラススライドの一部を10、20に1ミロメーターでカットします。カットピースの片側に接着剤を追加し、20秒間乾燥させ、カットピースをひっくり返し、スライドの端に貼り付けて胚のラインに置きます。次に、サンプルホルダーに準備を取り付け、ホルダーをキュベットに入れ、キュベットをピソ電気状態に置き、水で満たします。
まず、目的の位置を見つけ、ピサールステージを使用してターゲットジャンクションの中間点をレーザートラップの位置に移動します。接触線に対して垂直な振動を実現するには、トラップのパラメータを設定します。また、フェーズをゼロに設定し、X方向とY方向の振幅は接触線に垂直に移動し、振幅を0.1ボルトに設定します。
次に、1 秒あたり 10 フレームなどの高速フレーム レートを使用して取得を開始します。イメージングが始まったら、移動ボタンを押して光ピンセットのスイッチを入れ替えます。イメージングが完了したら、ピンセットのスイッチを切り、画像取得を停止します。
指定されたフォルダには、撮影中にムービーとガルバノ電圧を含むテキストファイルがあります。収集したフレームを観察するためにムービーを開きます。ビデオの分析に続いて、Matlabでビデオを開くことによって、組織サンプルの剛性と張力を測定する。
ここで、プロット関数を使用して、トラップ位置の関数として界面位置をプロットする。次に、Matlab イージーフィットフリーツールボックスを使用して、データの線形適合を実行します。フィットの傾きの逆は、インターフェイス位置に対するトラップ位置の平均比率を提供します。
この情報から、付属のテキスト プロトコルの方程式を使用して、剛性と張力の値を決定します。レーザートラップは、界面に垂直なサンプルの中弦波偏向を生成します。ここには、3 つの連続したインターフェイス位置として示されています。
これは、映画として記録して、クライモグラフを生成し、さらに解析してサブピクセル解像度でインターフェイスの位置を決定することもできます。ここでは、期間は5秒でした。小さな変形のレジームでは、トラップとインターフェイスの位置は比例します。
トラップの面差に対するインタフェースの偏向の振幅は、インタフェースの張力または剛性にアクセスできます。プルとリリースの実験の基本を次に示します。光トラップがオンになると、2つのセル間のインターフェースの中間点から約1マイクロメートル離れて、インターフェイスはトラップの位置に向かって偏向します。
その後、トラップは、必要な時間が経過するとオフに切り替わります。結果のグラフは、マクスウェルのようなモデルのような仮説の実論理モデルと比較することができる。DOnは、赤外線レーザーを使用することは非常に危険であり、保護ゴーグルを着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行するときに取られるべきであることを忘れないでください。
ここでは、胚の場合に対するティンクルピンセットからの最も頻繁なユーザーと、この方法は、他の母親システムなどにも使用できます。
