私たちは、イェスパーKronhamnとダンHultmark、マイケルGalko、フライ株式のためのブルーミントンストックセンターに感謝します。統計分析とアドバイスをコートニー・小野寺に感謝します。私たちは、原稿の重要な読書のためのカトリーナ金、カルパナマキジャニ、カトリーナゴールド、Derynck研究室のメンバーと、原稿上の議論とコメントのNystul研究室のメンバーに感謝します。この作品は、画期的なバイオメディカル・リサーチ（PBBR）、ブロードセンター、ヘルマン財団、米国癌協会RSG DDC-122595、米国心臓協会13BGIA13730001、国立科学財団1326268、健康1R01GM112083-01の国立研究所とのためのUCSFのプログラムからの助成金によってサポートされていました（KB）に1R56HL118726-01A1。

1.血球ブリード/スクレイプアッセイ<ol><li>スライドの調製<ol><li>タイルスキャン機能なしの顕微鏡用オプション1：各幼虫を分析するために、顕微鏡の視野の表示領域に対応し、2mmの正方形それぞれ約5パップペンウェルを有する一枚のガラススライドを調製。それぞれに、S2メディア10μlの（ 図1A） -約5を追加します。乾燥から井戸を防止するために、湿ったチャンバー内にスライドしてください。 </li><li>タイルスキャン機能付き顕微鏡用オプション2：各幼虫が分析されるためには、〜3の3〜4パップペンウェルを有する一枚のガラススライドの準備 - 4ミリメートルの正方形それぞれを;各ウェルに、S2メディア20μlの（ 図1B） -約15を追加します。乾燥から井戸を防止するために、湿ったチャンバー内にスライドしてください。 注：井戸の上記の推奨数は〜2.5、幼虫あたり最大3000血球の合計（後半2 番目の齢幼虫のために十分である- larvの大半を標識3mmの長さ、導入遺伝子アル血液細胞）。大きな血液細胞の数を評価する場合、複数のウェルを過剰混雑を避けるために必要とされるかもしれません。 </li></ol></li><li>幼虫のコレクション： <ol><li>潮吹きペトリ皿に幼虫とフラッシュ幼虫を含むフライバイアルに水、またはペトリ皿に幼虫が含まれているいくつかの食品をスクープし、噴出ボトルを使用して、水で希釈します。 </li><li>静かに絵筆を使用してペトリ皿の外に幼虫を選ぶとキャビティ皿にまたはコールドブロックのスライドに水の中に置きます。 注：幼虫は水また​​は低温のブロックに限られた時間のために保持することができます。幼虫死亡または血球上の望ましくない影響を避けるために、45分以内に試験片を使用しています。 </li></ol></li><li>解剖： <ol><li>冷たい金属ブロック上に蛍光顕微鏡下で幼虫を選択します。必要に応じてサイズや画像の幼虫を測定します。 </li><li> （「ブリード」）血球の循環の単離： <ol><li>幼虫を選択したら、最初のPap-ペンウェル（ 図1Cに 1幼虫を置きます図2（a））。 </li><li>幼虫の後部と前部両端に切開を作るために2きれいな針や解剖ハサミとピンセットを使用してください。常駐血球を乱さないようにするには、幼虫の腹側にこれらの切開を行うのがベストです。一貫性のある結果を得るために、すべての幼虫のために同じ場所に切開を行います。 1 回目の齢幼虫の場合は、（腹側前部で）1切開で十分です。 </li><li>幼虫は、任意の圧力または物理的撹拌（ 図2A）を使用せずに数秒間出血することができます。 注：複数の幼虫に取り組んでいる場合には、サンプル「整合性に影響を与える可能性があまりにも長い間、氷上で幼虫を保つことを避けるために、次のステップに進む前に、それぞれのためにこれらの切開を行うことをお勧めします。 </li><li>静かに針やピンセットで幼虫を持ち上げ、残りの循環血球を洗浄するために第2のウェルにそれを浸し。その後、常駐血球のリリースに従ってください。 </li></ol></li><lI&gt;常駐血球の分離（「スクレイプ」）： <ol><li>静かに次のウェル（ 図2C）に幼虫を移します。 </li><li>典型的には約1/3幼虫の前方端から配置され、幼虫の体壁を通って背側に蛍光を発することがある幼虫のリンパ腺を特定します。 （ 図2C）をパンクチャリングを避けるためにできるだけ近いリンパ腺に針で幼虫を下に固定することによって、常駐血球を放出しながらリンパ腺を避けます。 注：通常の開発時にリンパ腺の血球の成熟は幼虫血球に比べて遅れている、と差別化血球の蛍光レポーターは若い幼虫のリンパ腺の信号が表示されない場合があります。これらの例では、あまり注意が期待されているリンパ腺の血球によって区別蛍光標識された幼虫血球の無汚染としてリンパ腺に支払われる必要があります。 </li><li> dissectiに常駐血液細胞をリリースこするおよび/または刺しのプロセスに。必要に応じて効果的にリンパ腺（上記参照）または他の身体部位の近くに幼虫を突き止めるために1針を使用します。血球を分離することを目指し、幼虫の体壁（ 図2C、E）を介して表示されている血球のクラスタでジャブする別の針を使用してください。血球はまた、掻き取り運動にリリースすることができます。しかし、早期の表皮を引き裂くことは自動化されたカウントがより困難にする可能性があり、血液細胞の大きなクラスターを放出することができます。 注：幼虫の年齢や遺伝子型に応じて、総血球数が異なります。単一細胞画像解析をより困難にする可能性があり、血液細胞といくつかのウェルの混雑を避けるために、いくつかのウェルの上に上述の解放処理を配布。 </li><li>いくつかの血球が最終的な死体に残っている場合は、手動の数取器（ 図2E）の顕微鏡及び使用して観察することにより、これらの血球をカウントします。カウント、Pを容易にするために、同じスライドのきれいな領域にカーカスをレースや光学面の数を減らすためにできるだけ薄く、それを広めます。 </li><li>細胞が落ち着く（必ずしも付着しない）するためのウェルを画像化する前に10分 - 解剖が完了すると、5の間待ちます。定住血球を乱す可能性がある、乾燥を避けるために、湿ったチャンバ内でスライドをインキュベートし、スライドの乱暴な取り扱いを避けます。 注：血球数を決定する際に、放出された細胞が固定されていないと細胞は幼虫から放出された後すぐに解剖した後、好ましくは30分以内に画像化されなければなりません。ウェル中の媒体の光学面を通って焦点を合わせることによって確認されるべきである10分、 - 培地および細胞の特性の量に応じて、細胞の大部分は5で決済しているだろう。しかし、血液細胞の一部のみが、この時点で、スライド表面に細胞固定ベースは、このプロトコルを修正する場合に考慮される必要があるという事実に付着してしまうapproache秒。 </li></ol></li></ol></li><li>定量化： <ol><li>蛍光顕微鏡（ 図2B、D、F）の下で定住血球の画像を取ります。 ImageJソフトウェアを使用して、血球の定量化に従ってください。 </li><li> ImageJの細胞計数アルゴリズムのためのイメージを準備します。 <ol><li>よくImageJのを使用してのオープン画像：→オープン→（ファイルを探し、選択を）ファイル。 </li><li>画像（複数可）は、8ビットまたは16ビットであることを確認してください。その後、 しきい値を調整し、選択をクリックし画像を選択することにより、画像のしきい値を調整します。 「しきい値ウィンドウ」（ 図3A）を確認します。 </li><li> 「 暗い背景 」オプションをチェックします。 「 赤」を選択し、画像の各セルは赤い点（グレースケールで見られます覆われていない細胞; 図3B）でマークされるまで（黒い矢印参照） より低い閾値レベルを上げます 。 下限しきい値として一部のセルがマークされていないになります増加しています。これは 、低しきい値を設定するどのくらいのための指標となり得ます。 注：時々細胞のクラスターが解決できず、パーティクルカウンタで一つに数えられるでしょう。そのような例では、クラスタ内のセルの数は、数取器を使用して、画像（必要に応じてズームイン）と手動カウントを調べることによって推定することができます。代替的に、 下限しきい値細胞のクラスターを解決するために増加することができます。この操作に起因する任意のマークされていない細胞は、その後数取器を用いて計数することができます。 </li></ol></li><li> ImageJのを用いて細胞数を分析します。 <ol><li>細胞（ 図3C）をカウントするパーティクルアナライザーを起動します。 分析選択して、 粒子の分析をクリックします。必要に応じて粒子にアルゴリズムの数（ 図3D）を参照するには、「 オーバーレイアウトライン」を選択します。また、ユニットのサイズまたはピクセルの領域に制限を設定します（ 例：、細胞、アルゴリズムの細胞など）の塊をカウントします。 </li><li> [OK]をクリックします 。カウント（ 図3E）と要約ウィンドウを確認します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.血球妨害アッセイ<ol><li>血球、選択幼虫を妨害し、ガラスビーズ（212から600ミクロン）の約0.5グラムを2ミリリットルの微量遠心管にそれらを配置するには0.5mlの水を加えます。 </li><li> 1分間の速度10で、手で、チューブをボルテックス。 </li><li>ペトリ皿にマイクロチューブの内容物がこぼれると絵筆で幼虫を選択することによりガラスビーズから幼虫を取得します。 </li><li>回復期には、フライ食品の少量を使用して、以前に作成したペトリ皿に幼虫を置きます。幼虫は45分のまたは所望に応じて期間のために彼らの血球パターンを再確立することを許可します。 注：彼らはプロセスで死亡しているように、移動を停止しているすべての幼虫を捨てます。しかし、我々は一般的にはLを参照してくださいボルテックスの1分後ittle損傷（以下を参照し、 補足図1）。 </li><li> 第1節で前述したように、回復期間の後、ブリード/スクレイプアッセイを続行します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).</li><li>Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thicker+than+blood:+conserved+mechanisms+in+Drosophila+and+vertebrate+hematopoiesis.">Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis.</a> Dev Cell. 5, 673-690 (2003).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).</li><li>Gold, K. S., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+the+two+myeloid+blood+cell+systems+in+vertebrates.">Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates.</a> Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).</li><li>Makhijani, K., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+blood+cells+and+the+nervous+system:+Hematopoiesis+in+the+Drosophila+larva.">Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva.</a> Fly. 6, 254-260 (2012).</li><li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva.">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138, 5379-5391 (2011).</li><li>Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+hematopoiesis+in+Drosophila.">Postembryonic hematopoiesis in Drosophila.</a> Dev Biol. 230, 243-257 (2001).</li><li>Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+origins+of+hemocytes+in+Drosophila.">The two origins of hemocytes in Drosophila.</a> Development. 130, 4955-4962 (2003).</li><li>Sieweke, M. H., Allen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+stem+cells:+self-renewal+of+differentiated+macrophages.">Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages.</a> Science. 342, 1242974 (2013).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature immunology. 14, 986-995 (2013).</li><li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biology Open. 1-9, (2015).</li><li>Leitao, A. B., Sucena, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+sessile+hemocyte+clusters+are+true+hematopoietic+tissues+that+regulate+larval+blood+cell+differentiation.">Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation.</a> eLife. , (2015).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).</li><li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+blood+cells+function+as+a+surveillance+system+for+damaged+tissue+in+Drosophila+larvae.">Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).</li><li>Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+Drosophila+tetraspanin,+Tsp68C,+suppresses+the+abnormal+proliferation+of+ytr-deficient+and+Ras/Raf-activated+hemocytes.">Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes.</a> Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).</li><li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+hemocyte-specific+enhancer-reporter+transgenes+for+the+analysis+of+hematopoiesis+in+Drosophila+Genesis.">New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis.</a> 47, 771-774 (2009).</li><li>Gajewski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+crystal+cell-specific+enhancer+of+the+black+cells+prophenoloxidase+gene+in+Drosophila.">Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila.</a> Genesis. 45, 200-207 (2007).</li><li>Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Drosophila+hematopoietic+lineage+by+conserved+transcription+factors.">Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors.</a> Science. 288, 146-149 (2000).</li><li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation.">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).</li><li>Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+sensing+of+systemic+and+nutritional+signals+by+haematopoietic+progenitors+in+Drosophila.">Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila.</a> Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom.">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ここでは、定量的に常駐を回復する第一の方法を説明し、単一のショウジョウバエの幼虫から血液細胞を循環する、これら2つの血球集団を定量化します。プロトコルは、イメージングおよび自動細胞計数に続く循環常駐血液細胞の連続的放出を含みます。 60分間の回復期間6 -幼虫常駐血球一過機械的な擾乱、主として30内で逆にすることが知られている方法により、循環中に動員することができます。したがって実験的に確認自動化された方法を使用して、居住者血球を取り除くことによって、このプロトコルは、幼虫の発育の過程で血球の循環幼虫及びフラクション当たりの全血球数を評価することにより（1）2つの方法で試験した、および（2）居住者と循環集団における血球局在化および血球数のタイトな相関。さらに、この方法の再現性は、同時によって実証されました生物学的反復の2つのデータセットをmparing。 過去には、研究所は幼虫血球6,13,21を定量化するための技術の範囲を使用しています。このプロトコルは、取得して簡単に適応プラットフォームを提供し、 ショウジョウバエの幼虫から常駐し、循環血液細胞集団を定量化するための共通の標準を確立します。記載されている方法は、居住者の血球とその微小環境の役割に焦点を当てた研究のために重要である、造血は4-6ポケット 、および蛍光タンパク質の野生型における導入遺伝子を運ぶショウジョウバエ株と遺伝的に改変された背景を勉強するのに適しています。プロトコルはまた、免疫チャレンジまたは損傷後の血球動員に焦点を当てた研究、および居住者血球または（4レビュー）総血球数の変化の動員をトリガーする遺伝的または環境的に誘導されるシグナルに関連しています。これは、時期尚早ジ場合、ことに留意すべきですリンパ腺系統に対する胚/幼虫を区別fferentiationとリンパ腺から血球の放出は、使用される蛍光血球レポーターの発現パターンによって制限され得ます。 ここで紹介するプロトコルは、撮像ライブ、蛍光標識された血球に依存しています。将来的には、免疫細胞化学を用いて、例えば 、固定した後、放出された細胞の検出を可能にするように修飾することができます。この場合、プロトコルは、方法は、血球の検索とその操作の元を可能にするので、例えば、コンカナバリンAと、接着インキュベーション時間を増加させ、接着剤スライドコーティングを追加することによって、例えば、血液細胞の完全な接着を確実にするために適合される必要があるかもしれません生体内では 、それは、発達、細胞生物学的および生化学的研究の広い範囲の利益になります。住民と循環血液細胞は、 ショウジョウバエおよび他の無脊椎動物22、suggestiのすべての後胚の発生段階中に発見されていますNGこの方法の適応は、ショウジョウバエの幼虫の造血系を超えた研究の広い範囲の利益になります。

無脊椎動物モデルキイロショウジョウバエの研究は、先天性免疫1の発見を牽引してきたし、2-4。 ショウジョウバエの造血は、に由来する胚/幼虫血球系統に分けることができる血液細胞の発達の様々な態様の理解を容易にしました胚および幼虫に展開し、リンパ腺の血球4,5の系譜。ここで、我々は、胚/幼虫血球系統に焦点を当てたプロトコルを提示するショウジョウバエの幼虫を中心にplasmatocytes（マクロファージ）といくつかの液晶セル4を備えています。幼虫では、胚の血球が持続し、幼虫の体壁5,6の表皮と筋肉層との間に位置する分節を繰り返すと端末造血ポケット（HPSの）を植民地化。自己再生マクロファージ6として、その性質に基づいて、局所的な組織微小環境での主な居住地6開発6,8中新興最古の血液細胞から7、およびそれらの系統は、この血液細胞集団は、脊椎動物の自己再生組織マクロファージ、最近種4,9,10の様々な同定独立骨髄系統と類似であると考えられます。しかし、 ショウジョウバエでは、一部または居住者の細胞の全てはまた、液晶セル11,12のような他の血液細胞型を生じるために可塑性を示します。 幼虫血球は、主に常駐（固着）しているが、様々なHPSの間の動的な定常状態にあります。 第 3齢幼虫がpupariation 5-7に近づくにつれて彼らは徐々に、特に、循環中に放出されます。免疫課題、傷害または体液4,6,13に常駐血球の早期、後者の場合には可逆、動員に機械的な外乱リード。 以前の研究では、その居住者を提案し、循環しています幼虫血球は同じ系統であるが、その接着剤またはホーミング特性6,7,13,14が異なります。常駐血球対循環の選択的分離は 、ショウジョウバエの幼虫のHPSのは、表皮と筋肉層によって裏打ちされている。HPが6からの誘導の合図への曝露を示唆し、常駐血球集団における増殖レベルの上昇を明らかにし、さらに末梢神経系の感覚ニューロンのクラスタを抱きます（PNS）および肝機能はoenocytes 6に似 。機能的には、変異体及び遺伝子細胞除去実験は、HPSの中に存在する感覚ニューロンは、幼虫血球6の栄養生存とローカリゼーションをサポートすることを明らかにしました。 ここでは、居住者の特定の単離および定量化のための方法を説明し、単一のショウジョウバエの幼虫 、および機械的な血球動員するためのプロトコルから血球を循環させます。方法は 、ex vivoのために使用することができます血球の研究とは、さらに、蛹および成人、およびその他の無脊椎動物のシステムのような他のショウジョウバエの発達段階に適合させることができます。以前の研究では、居住者と循環血球を区別していなかったので、このプロトコルは、常駐血液細胞の研究のための共通の基準を提供し、無脊椎動物の血液細胞研究の一貫性を高めるのに役立ちます。 まず、 血球ブリード/スクレイプアッセイは、差動の分離と蛍光タンパク質でマークされた居住者の自動定量化を説明し、単一のショウジョウバエの幼虫から血球集団を循環させます。プロトコルは、通常のタイルスキャンを装備した顕微鏡用の2つのオプション（ 図1）を提供します。その結果、循環血球の百分率及び幼虫当たりの血球の総数が得られます。この方法は、自分の血液細胞の間で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックショウジョウバエの幼虫に依存しています人口。血球ドライバまたはレポーターの選択は、血液細胞の集団を可視化し、定量化される結果、 すなわち、決定します。主に居住者の大半を含み、 ショウジョウバエの幼虫6の血球集団を循環するマクロファージ（plasmatocytes）を標識するために、適切な導入遺伝子は、HMLΔ-DsRedの 6、HmlΔ-GAL4 15 と Pxn -GAL4 16、CRQ - GAL4（でを含みますH. Agaisse 16）、またはイーター-GAL4 17;液晶セルの比較的少ない人口を標識するために、適切な行がBcF6-CFPと-GFP 18、または（J.ポロック19による ）LZ-GAL4であり、ラベリングlamellocytesために、特殊な細胞タイプは、主に免疫課題やけが13により誘導されるが、 例えば、MSNF9mo-mCherryを 17を使用することができます。いくつかのトランスジェニックのドライバは、分化した血液の範囲で表現されていますすべての幼虫の血液細胞20の約80％をラベルGAL4 20、 -そのような彼のような細胞や前駆細胞、。 GAL4ドライバが使用されているすべての場合に、UAS-GFPまたは他の蛍光タンパク質UAS-導入遺伝子との組み合わせが必要であることに注意してください。 結果セクションでは、この方法は、幼虫の発育の過程で血液細胞数および循環の挙動を監視するために使用されます。 （ - 60分30）6第二に、 血球外乱アッセイはその後、限られた時間枠内に再付着し、HPが本拠地する血球の能力を評価することができる外部操作により、居住者血球を分離するために設計された、前のステップを説明しています。典型的には、このアッセイは、幼虫当たり血球循環の割合を決定するために、ブリード/スクレイプアッセイが続きます。我々は、ウィットをボルテックスすることにより、外乱を使用して、このアッセイのために簡略化されたプロトコル（ 図1D）を提示します時間ガラスビーズではなく、ペイントブラシを有する単一の幼虫の操作は、先に説明したように6。 結果セクションでは、このアッセイは、一過切り離さ血球が血リンパ中に浮遊し、血球循環画分に回収することができることを実証するために使用されます。アッセイはまた、 例えば、様々な遺伝的背景や刺激条件を比較し、常駐サイトへのホーミング/接着における血球の違いを定量化するのに便利です。この機械的操作は可逆過程を反映しており、一般的に短い時間枠4,13で元に戻すことはできませんinfection-または損傷誘導常駐血球動員、区別されることに注意してください。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6cm/9cm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>One for each genotype to be evaluated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water squirt bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spoon/spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. a &#34;liner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cavity dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen: Super PAP PEN IM3580</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila cell culture media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 1ml syringes with needles (27G &#189;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>For dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 212-600 micron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>One per genotype evaluating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: Hml&#916;-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or Hml&#916;-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope with camera attachment</td>
			<td>Leica or Keyence</td>
			<td></td>
			<td>With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying blood cell populations of the drosophila melanogaster larva

脊椎動物では、造血は、誘導微小環境（ニッチ）によって規制されています。同様に、無脊椎動物のモデル生物キイロショウジョウバエでは、幼虫の造血ポケット（HPSの）として知られている誘導性微小環境は、 自己再生マクロファージ系統の、特に、血液細胞（血球）の開発と規制のための解剖学的部位として同定されている。HPSのは、また、末梢神経系の感覚ニューロンを含んで幼虫の表皮と筋肉層の間の分節繰り返しポケット。幼虫では、居住者（固着）血球は抗アポトーシス、接着剤およびこれらの感覚ニューロンから増殖手がかりや、裏地の筋肉及び上皮層のようなHPが潜在的に他のコンポーネントにさらされています。 HPが燃料からの正常な発達、常駐血球を徐々に放出時にMOのリリースで絶頂に達する循環血球の人口、変態の先頭に常駐血球のST。免疫攻撃、物理的な損傷または機械的な乱れが循環へ常駐血球の早期放出を誘発します。居住地との間で循環幼虫血球のスイッチが選択的に分離し、単一のショウジョウバエの幼虫から血液細胞のこれらの2つの集団を定量化するための共通の標準/手順の必要性が発生します。したがって、このプロトコルは、単一の幼虫から常駐し、循環血球を解放し、定量化するための自​​動化された方法について説明します。この方法は、ex vivoでのアプローチを容易にし、そしてショウジョウバエの発達段階および他の無脊椎動物の生物の様々なサービスを提供するように構成することができます。

記載された方法の典型的な結果を説明するために、我々は最初の幼虫血球数と幼虫の発育の過程で彼らの居住地（ 図4）の進行を概説すること血球ブリード/スクレイプアッセイを使用していました。住民と幼虫血球集団を循環するが、単一の幼虫から単離した（HMLΔ-GAL4、UAS-GFP;彼-GAL4を標識します 幼虫血球の大部分）とのImageJを用いて定量化。幼虫のコホート（約48時間AELまたは1 番目の齢）、2.5ミリメートル（〜80時間のAELまたは後期2 番目の齢）、および3.5ミリメートル（〜96時間AELまたは第 3齢）を調べた（ 図4）1.2ミリメートルのサイズの。血球数は、と相関し、染料染色幼虫7と幼虫のキューティクル6を蛍光標識タンパク質血球のライブカウントの光学顕微鏡に基づいて、前の見積もりを超え、幼虫の発育の過程で拡大しました。 1 回目のインで循環血球の割合が徐々に以前の刊行物6,7と一致し、幼虫の開発の過程（ 図4B、C）の上に増加したタールの幼虫ほぼすべての血球は、居住者でした。 次に、この方法を忠実に常駐し、循環集団間の血球の推移を監視するかどうかを検討しました。居住者血球を一過機械的擾乱によって取り外すことができると彼らは常駐サイト自発的に6に再付着する現象を利用して、我々は血球妨害アッセイで説明したようにガラスビーズをボルテックスし、常駐血球を分散させました。確かに、幼虫の機械的な乱れが常駐血球の費用（ 図5）での循環血球の人口の劇的な増加につながりました。 45分の回復期間の後、血球は主に目視により、およびなどによって両方、彼らの付着状態に戻りました循環細胞のsessed割合（ 図5D、E）。予想されるように、総血球数は、循環し、居住者集団間の血球の移動にもかかわらず、経時的に安定のままでした。 いくつかの追加の考慮事項が考慮されました。ガラスビーズは、様々な時間（1、5、20分）のために、トリパンブルー（Sigma社）の存在下で実施したボルテックスを用いて、主要な組織損傷を引き起こさなかったことを確認するためにボルテックス。 20分ボルテックスはポジティブコントロール（ 補足図1）として使用される針ステッチによる被害に似た、ダメージの小さな領域をもたらしながら、どちらも1と5分のボルテックスは、任意の明白な組織破壊を引き起こさありませんでした。キューティクルの損傷なしで表皮または他の組織の内部損傷を除外することはできませんが、このシナリオは、1分の血球、5分間処理した幼虫が予想されるパターンと時間枠に再付着したとしてではなく可能性は低いと思われる、幼虫の整合性を示唆して妥協はありませんでしたD（ 補足図1）。対照的に、幼虫は、再付着性の欠如に苦しんで20分間ボルテックスし、そして以前に記載されている14のようであっても、表皮創傷部位への血球の循環の結合を示さありませんでした。 最後に、この方法の再現性を実証するために、我々は、異なる実験者によって行われた上記二つの実験から2.5ミリメートルの幼虫の生物学的複製を比較しました。 補足図2に示すように 、両方のコホートは、同等の合計幼虫当たりの血球の数および血球の循環の割合を示しました。スチューデントのt試験は、方法は、再現可能かつ広く適用可能であることを示唆し、統計的有意差を示さありませんでした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" width="500" /> 図1.血球ブリード/スクレイプと外乱アッセイの<html> etupと回路図。 （A）単一画像のスライドセットアップ：5Xの目的とイメージングのための5つの2ミリメートルの正方形（B）タイルスキャンスライドセットアップ：イメージングブリードのための4つの3mmの正方形/タイルスキャン顕微鏡で≤2.5ミリメートルの幼虫の擦り傷。イメージングのための推奨される目的は5倍または10倍です。ImageJのを使用して、（C）ブリード/スクレイプアッセイ回路図と結果の定量化。（D）妨害アッセイでは、血球のパターンを機械的にガラスビーズで幼虫をボルテックスすることにより破壊されます。幼虫は、血球が造血ポケットに再付着する間に45分かけて回復させました。血球の接着性が乱れた後、循環中の血球の割合を定量化する、この方法により評価することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 方法 &quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" width="700" /> 循環および居住者血球を解放するために、図2ブリード/スクレイプアッセイ。 （A）の幼虫を出血は、幼虫の後部と前部端で腹切開は（はさみシンボル）を作られています。（B）血球切開から流出し、スライドの表面に沈降する流通している。（C）リンパ腺（LG）が位置しており、それを穿刺することなく、釘付けにされています。レジデント血球を刺しおよび/ ​​または針で幼虫をこすることによって解放されます。スライド上の（D）住民血球。（E、F）は、すべての居住者血球が解放されるまでスクレイププロセスが繰り返されます。無傷のリンパ腺を含む幼虫死体が残されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3は、ImageJのを使用して、血球の定量化を自動化。 （A、B）のImageJにおける血球画像ファイルを開いた後、 より低い閾値レベルは画像のすべてのセルを考慮して調整される。（C、D） の粒子を分析セル画素サイズ、円形、および結果の読み出しを設定する必要が血球数を表示するフォーマット（例えば、オーバーレイアウトライン ）。（E）[概要]ウィンドウ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig4highres.jpg" width="700" /> 図4.代表的な結果（1）。以上の血球数と居住者の状態<html>幼虫開発の過程。 （A）を使用幼虫期の概要; 1 回目の齢（48時間AEL;〜1.2ミリメートルの長さ）。 2 番目の齢（80時間AEL; 2.5ミリメートルの長さ）。 3 番目の齢（96時間AEL;〜3.5ミリメートルの長さ）。遺伝子型は、HMLΔ-GAL4、UAS-GFPです。彼-GAL4。ステージは幼虫mouthhooksを評価することによって確認された。それぞれの幼虫の段階で循環し、常駐血球数の（B）バー図。血球の循環（C）の割合。循環血球の割合が幼虫の発育の過程で不釣り合いに増加することに注意してください。（D）合計血球を、幼虫ごとに循環し、常駐血球の合計から生じます。血球は、ブリード/スクレイプ法を用いて定量しました。 N≥6幼虫/条件は、エラーバーは標準偏差、3つの独立した反復実験で確認結果を示します。JPG &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" width="700" /> 図5.代表的な結果（2）。血球の住居に機械的擾乱の影響。 （AC）の前に 、45分間の回復に続いてガラスビーズとボルテックス後の幼虫の例（A）いいえ 、外乱制御。血球は、造血ポケットに局在している（B）破壊血球パターンを0分にガラスビーズと水の懸濁液中の幼虫をボルテックスした後、回復後の乱れの45分で、（C）血球パターン。。。多くの血球は、造血ポケットに移転してきました。拡大背血管関連クラスターと後早期の外乱の蓄積（矢印）の主要な部位である背のストライプに注意してください。遺伝子型は、HMLΔ-GAL4、UAS-GFPであります;彼-GAL4 X YWブリード/スクレイプ法により定量血球を循環させる。（D）の割合。（E）総血球、幼虫あたり循環および居住者血球の合計から生じます。 N≥4幼虫/条件は、エラーバーは標準偏差、3つの独立した反復実験で確認結果を示します。重要性を確認するためにスチューデントのt検定、NS（有意ではない）、**（0.05≤P）、**（0.01≤P）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

assaying-blood-cell-populations-of-the-drosophila-melanogaster-larva

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

12.1K ビュー.  University of California San Francisco. Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.