私たちは、イェスパーKronhamnとダンHultmark、マイケルGalko、フライ株式のためのブルーミントンストックセンターに感謝します。統計分析とアドバイスをコートニー・小野寺に感謝します。私たちは、原稿の重要な読書のためのカトリーナ金、カルパナマキジャニ、カトリーナゴールド、Derynck研究室のメンバーと、原稿上の議論とコメントのNystul研究室のメンバーに感謝します。この作品は、画期的なバイオメディカル・リサーチ（PBBR）、ブロードセンター、ヘルマン財団、米国癌協会RSG DDC-122595、米国心臓協会13BGIA13730001、国立科学財団1326268、健康1R01GM112083-01の国立研究所とのためのUCSFのプログラムからの助成金によってサポートされていました（KB）に1R56HL118726-01A1。

1.血球ブリード/スクレイプアッセイ<ol><li>スライドの調製<ol><li>タイルスキャン機能なしの顕微鏡用オプション1：各幼虫を分析するために、顕微鏡の視野の表示領域に対応し、2mmの正方形それぞれ約5パップペンウェルを有する一枚のガラススライドを調製。それぞれに、S2メディア10μlの（ 図1A） -約5を追加します。乾燥から井戸を防止するために、湿ったチャンバー内にスライドしてください。 </li><li>タイルスキャン機能付き顕微鏡用オプション2：各幼虫が分析されるためには、〜3の3〜4パップペンウェルを有する一枚のガラススライドの準備 - 4ミリメートルの正方形それぞれを;各ウェルに、S2メディア20μlの（ 図1B） -約15を追加します。乾燥から井戸を防止するために、湿ったチャンバー内にスライドしてください。 注：井戸の上記の推奨数は〜2.5、幼虫あたり最大3000血球の合計（後半2 番目の齢幼虫のために十分である- larvの大半を標識3mmの長さ、導入遺伝子アル血液細胞）。大きな血液細胞の数を評価する場合、複数のウェルを過剰混雑を避けるために必要とされるかもしれません。 </li></ol></li><li>幼虫のコレクション： <ol><li>潮吹きペトリ皿に幼虫とフラッシュ幼虫を含むフライバイアルに水、またはペトリ皿に幼虫が含まれているいくつかの食品をスクープし、噴出ボトルを使用して、水で希釈します。 </li><li>静かに絵筆を使用してペトリ皿の外に幼虫を選ぶとキャビティ皿にまたはコールドブロックのスライドに水の中に置きます。 注：幼虫は水また​​は低温のブロックに限られた時間のために保持することができます。幼虫死亡または血球上の望ましくない影響を避けるために、45分以内に試験片を使用しています。 </li></ol></li><li>解剖： <ol><li>冷たい金属ブロック上に蛍光顕微鏡下で幼虫を選択します。必要に応じてサイズや画像の幼虫を測定します。 </li><li> （「ブリード」）血球の循環の単離： <ol><li>幼虫を選択したら、最初のPap-ペンウェル（ 図1Cに 1幼虫を置きます図2（a））。 </li><li>幼虫の後部と前部両端に切開を作るために2きれいな針や解剖ハサミとピンセットを使用してください。常駐血球を乱さないようにするには、幼虫の腹側にこれらの切開を行うのがベストです。一貫性のある結果を得るために、すべての幼虫のために同じ場所に切開を行います。 1 回目の齢幼虫の場合は、（腹側前部で）1切開で十分です。 </li><li>幼虫は、任意の圧力または物理的撹拌（ 図2A）を使用せずに数秒間出血することができます。 注：複数の幼虫に取り組んでいる場合には、サンプル「整合性に影響を与える可能性があまりにも長い間、氷上で幼虫を保つことを避けるために、次のステップに進む前に、それぞれのためにこれらの切開を行うことをお勧めします。 </li><li>静かに針やピンセットで幼虫を持ち上げ、残りの循環血球を洗浄するために第2のウェルにそれを浸し。その後、常駐血球のリリースに従ってください。 </li></ol></li><lI&gt;常駐血球の分離（「スクレイプ」）： <ol><li>静かに次のウェル（ 図2C）に幼虫を移します。 </li><li>典型的には約1/3幼虫の前方端から配置され、幼虫の体壁を通って背側に蛍光を発することがある幼虫のリンパ腺を特定します。 （ 図2C）をパンクチャリングを避けるためにできるだけ近いリンパ腺に針で幼虫を下に固定することによって、常駐血球を放出しながらリンパ腺を避けます。 注：通常の開発時にリンパ腺の血球の成熟は幼虫血球に比べて遅れている、と差別化血球の蛍光レポーターは若い幼虫のリンパ腺の信号が表示されない場合があります。これらの例では、あまり注意が期待されているリンパ腺の血球によって区別蛍光標識された幼虫血球の無汚染としてリンパ腺に支払われる必要があります。 </li><li> dissectiに常駐血液細胞をリリースこするおよび/または刺しのプロセスに。必要に応じて効果的にリンパ腺（上記参照）または他の身体部位の近くに幼虫を突き止めるために1針を使用します。血球を分離することを目指し、幼虫の体壁（ 図2C、E）を介して表示されている血球のクラスタでジャブする別の針を使用してください。血球はまた、掻き取り運動にリリースすることができます。しかし、早期の表皮を引き裂くことは自動化されたカウントがより困難にする可能性があり、血液細胞の大きなクラスターを放出することができます。 注：幼虫の年齢や遺伝子型に応じて、総血球数が異なります。単一細胞画像解析をより困難にする可能性があり、血液細胞といくつかのウェルの混雑を避けるために、いくつかのウェルの上に上述の解放処理を配布。 </li><li>いくつかの血球が最終的な死体に残っている場合は、手動の数取器（ 図2E）の顕微鏡及び使用して観察することにより、これらの血球をカウントします。カウント、Pを容易にするために、同じスライドのきれいな領域にカーカスをレースや光学面の数を減らすためにできるだけ薄く、それを広めます。 </li><li>細胞が落ち着く（必ずしも付着しない）するためのウェルを画像化する前に10分 - 解剖が完了すると、5の間待ちます。定住血球を乱す可能性がある、乾燥を避けるために、湿ったチャンバ内でスライドをインキュベートし、スライドの乱暴な取り扱いを避けます。 注：血球数を決定する際に、放出された細胞が固定されていないと細胞は幼虫から放出された後すぐに解剖した後、好ましくは30分以内に画像化されなければなりません。ウェル中の媒体の光学面を通って焦点を合わせることによって確認されるべきである10分、 - 培地および細胞の特性の量に応じて、細胞の大部分は5で決済しているだろう。しかし、血液細胞の一部のみが、この時点で、スライド表面に細胞固定ベースは、このプロトコルを修正する場合に考慮される必要があるという事実に付着してしまうapproache秒。 </li></ol></li></ol></li><li>定量化： <ol><li>蛍光顕微鏡（ 図2B、D、F）の下で定住血球の画像を取ります。 ImageJソフトウェアを使用して、血球の定量化に従ってください。 </li><li> ImageJの細胞計数アルゴリズムのためのイメージを準備します。 <ol><li>よくImageJのを使用してのオープン画像：→オープン→（ファイルを探し、選択を）ファイル。 </li><li>画像（複数可）は、8ビットまたは16ビットであることを確認してください。その後、 しきい値を調整し、選択をクリックし画像を選択することにより、画像のしきい値を調整します。 「しきい値ウィンドウ」（ 図3A）を確認します。 </li><li> 「 暗い背景 」オプションをチェックします。 「 赤」を選択し、画像の各セルは赤い点（グレースケールで見られます覆われていない細胞; 図3B）でマークされるまで（黒い矢印参照） より低い閾値レベルを上げます 。 下限しきい値として一部のセルがマークされていないになります増加しています。これは 、低しきい値を設定するどのくらいのための指標となり得ます。 注：時々細胞のクラスターが解決できず、パーティクルカウンタで一つに数えられるでしょう。そのような例では、クラスタ内のセルの数は、数取器を使用して、画像（必要に応じてズームイン）と手動カウントを調べることによって推定することができます。代替的に、 下限しきい値細胞のクラスターを解決するために増加することができます。この操作に起因する任意のマークされていない細胞は、その後数取器を用いて計数することができます。 </li></ol></li><li> ImageJのを用いて細胞数を分析します。 <ol><li>細胞（ 図3C）をカウントするパーティクルアナライザーを起動します。 分析選択して、 粒子の分析をクリックします。必要に応じて粒子にアルゴリズムの数（ 図3D）を参照するには、「 オーバーレイアウトライン」を選択します。また、ユニットのサイズまたはピクセルの領域に制限を設定します（ 例：、細胞、アルゴリズムの細胞など）の塊をカウントします。 </li><li> [OK]をクリックします 。カウント（ 図3E）と要約ウィンドウを確認します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.血球妨害アッセイ<ol><li>血球、選択幼虫を妨害し、ガラスビーズ（212から600ミクロン）の約0.5グラムを2ミリリットルの微量遠心管にそれらを配置するには0.5mlの水を加えます。 </li><li> 1分間の速度10で、手で、チューブをボルテックス。 </li><li>ペトリ皿にマイクロチューブの内容物がこぼれると絵筆で幼虫を選択することによりガラスビーズから幼虫を取得します。 </li><li>回復期には、フライ食品の少量を使用して、以前に作成したペトリ皿に幼虫を置きます。幼虫は45分のまたは所望に応じて期間のために彼らの血球パターンを再確立することを許可します。 注：彼らはプロセスで死亡しているように、移動を停止しているすべての幼虫を捨てます。しかし、我々は一般的にはLを参照してくださいボルテックスの1分後ittle損傷（以下を参照し、 補足図1）。 </li><li> 第1節で前述したように、回復期間の後、ブリード/スクレイプアッセイを続行します。 </li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

ここでは、定量的に常駐を回復する第一の方法を説明し、単一のショウジョウバエの幼虫から血液細胞を循環する、これら2つの血球集団を定量化します。プロトコルは、イメージングおよび自動細胞計数に続く循環常駐血液細胞の連続的放出を含みます。 60分間の回復期間6 -幼虫常駐血球一過機械的な擾乱、主として30内で逆にすることが知られている方法により、循環中に動員することができます。したがって実験的に確認自動化された方法を使用して、居住者血球を取り除くことによって、このプロトコルは、幼虫の発育の過程で血球の循環幼虫及びフラクション当たりの全血球数を評価することにより（1）2つの方法で試験した、および（2）居住者と循環集団における血球局在化および血球数のタイトな相関。さらに、この方法の再現性は、同時によって実証されました生物学的反復の2つのデータセットをmparing。 過去には、研究所は幼虫血球6,13,21を定量化するための技術の範囲を使用しています。このプロトコルは、取得して簡単に適応プラットフォームを提供し、 ショウジョウバエの幼虫から常駐し、循環血液細胞集団を定量化するための共通の標準を確立します。記載されている方法は、居住者の血球とその微小環境の役割に焦点を当てた研究のために重要である、造血は4-6ポケット 、および蛍光タンパク質の野生型における導入遺伝子を運ぶショウジョウバエ株と遺伝的に改変された背景を勉強するのに適しています。プロトコルはまた、免疫チャレンジまたは損傷後の血球動員に焦点を当てた研究、および居住者血球または（4レビュー）総血球数の変化の動員をトリガーする遺伝的または環境的に誘導されるシグナルに関連しています。これは、時期尚早ジ場合、ことに留意すべきですリンパ腺系統に対する胚/幼虫を区別fferentiationとリンパ腺から血球の放出は、使用される蛍光血球レポーターの発現パターンによって制限され得ます。 ここで紹介するプロトコルは、撮像ライブ、蛍光標識された血球に依存しています。将来的には、免疫細胞化学を用いて、例えば 、固定した後、放出された細胞の検出を可能にするように修飾することができます。この場合、プロトコルは、方法は、血球の検索とその操作の元を可能にするので、例えば、コンカナバリンAと、接着インキュベーション時間を増加させ、接着剤スライドコーティングを追加することによって、例えば、血液細胞の完全な接着を確実にするために適合される必要があるかもしれません生体内では 、それは、発達、細胞生物学的および生化学的研究の広い範囲の利益になります。住民と循環血液細胞は、 ショウジョウバエおよび他の無脊椎動物22、suggestiのすべての後胚の発生段階中に発見されていますNGこの方法の適応は、ショウジョウバエの幼虫の造血系を超えた研究の広い範囲の利益になります。

無脊椎動物モデルキイロショウジョウバエの研究は、先天性免疫1の発見を牽引してきたし、2-4。 ショウジョウバエの造血は、に由来する胚/幼虫血球系統に分けることができる血液細胞の発達の様々な態様の理解を容易にしました胚および幼虫に展開し、リンパ腺の血球4,5の系譜。ここで、我々は、胚/幼虫血球系統に焦点を当てたプロトコルを提示するショウジョウバエの幼虫を中心にplasmatocytes（マクロファージ）といくつかの液晶セル4を備えています。幼虫では、胚の血球が持続し、幼虫の体壁5,6の表皮と筋肉層との間に位置する分節を繰り返すと端末造血ポケット（HPSの）を植民地化。自己再生マクロファージ6として、その性質に基づいて、局所的な組織微小環境での主な居住地6開発6,8中新興最古の血液細胞から7、およびそれらの系統は、この血液細胞集団は、脊椎動物の自己再生組織マクロファージ、最近種4,9,10の様々な同定独立骨髄系統と類似であると考えられます。しかし、 ショウジョウバエでは、一部または居住者の細胞の全てはまた、液晶セル11,12のような他の血液細胞型を生じるために可塑性を示します。 幼虫血球は、主に常駐（固着）しているが、様々なHPSの間の動的な定常状態にあります。 第 3齢幼虫がpupariation 5-7に近づくにつれて彼らは徐々に、特に、循環中に放出されます。免疫課題、傷害または体液4,6,13に常駐血球の早期、後者の場合には可逆、動員に機械的な外乱リード。 以前の研究では、その居住者を提案し、循環しています幼虫血球は同じ系統であるが、その接着剤またはホーミング特性6,7,13,14が異なります。常駐血球対循環の選択的分離は 、ショウジョウバエの幼虫のHPSのは、表皮と筋肉層によって裏打ちされている。HPが6からの誘導の合図への曝露を示唆し、常駐血球集団における増殖レベルの上昇を明らかにし、さらに末梢神経系の感覚ニューロンのクラスタを抱きます（PNS）および肝機能はoenocytes 6に似 。機能的には、変異体及び遺伝子細胞除去実験は、HPSの中に存在する感覚ニューロンは、幼虫血球6の栄養生存とローカリゼーションをサポートすることを明らかにしました。 ここでは、居住者の特定の単離および定量化のための方法を説明し、単一のショウジョウバエの幼虫 、および機械的な血球動員するためのプロトコルから血球を循環させます。方法は 、ex vivoのために使用することができます血球の研究とは、さらに、蛹および成人、およびその他の無脊椎動物のシステムのような他のショウジョウバエの発達段階に適合させることができます。以前の研究では、居住者と循環血球を区別していなかったので、このプロトコルは、常駐血液細胞の研究のための共通の基準を提供し、無脊椎動物の血液細胞研究の一貫性を高めるのに役立ちます。 まず、 血球ブリード/スクレイプアッセイは、差動の分離と蛍光タンパク質でマークされた居住者の自動定量化を説明し、単一のショウジョウバエの幼虫から血球集団を循環させます。プロトコルは、通常のタイルスキャンを装備した顕微鏡用の2つのオプション（ 図1）を提供します。その結果、循環血球の百分率及び幼虫当たりの血球の総数が得られます。この方法は、自分の血液細胞の間で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックショウジョウバエの幼虫に依存しています人口。血球ドライバまたはレポーターの選択は、血液細胞の集団を可視化し、定量化される結果、 すなわち、決定します。主に居住者の大半を含み、 ショウジョウバエの幼虫6の血球集団を循環するマクロファージ（plasmatocytes）を標識するために、適切な導入遺伝子は、HMLΔ-DsRedの 6、HmlΔ-GAL4 15 と Pxn -GAL4 16、CRQ - GAL4（でを含みますH. Agaisse 16）、またはイーター-GAL4 17;液晶セルの比較的少ない人口を標識するために、適切な行がBcF6-CFPと-GFP 18、または（J.ポロック19による ）LZ-GAL4であり、ラベリングlamellocytesために、特殊な細胞タイプは、主に免疫課題やけが13により誘導されるが、 例えば、MSNF9mo-mCherryを 17を使用することができます。いくつかのトランスジェニックのドライバは、分化した血液の範囲で表現されていますすべての幼虫の血液細胞20の約80％をラベルGAL4 20、 -そのような彼のような細胞や前駆細胞、。 GAL4ドライバが使用されているすべての場合に、UAS-GFPまたは他の蛍光タンパク質UAS-導入遺伝子との組み合わせが必要であることに注意してください。 結果セクションでは、この方法は、幼虫の発育の過程で血液細胞数および循環の挙動を監視するために使用されます。 （ - 60分30）6第二に、 血球外乱アッセイはその後、限られた時間枠内に再付着し、HPが本拠地する血球の能力を評価することができる外部操作により、居住者血球を分離するために設計された、前のステップを説明しています。典型的には、このアッセイは、幼虫当たり血球循環の割合を決定するために、ブリード/スクレイプアッセイが続きます。我々は、ウィットをボルテックスすることにより、外乱を使用して、このアッセイのために簡略化されたプロトコル（ 図1D）を提示します時間ガラスビーズではなく、ペイントブラシを有する単一の幼虫の操作は、先に説明したように6。 結果セクションでは、このアッセイは、一過切り離さ血球が血リンパ中に浮遊し、血球循環画分に回収することができることを実証するために使用されます。アッセイはまた、 例えば、様々な遺伝的背景や刺激条件を比較し、常駐サイトへのホーミング/接着における血球の違いを定量化するのに便利です。この機械的操作は可逆過程を反映しており、一般的に短い時間枠4,13で元に戻すことはできませんinfection-または損傷誘導常駐血球動員、区別されることに注意してください。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6cm/9cm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>One for each genotype to be evaluated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water squirt bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spoon/spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. a &#34;liner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cavity dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen: Super PAP PEN IM3580</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila cell culture media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 1ml syringes with needles (27G &#189;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>For dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 212-600 micron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>One per genotype evaluating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: Hml&#916;-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or Hml&#916;-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope with camera attachment</td>
			<td>Leica or Keyence</td>
			<td></td>
			<td>With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying blood cell populations of the drosophila melanogaster larva

脊椎動物では、造血は、誘導微小環境（ニッチ）によって規制されています。同様に、無脊椎動物のモデル生物キイロショウジョウバエでは、幼虫の造血ポケット（HPSの）として知られている誘導性微小環境は、 自己再生マクロファージ系統の、特に、血液細胞（血球）の開発と規制のための解剖学的部位として同定されている。HPSのは、また、末梢神経系の感覚ニューロンを含んで幼虫の表皮と筋肉層の間の分節繰り返しポケット。幼虫では、居住者（固着）血球は抗アポトーシス、接着剤およびこれらの感覚ニューロンから増殖手がかりや、裏地の筋肉及び上皮層のようなHPが潜在的に他のコンポーネントにさらされています。 HPが燃料からの正常な発達、常駐血球を徐々に放出時にMOのリリースで絶頂に達する循環血球の人口、変態の先頭に常駐血球のST。免疫攻撃、物理的な損傷または機械的な乱れが循環へ常駐血球の早期放出を誘発します。居住地との間で循環幼虫血球のスイッチが選択的に分離し、単一のショウジョウバエの幼虫から血液細胞のこれらの2つの集団を定量化するための共通の標準/手順の必要性が発生します。したがって、このプロトコルは、単一の幼虫から常駐し、循環血球を解放し、定量化するための自​​動化された方法について説明します。この方法は、ex vivoでのアプローチを容易にし、そしてショウジョウバエの発達段階および他の無脊椎動物の生物の様々なサービスを提供するように構成することができます。

記載された方法の典型的な結果を説明するために、我々は最初の幼虫血球数と幼虫の発育の過程で彼らの居住地（ 図4）の進行を概説すること血球ブリード/スクレイプアッセイを使用していました。住民と幼虫血球集団を循環するが、単一の幼虫から単離した（HMLΔ-GAL4、UAS-GFP;彼-GAL4を標識します 幼虫血球の大部分）とのImageJを用いて定量化。幼虫のコホート（約48時間AELまたは1 番目の齢）、2.5ミリメートル（〜80時間のAELまたは後期2 番目の齢）、および3.5ミリメートル（〜96時間AELまたは第 3齢）を調べた（ 図4）1.2ミリメートルのサイズの。血球数は、と相関し、染料染色幼虫7と幼虫のキューティクル6を蛍光標識タンパク質血球のライブカウントの光学顕微鏡に基づいて、前の見積もりを超え、幼虫の発育の過程で拡大しました。 1 回目のインで循環血球の割合が徐々に以前の刊行物6,7と一致し、幼虫の開発の過程（ 図4B、C）の上に増加したタールの幼虫ほぼすべての血球は、居住者でした。 次に、この方法を忠実に常駐し、循環集団間の血球の推移を監視するかどうかを検討しました。居住者血球を一過機械的擾乱によって取り外すことができると彼らは常駐サイト自発的に6に再付着する現象を利用して、我々は血球妨害アッセイで説明したようにガラスビーズをボルテックスし、常駐血球を分散させました。確かに、幼虫の機械的な乱れが常駐血球の費用（ 図5）での循環血球の人口の劇的な増加につながりました。 45分の回復期間の後、血球は主に目視により、およびなどによって両方、彼らの付着状態に戻りました循環細胞のsessed割合（ 図5D、E）。予想されるように、総血球数は、循環し、居住者集団間の血球の移動にもかかわらず、経時的に安定のままでした。 いくつかの追加の考慮事項が考慮されました。ガラスビーズは、様々な時間（1、5、20分）のために、トリパンブルー（Sigma社）の存在下で実施したボルテックスを用いて、主要な組織損傷を引き起こさなかったことを確認するためにボルテックス。 20分ボルテックスはポジティブコントロール（ 補足図1）として使用される針ステッチによる被害に似た、ダメージの小さな領域をもたらしながら、どちらも1と5分のボルテックスは、任意の明白な組織破壊を引き起こさありませんでした。キューティクルの損傷なしで表皮または他の組織の内部損傷を除外することはできませんが、このシナリオは、1分の血球、5分間処理した幼虫が予想されるパターンと時間枠に再付着したとしてではなく可能性は低いと思われる、幼虫の整合性を示唆して妥協はありませんでしたD（ 補足図1）。対照的に、幼虫は、再付着性の欠如に苦しんで20分間ボルテックスし、そして以前に記載されている14のようであっても、表皮創傷部位への血球の循環の結合を示さありませんでした。 最後に、この方法の再現性を実証するために、我々は、異なる実験者によって行われた上記二つの実験から2.5ミリメートルの幼虫の生物学的複製を比較しました。 補足図2に示すように 、両方のコホートは、同等の合計幼虫当たりの血球の数および血球の循環の割合を示しました。スチューデントのt試験は、方法は、再現可能かつ広く適用可能であることを示唆し、統計的有意差を示さありませんでした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" width="500" /> 図1.血球ブリード/スクレイプと外乱アッセイの<html> etupと回路図。 （A）単一画像のスライドセットアップ：5Xの目的とイメージングのための5つの2ミリメートルの正方形（B）タイルスキャンスライドセットアップ：イメージングブリードのための4つの3mmの正方形/タイルスキャン顕微鏡で≤2.5ミリメートルの幼虫の擦り傷。イメージングのための推奨される目的は5倍または10倍です。ImageJのを使用して、（C）ブリード/スクレイプアッセイ回路図と結果の定量化。（D）妨害アッセイでは、血球のパターンを機械的にガラスビーズで幼虫をボルテックスすることにより破壊されます。幼虫は、血球が造血ポケットに再付着する間に45分かけて回復させました。血球の接着性が乱れた後、循環中の血球の割合を定量化する、この方法により評価することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 方法 &quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" width="700" /> 循環および居住者血球を解放するために、図2ブリード/スクレイプアッセイ。 （A）の幼虫を出血は、幼虫の後部と前部端で腹切開は（はさみシンボル）を作られています。（B）血球切開から流出し、スライドの表面に沈降する流通している。（C）リンパ腺（LG）が位置しており、それを穿刺することなく、釘付けにされています。レジデント血球を刺しおよび/ ​​または針で幼虫をこすることによって解放されます。スライド上の（D）住民血球。（E、F）は、すべての居住者血球が解放されるまでスクレイププロセスが繰り返されます。無傷のリンパ腺を含む幼虫死体が残されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図3は、ImageJのを使用して、血球の定量化を自動化。 （A、B）のImageJにおける血球画像ファイルを開いた後、 より低い閾値レベルは画像のすべてのセルを考慮して調整される。（C、D） の粒子を分析セル画素サイズ、円形、および結果の読み出しを設定する必要が血球数を表示するフォーマット（例えば、オーバーレイアウトライン ）。（E）[概要]ウィンドウ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig4highres.jpg" width="700" /> 図4.代表的な結果（1）。以上の血球数と居住者の状態<html>幼虫開発の過程。 （A）を使用幼虫期の概要; 1 回目の齢（48時間AEL;〜1.2ミリメートルの長さ）。 2 番目の齢（80時間AEL; 2.5ミリメートルの長さ）。 3 番目の齢（96時間AEL;〜3.5ミリメートルの長さ）。遺伝子型は、HMLΔ-GAL4、UAS-GFPです。彼-GAL4。ステージは幼虫mouthhooksを評価することによって確認された。それぞれの幼虫の段階で循環し、常駐血球数の（B）バー図。血球の循環（C）の割合。循環血球の割合が幼虫の発育の過程で不釣り合いに増加することに注意してください。（D）合計血球を、幼虫ごとに循環し、常駐血球の合計から生じます。血球は、ブリード/スクレイプ法を用いて定量しました。 N≥6幼虫/条件は、エラーバーは標準偏差、3つの独立した反復実験で確認結果を示します。JPG &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" width="700" /> 図5.代表的な結果（2）。血球の住居に機械的擾乱の影響。 （AC）の前に 、45分間の回復に続いてガラスビーズとボルテックス後の幼虫の例（A）いいえ 、外乱制御。血球は、造血ポケットに局在している（B）破壊血球パターンを0分にガラスビーズと水の懸濁液中の幼虫をボルテックスした後、回復後の乱れの45分で、（C）血球パターン。。。多くの血球は、造血ポケットに移転してきました。拡大背血管関連クラスターと後早期の外乱の蓄積（矢印）の主要な部位である背のストライプに注意してください。遺伝子型は、HMLΔ-GAL4、UAS-GFPであります;彼-GAL4 X YWブリード/スクレイプ法により定量血球を循環させる。（D）の割合。（E）総血球、幼虫あたり循環および居住者血球の合計から生じます。 N≥4幼虫/条件は、エラーバーは標準偏差、3つの独立した反復実験で確認結果を示します。重要性を確認するためにスチューデントのt検定、NS（有意ではない）、**（0.05≤P）、**（0.01≤P）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

の血液細胞集団のアッセイ<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

assaying-blood-cell-populations-of-the-drosophila-melanogaster-larva

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

12.2K ビュー.  University of California San Francisco. Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

ビデオ: Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

フルーツフライを飼育<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;無菌およびノトバイオート条件の下で

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

発生生物学

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response to&#160;growth and reproduction. In insects, the larval prothoracic gland (PG) and the adult female ovary play essential roles in biosynthesizing the principal steroid hormones called ecdysteroids. These ecdysteroidogenic organs are innervated from the nervous system, through&#160;which the timing of biosynthesis is affected by environmental cues. Here we describe a protocol for visualizing ecdysteroidogenic organs and their interactive organs in larvae and adults of the fruit fly Drosophila melanogaster, which provides a suitable model system for studying steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. Skillful dissection allows us to maintain the positions of ecdysteroidogenic organs and their interactive organs including the brain, the ventral nerve cord, and other tissues. Immunostaining with antibodies against ecdysteroidogenic enzymes, along with transgenic fluorescence proteins driven by tissue-specific promoters, are available to label ecdysteroidogenic cells. Moreover, the innervations of the ecdysteroidogenic organs can also be labeled by specific antibodies or a collection of GAL4 drivers in various types of neurons. Therefore, the ecdysteroidogenic organs and their neuronal connections can be&#160;visualized simultaneously&#160;by immunostaining and transgenic techniques. Finally, we describe how to visualize germline stem cells, whose proliferation and maintenance are controlled by ecdysteroids. This method contributes to comprehensive understanding of steroid hormone biosynthesis and its neuronal regulatory mechanism.

Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster

We describe a protocol for dissection, fixation, and immunostaining of steroidogenic organs in Drosophila larvae and adult females to study steroid hormone biosynthesis and its regulatory mechanism. In addition to steroidogenic organs, we visualize the innervation of steroidogenic organs as well as steroidogenic target cells such as germline stem cells.

フルーツフライで免疫染色でステロイド合成器官とそのインタラクティブ臓器を可視化するためのプロトコル<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

In multicellular organisms, a small group of cells is endowed with a specialized function in their biogenic activity, inducing a systemic response ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

ショウジョウバエメラメラノガスターにおける内分泌破壊を試験する方法

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

ショウジョウバエメラノガスターにおける血液脳関門完全性に関するアッセイ

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

クリアされた心臓3次元イメージングによる標的細胞集団の心臓損傷応答のキャプチャ

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

ヒトiPSCベースの血液脳バリアチップの生成

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.