このプロトコルは、細胞増殖とエンタイドの生存を調査することに加えて、培養中の腸内分離に有用である。科学者は、腸内の培養にこの技術を適用し、インビトロで腸上皮細胞に対する薬物および炎症性サイトカインの効果を研究することができます。この技術の意味は、炎症性腸疾患の水療法にも及ぶ。
我々は、いくつかの治療サイトカインを見つけるために、この方法を適用します.この方法は、腸上皮増殖および生存に関する洞察を提供する;加えて、腸以外の組織の周りに培養されたオルガノイドにも使用され得る。腸内窩を分離し、腸内培養を行うために、組織鉗子を使用し、虹彩はさみを見つけて、安楽死させた8週間齢の野生型マウスから約8センチメートルの回腸を解剖する。
ガベージ給餌針付きの注射器を使用して、氷冷ダルベックコのリン酸緩衝生理食塩水の約40ミリリットルで回腸を洗い流し、ハサミで縦に切り、回腸を開きます。回腸を小さく切り、15ミリリットルの円錐形チューブに滅菌氷冷DPBSの5ミリリットルに入れる。その後、氷の上で5分間サンプルを揺らします。
ピペットコントローラを使用してDPBSを吸引し、10ミリリットルのコールドバッファーに交換します。氷の上で30分間揺れた後、ピペットコントローラを使用してバッファ1を吸引し、10ミリリットルのコールドバッファー2に置き換えます。その後、毎分約80回揺れで手で2〜3分間振ります。
揺れの後、顕微鏡下で2つの内容物を緩衝液の20マイクロリットルの液滴を検査し、粒状のPaneth細胞を有する納骨堂があることを確認する。70ミクロンの滅菌細胞ストレーナーを用いた2つの内容物を濾過し、50ミリリットルの円錐管に濾過したバッファーを集める。ピペット20マイクロリットルの濾液をスライド上に濾過し、納骨堂を数える。
フィルター処理されたバッファーの 2 つの内容の十分なボリュームを転送して、井戸あたり約 500 個の暗号が存在することを確認します。摂氏4度で10分間150倍Gでスピンダウンし、上清を慎重に吸引します。500個の暗号に対して50マイクロリットルの基部膜マトリックスで再懸濁する。
気泡を避けるために注意してピペット上下。24ウェルプレートの1つの井戸の中央に、基部膜マトリックスとクリプトミックスの50マイクロリットルの液滴を置きます。37°Cで30分間インキュベートし、基質膜マトリックスを重合します。
重合の30分後、慎重に各ウェルにミニグット培地の600マイクロリットルを追加します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻し、毎日顕微鏡で観察し、2~3日ごとに培地を交換します。腸を通過するには、組織培養プレートを氷の上に置き、培地を吸引し、各ウェルに冷たいDPBSを1ミリリットル加える。
P1000 チップを使用して、行列のチャンクが残らないまでピペットを上下に移動します。サンプルを1ミリリットルのインスリン注射器を通して、15ミリリットルの円錐形チューブに下に渡します。G150倍と摂氏4度で5分間回転した後、ピペットを使用してDPBSを取り除きます。
腸内を井戸当たり50マイクロリットルの基質膜マトリックスで再懸濁する。プレートを37°Cのインキュベーターに30分間置き、基質膜マトリックスを重合させます。次に、ENR培地の600マイクロリットルで各井戸を重ね、プレートをインキュベーターに戻します。
エンタイドを5〜7日間成長させ、1〜2の分割比を使用して新しい24ウェルプレートに渡します。各ウェルにENR培地600マイクロリットルを加え、37°Cインキュベーターで4〜5日間エンターイドをインキュベートします。未処理の腸内の対照群とインターロイキン-22の1ミリリットル当たり5ナノグラムで処理されたエンテロイドの実験群を設定する。
各グループに対して少なくとも 3 つのレプリケートを準備します。600マイクロリットルのEdU培地をエンタイドの各ウェルに加え、背景減算の負のコントロールとして使用するウェルを1つ除きます。37°Cインキュベーターでプレートを2時間インキュベートします。
基部膜マトリックスからエンタイドを収穫するには、ピペットコントローラを使用してEdU培地を吸引し、DPBSで1回洗浄します。その後、DPBSを1ミリリットル加えます。固体基質膜マトリックスの塊が残らないまで、P1000ピペットチップを使用して上下にピペットを使用します。
サンプルを15ミリリットルのチューブに移し、上清を捨てる前に5分間Gの300倍でスピンダウンします。500マイクロリットルの細胞解離酵素を加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、P200ピペットチップを使用してピペットを上下にピペットし、腸内を単一細胞に分解します。
次に、10%の胎児ウシ血清を含むダルベックの修正イーグル培地を3ミリリットル加え、P1000ピペットチップを繰り返しピペットします。300回Gで5分間遠心し、上清を吸引した後、細胞を1ミリリットルのDPBSで懸濁させた。細胞の固定および透過を行うために、まず細胞懸濁液を5ミリリットルチューブの1点に移し、Gで5分間300回スピンダウンし、上清を捨てる。
細胞を4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルに吊り下げ、室温で15分間固定します。5分間Gの300倍で遠心した後、ピペットチップで上清を吸引する。DPBSで細胞を一度洗い、再びスピンダウンして上清を取り除きます。
1ミリリットルの非イオン性界面活性剤を1ミリリットルで再懸濁し、室温で10分間インキュベートしてから、細胞をDPBSで洗浄する。EdUを検出するには、1.5ミリリットルのチューブに反応カクテルを100マイクロリットル加えます。細胞を再懸濁し、光から保護し、室温で30分間インキュベートする。
5分間Gの300倍で遠心した後、ピペットチップで反応液を軽く吸引し、各チューブに0.5%非イオン性界面活性剤浸透剤を加えて室温で1回洗浄する。前のように遠心分離に続いて、1ミリリットルのDPBSで細胞を懸濁させる。40ミクロンのストレーナーで再懸濁細胞を濾過し、15ミリリットルの円錐管に濾過した細胞を集める。
できるだけ早くマシン検出に関する事実を実行します。フローサイトメトリー解析に適したチャンネルと電圧を選択します。格紙の戦略では、FSC-A対SSC-Aの疑似色プロットを描画し、電圧を調整することによって、ほとんどのセルをドットマップの可視範囲に分配します。
セルの母集団を R1 として選択し、左下隅のセルデブリを除外します。R1細胞集団から、FSC-A対FSC-H疑似色プロットを確立する。ゲートを設定して、R2 として指定された単一セルを選択し、セルの束を除外します。
R2細胞集団から、蛍光強度対細胞数プロットを確立し、陰性制御を使用してゲートを設定する。蛍光シグナルの領域は、R3と指定された正の細胞領域であり、実験群と対照群との間のこれらのEdU陽性細胞の比率を比較する。小腸窩を単離し、基部膜マトリックス中のエンテロイドとして培養した。
エンテロイドは、分離の2日後に芽を形成し始めました。6日目、腸内には内腔にたくさんの破片が入った芽が多く入っていました。腸は、この段階で通過する準備ができていました。
エンテノイドをIL-22で3日間処理し、その後、合成DNAを赤で標識し、細胞増殖を示した。IL-22処理されたエンテロイドは、EdU陽性細胞の増加数を示した。IL-22は、フローサイトメトリーで分析した40.1%から83.5%に増殖細胞を増加させた。
IL-22治療はまた、赤でヨウ化プロピジウム染色によって示されるエンタノイドの細胞死を増加させる。IL-22は、フローサイトメトリーで分析した死細胞を4.9%から16.2%に増加させた。暗号分離の進行の間、十分な暗号が揺さぶられるようにバッファを追加した後、公正な揺れが必要です。
顕微鏡で内容物を検査することをお勧めします。この手順に従って、特定の方法を用いて分化された上皮の種類と腸内膜を定量化することも可能です この方法は、研究者がエンテロイドの腸上皮分化を調査するのに役立ちます。その開発後、この質問は、消化器科の分野の研究者がカットの発達または病理学的な質問を探求する方法を開きます。
