このプロトコルは、最初の頂端アウトインアディッシュモデルについて説明し、経口投与を目的とした潜在的な治療法のin vitroモデリングを確立する際の基底側外側アウト腸内ディッシュモデルよりも重要な改善です。この方法は、エンテロイドの頂端表面へのアクセスを可能にする。化合物は細胞培地に添加することができ、化合物はin vivoの場合と同様に頂端に取り込まれます。
潜在的な経口治療薬をテストするために腸の炎症のin vitroシステムを確立することに関心のある研究者は、この技術が特に有用であると判断するかもしれません。異なる年齢や種から供給された組織は、さらなる標準化を必要とするかもしれません。したがって、極性反転時間を確立しながら患者が必要になる場合があります。
3Dエンテロイドの極性を逆転させるために、確立された3D基底外側外側エンテロイドの24ウェルプレートの各ウェルから培地を吸引する。500マイクロリットルの5ミリモルの氷冷、EDTA、またはPBSを24ウェルプレートの各ウェルに加え、P 200ピペットで5〜6回上下にピペッティングすることにより、基底膜抽出物または細胞外マトリックスドームを穏やかに機械的に破壊します。4つのウェルの内容物を15ミリリットルの記録チューブに移します。
次に、8ミリリットルの氷冷EDTAスラッシュPBSをチューブに追加します。残りの20ウェルを同様に移す。チューブを摂氏4度で330RPMの回転プラットフォームまたはシェーカーで1時間インキュベートします。
インキュベーション後、チューブを遠心分離し、各チューブから上清を廃棄する。ペレットを5ミリリットルのDMEM F12と組み合わせて洗浄します。次に、細胞懸濁液を遠心分離し、上清を除去してから、12ミリリットルの抗生物質を含まない培地をチューブに追加し、細胞ペレットが再懸濁されるようにします。
500マイクロリットルの腸内懸濁液を24ウェル超低アタッチメントプレートの各ウェルにピペットする。プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素で2〜5日間、またはエンテロイドが極性が逆になるまでインキュベートします。棄権初日目に、24ウェルプレートの4つのウェルの内容物を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。
別々のチューブで各処理を行い、すべての所望のウェルについて繰り返します。チューブを遠心分離し、室温でアルデヒド固定液から4%の300マイクロリットルにペレットを再懸濁します。30分後、ペレットを500マイクロリットルのPBSで洗浄する。
500マイクロリットルの0.1%トリトンX 100をチューブに追加します。チューブを室温で1時間インキュベートします。次に、チューブをローテーターまたはシェーカーに200 RPMで2〜8°Cで15分間置きます。
最後のインキュベーションの後、PBS Tに500マイクロリットルの10%NDSを加え、室温で45分間インキュベートします。インキュベーション中に、一次抗体溶液を調製します。翌日、ペレットのサイズに応じて250〜500マイクロリットルのPBS Tをチューブに加え、摂氏2〜8度で1時間、200RPMでローテーターまたはシェーカーに置きます。
200マイクロリットルの二次抗体溶液を加え、暗所で摂氏2〜8度でチューブをインキュベートします。翌日、チューブを回転させ、100マイクロリットルの上清を除去して、染色された頂端アウトエンテロイドの取り付けに進みます。残りの100マイクロリットルの上清に細胞を再懸濁し、細胞懸濁液を500マイクロリットルのチューブに移します。
チューブをミニ遠心分離機で20秒間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを100マイクロリットルの室温遠赤色核酸染色剤に再懸濁する。20分間のインキュベーション後、細胞を遠心分離し、ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸濁します。
2回目の洗浄および遠心分離の後、70マイクロリットルの上清を除去し、ペレットをPBSの残量に再懸濁する。次に、セル懸濁液をラベルの付いた24 x 60ミリメートルのカバースリップに移します。75マイクロリットルの封入剤を試料に直接塗布し、ピペットチップで気泡を取り除きます。
暗闇で一晩硬化させた後、グリセロールの薄層をカバースリップに塗布し、カバースリップをスライドガラスに取り付けて、所定の位置にそっと押し込みます。タップして、カバースリップとスライドの間の気泡を取り除きます。カバースリップを室温で暗所で2時間セットしてから、共焦点顕微鏡で20倍の倍率でエンテロイドをイメージングします。
腸管治療の場合、本文に記載されているように、皿モデルで24時間根尖性壊死性腸炎を確立します。アッセイを実行する前に、各ウェルから100マイクロリットルの培地を取り除き、残りの400マイクロリットルを残します。400マイクロリットルの細胞生存率アッセイ試薬を各ウェルに加えます。
内容物をプレートシェーカーで200 RPMで5分間激しく混合し、細胞溶解を誘導します。次に、200マイクロリットルを96ウェルクリアボトムプレートの単一ウェルに移します。残りの600マイクロリットルについても繰り返し、ウェルごとに4つのテクニカルレプリケートを作成します。
発光が可能なプレートリーダーを使用して、0.25ミリ秒積分で値を記録し、処理間の相対値を比較します。コントロールの代表的な免疫蛍光染色により、内腔に向かう核の頂端部局在と上皮の外縁での悪役の検出が確認されました。対照と比較して、リポ多糖、腫瘍壊死アルファ、または低酸素症単独への曝露は、総細胞形態E-カドヘリンまたは悪役局在または蛍光強度の明白な変化を誘発しなかった。
低酸素症と組み合わせたリポ多糖または腫瘍壊死アルファによる治療は、上皮構造を破壊し、ECA聴覚の喪失および悪役染色によって明らかにされた接着接合部およびブラシ境界タンパク質発現の有意な喪失を示した。頂端アウト細胞生存率は、正常酸素または低酸素条件下で決定した。対照と比較して正常酸素条件下では、リポ多糖または腫瘍壊死αはエンテロイドの細胞生存率に有意に影響しなかった。
しかし、低酸素症単独と比較して、低酸素症と組み合わせたリポ多糖または腫瘍壊死アルファでは、生存率の有意な低下が観察されました。.アピカルアウトインアディッシュモデルを確立しながら。EDTAをセル懸濁液の氷冷状態に保つことを忘れないでください。
これにより、極性反転が強化され、すべてのECMが適切に液化および除去されます。QPCR、RNA-seq、ウェスタンブロッティング、バリア透過性の機能評価などの他のダウンストリームアプリケーションは、低酸素状態における炎症性シグナル伝達に対する応答を特徴付けるためにさらに実行できます。
