このプロトコルは、電離放射線が腫瘍細胞の動員にどのような影響を与えるかを分析するために使用され、さらに開発され、癌再発の理解を深めることができます。乳腺オルガノイドは強力なモデルです。生体内の基本的な特性を模倣しますが、生物学的変数の容易な分離を可能にします。
低接着プレートの使用は、タンパク質マトリックスに関連する作業フローの課題を否定します。トリプルネガティブ乳癌患者は、治療後のより高い率で局所的な再発を経験する。放射線が腫瘍や免疫細胞の挙動にどのような影響を与えるかを調べると、再発メカニズムに関する重要な洞察につながります。
オルガノイドの共焦点顕微鏡を実証しているのは、シルバラ・バティスタ研究所の大学院生ハビエル・ゴメスです。テキストプロトコルに詳述されているように、犠牲マウスから腹部および鼠科乳腺を除去してこの手順を開始する。テキストプロトコルに記載されているサンプルを照射してから45分後、乳腺を35ミリメートルの無菌細胞プレートに入れ、メスを含むミンチを入れる。
組織がリラックスし、面積が約1平方ミリメートル以下の部分が得られるまで、約40ストロークのミンチ。今50ミリリットル遠心分離チューブでコラゲターゼ溶液に組織を転送します。10ミリリットルのコラゲターゼ溶液をマウスあたりに使用してください。
サンプルチューブを水浴に30~60分摂氏37度で置き、10分ごとに5秒間渦を出します。コラゲアーゼ溶液が曇っているとき、消化は完了します。消化した溶液を室温で10分間450倍Gでスピンダウンします。
これで3層が観測されます。上清は脂肪で構成され、中間層は水溶液、底部はペレットです。ペレットは、上皮細胞、個々の間質細胞、および赤血球の混合物であるため、赤色に見える。
BSA溶液の添加および除去によって接触する前にBSA溶液のすべてのピペット、ピペットの先端および遠心分離管を前塗りする。BSA溶液は、各実験の前に滅菌濾過する必要がありますが、再利用することができます。さらなる回復のために、上清を新鮮なBSAコーティングされた15ミリリットルの管に移す。
ピペットは、脂肪層を分散させるために激しく上下します。試料を室温で10分間450倍Gで遠心する。上清を吸引し、細胞ペレットを吸引することを避けるために少量の培地をチューブに残す。
今、元のペレットでチューブから水性層を吸引します。元のペレットを持つチューブにDMEM /F12の10ミリリットルを加え、第2のチューブに移します。ピペットを激しく組み合わせ、2つのペレットを再中断します。
室温で10分間450回Gで遠心した後、上清を吸引し、チューブに4ミリリットルのDMEM/F12を加える。40マイクロリットルのデオキシリボヌクレアーゼを懸濁液に加え、室温で2~5分間手で軽く振ります。DMEM/F12を6ミリリットル加え、ピペットを十分に加えます。
チューブを室温で10分間450回Gで遠心した後、上清を0.5ミリリットルのマークに吸引する。ペレットをDMEM/F12の10ミリリットルに再び懸濁し、ピペットを十分に再懸濁します。今、450倍Gに脈動し、その速度に達した後、4秒停止することによってチューブを遠心分離します。
遠心分化を介してオルガノイドを精製するために、さらに3回洗浄手順を繰り返します。ペレットは、上皮オルガノイドのみで構成されるオフホワイト色にする必要があります。ペレットをDMEM/F12の10ミリリットルで再懸濁します。
ピペットを徹底的に均質な溶液を作成します。50マイクロリットルを30ミリメートルのペトリ皿に移し、20Xで位相対照顕微鏡で見ます。集計カウンターでオルガノイドの数を数えます。
ピペット50マイクロリットルのオルガノイドを低接着板の各ウェルに入る。オルガノイド培地の150マイクロリットルを加える 200 マイクロリットルに総作業量を持って来る。慎重に2日ごとに培地を交換してください。
GFPまたはDトマト標識生264.7マクロファージを10%FPSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを補うDMEM培地で維持する。細胞を所望の密度でオルガノイド培地に播種します。ライブ細胞位相コントラストと蛍光イメージングを使用して、時間の経過に応じマクロファージの浸潤を監視します。
慎重に吸引することによって、ウェルからオルガノイド培地を除去します。室温で15分間、10%中性緩衝ホルマリンでサンプルを固定します。1X PBSで固定オルガノイドを5分間3回洗浄します。
必要に応じて、固定サンプルは、さらなる染色のために1週間摂氏4度で保存することができます。洗浄後、固定オルガノイドを5分間透過させます。PBSで5分間3回洗浄する前に、室温で1時間0.1%PBSTで5%正常ヤギ血清で固定オルガノイドをブロックします。
固定オルガノイドを、抗サイトケラチン-14、Eカドヘリン、またはタイトジャンクションタンパク質1個をPBSTで1%NGSで室温で1時間インキュベートします。その後、PBSTで5分間3回洗浄します。今、ヤギ抗ウサギ二次抗体と1%NGS PBSTを室温で1時間インキュベートします。
光の露出を避けるためにホイルで覆います。前のように洗浄した後、核を約30分間染色するために核染料を使用します。染色したオルガノイドをPBSで5分間洗浄します。
チャンバースライドを使用する場合は、カバースリップ付きマウントします。オルガノイドをホイルで包んだのを摂氏4度で2週間保存します。照射されたオルガノイドは、低接着プレートまたは基基膜内で培養することができたが、最も急速な成長は低接着プレートで起こった。
オルガノイドは乳腺の特徴を再現した。ダクトやローブに形態学的に類似した構造が観察された。成長傾向は、消化および選別後にオルガノイドを直ちに播種すると、照射されていないオルガノイドが照射されたオルガノイドよりも速く成長し、DNA損傷修復のメカニズムに起因する細胞増殖停止による可能性が最も高いことを示した。
オルガノイドは上皮特性を発現し、免疫蛍光染色を通じて評価した。照射されたオルガノイドは上皮マーカーを発現した。ミオエピテリウムのマーカーであるサイトケラチン-14は、照射されたオルガノイドの表面に強く発現した。
さらに、Eカドヘリンおよびタイトジャンクションタンパク質1は、オルガノイドの細胞結合内で発現した。これらのタンパク質は、適切な細胞接着に不可欠です。照射後、オルガノイドは上皮特性を保持し続けた。
オルガノイドの蛍光染色は、蛍光顕微鏡を用いて低接着板内で可視化することができた。しかし、最も明確な可視化は共焦点顕微鏡を介して得られた。補正した全蛍光強度は、背景を減算し、オルガノイド領域による正規化を行って算出した。
96ウェル低接着プレートでオルガノイドを成長させることも、共培養実験を簡素化した。乳腺に典型的な濃度で播種すると、マクロファージ共局在化は照射されたオルガノイドと共に増加した。この手順を行う際に覚えておくべき最も重要なことは、オルガノイドを過剰に消化しないこと、および遠心分化を適切に精製することです。
この手順に従って、追加の共培養実験を行うことができる。オルガノイドは、腫瘍細胞、他の免疫細胞、および間質細胞と共培養して、再発に関連する照射された微小環境を再現することができる。この方法は、正常な組織損傷が免疫細胞のダイナミクスに特異的にどのような影響を与えるかを評価するために重要であり、最終的には腫瘍細胞の採用メカニズムを理解するために使用されます。
乳腺オルガノイドは乳腺の発達のメカニズムを解明し、体外で乳癌を強く再現した。私たちのモデルが放射線誘発性腫瘍細胞のリクルートに関する洞察を提供することを願っています。
