Die Lundbeck-Stiftung, Universität Aarhus, Dandrite und Lundbeck a/s unterstützt diese Arbeit.

Hinweis: Führen Sie alle Schritte bei Raumtemperatur, sofern nicht anders angegeben und halten Sie Puffer auf Eis oder in den Kühlschrank stellen (mit Ausnahme von der Elution buffer mit SDS). Das Protokoll ist in 5 Abschnitte unterteilt: Vorbereitung der RNA-Proben; Vorbereitung der Perlen für IP; Bindung von BrU gekennzeichnet RNA zu Perlen; Elutions- und Reinigung des gebundenen BrU gekennzeichnet RNA durch 3 Stufen Phenol-Phenol/Chloroform-Chloroform Extraktion; Analyse der RNA (in diesem Beispiel mit RT-qPCR)
1. Vorbereitung des RNA-Proben
<ol><li>Graf HEK293T Zellen unter Verwendung einer automatisierten Zelle entgegenzuwirken und Saatgut 3.500.000 Zellen in einer 10 cm Petrischale in 10 mL Wachstumsmedien (Dulbeccos geändert Eagle Medium ergänzt mit 10 % fetalen Kälberserum und 50 µg/mL Penicillin/Streptomycin) um insgesamt zu erhalten > 40 µg RNA bei der Extraktion 48 h später. Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2zu erhalten.</li>
	<li>48 h nach der Aussaat, Aspirieren Wachstumsmedien 8 mL und 2 mL auf die Zellen Austrocknen vermeiden hinterlassen. Fügen Sie 2 mM BrU und jede Behandlung auf die 8 mL aspiriert Wachstumsmedien, und entfernen Sie die restlichen 2 mL aus den Zellen vor erneuten 8 mL enthaltende Wachstumsmedien BrU. Vermeiden Sie den Einsatz von frischen Medien auf Antrag von der BrU an den Zellen, da diese Änderungen in der Genexpression zu induzieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Zellen 1 h mit BrU und Behandlung. Waschen Sie die Zellen in 5 mL Hank Puffer und trypsinize der Zellen unter Verwendung von 2 mL 0,05 % Trypsin. Fügen Sie 8 mL Wachstumsmedien um die Reaktion zu stoppen, die Zellen an eine 15 mL Tube übertragen und spin-down der Zellen für 2 min bei 1.000 x g hinzu.</li>
	<li>Entfernen den überstand und Gesamt-RNS aus der Zelle Pellet mit RNA Isolierung extrahieren kit (siehe Tabelle der Materialien) oder jede andere Methode bevorzugt, und eluieren in RNase-freie H2O. Store die RNA bei-80 ° C bis bereit zu gehen.</li>
</ol>2. Vorbereitung von Perlen für IP
<ol><li>Die Anzahl der Samples zu untersuchenden plus eins extra abzurechnen Verlust beim pipettieren und wirbeln mischen bereiten Sie Perlen in Chargen vor. Aufschwemmen Sie Anti-Maus IgG magnetische Beads gründlich durch das Mischen von Wirbel und nehmen Sie 20 µL Perlen pro Probe in eine RNase-freie 1,5 mL-Tube. Ort der 1,5 mL Tube in einem Magnetstativ und lassen ca. 20 s für die Perlen auf der Seite zu sammeln.</li>
	<li>Den überstand zu entfernen, nehmen Sie den Schlauch aus der Magnetstativ und Aufschwemmen in 400 µL 1 X BrU-IP-Puffer durch pipettieren. Drehen Sie das Rohr ganz kurz für 2 s in einer Zentrifuge Tischplatte legen Sie sie zurück in die Magnetstativ und den überstand zu entfernen. Wiederholen Sie die Waschschritt einmal.</li>
	<li>Block unspezifische Bindung an die Perlen mit Heparin. Aufschwemmen der Perlen in 1 mL 1 X BrU-IP + 1 mg/mL Heparin Puffer und drehen für 30 min. waschen die Perlen einmal, wie in Schritt 2.2 verlassen. Hinweis: Heparin ist ein negativ geladenes Polymer, das für die Bindung mit RNAs konkurrieren. tRNA oder andere irrelevant RNAs können auch verwendet werden, wenn die nachgeschaltete Anwendung nicht Sequenzieren ist.</li>
	<li>Aufschwemmen der Perlen in 1 mL 1 x BrU-IP-Puffer und 1,25 µg/Probe Anti-α-Bromodeoxyuridine Antikörper, der erkennt auch BrU hinzufügen. Inkubieren Sie die Perlen für 1 h beim Drehen, oder über Nacht bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen dreimal wie in Schritt 2.2. Aufschwemmen der Perlen in 50 µL/Probe 1 X BrU-IP-Puffer mit 1 mM BrU und lassen drehen für 30 min, die Empfindlichkeit der Antikörper gebunden, die Perlen und hiermit zu senken das Risiko der unspezifischen Bindung UZ ergänzt.</li>
	<li>Waschen Sie die Perlen dreimal wie in Schritt 2.2 und Aufschwemmen in 50 µL/Probe 1xBrU-IP-Puffer.</li>
</ol>3. verbindliche BrU gekennzeichnet RNA, Perlen
<ol><li>RNA-Konzentrationen in der RNA-Auszüge aus Schritt 1.3 Messen mit Ultraviolett-sichtbare Spektrophotometrie, und 40 µg RNA von jeder Probe in RNase-freie H2O auf ein Gesamtvolumen von 200 µL zu verdünnen.</li>
	<li>Erwärmen Sie RNA-Proben für 2 min bei 80 ° C zu denaturieren RNA und Spin kurz in einer Tischplatte Zentrifuge. Fügen Sie 200 µL 2 x BrU-IP + BSA/RNAse-Inhibitor.</li>
	<li>Fügen Sie 50 µL Nukleinsäuretablette und Perlen aus Schritt 2.6 zu jeder Probe vorbereitet und rotierenden 1H waschen die Perlen viermal wie in Schritt 2.2 zu verlassen.</li>
</ol>4. Elutions- und Reinigung der RNA durch 3 Stufen Phenol-Phenol/Chloroform-Chloroform Extraktion
<ol><li>
Eluieren Sie RNA und durchführen Phenol Extraktion
	<ol>
<li>Aufschwemmen der Perlen in 200 µL Elution Puffer zu eluieren RNA, und schnell Danach fügen Sie 200 µL Phenol, pH 6,6 (Vorsicht: giftig, siehe Hinweis unten Schritt 4.1.2), nicht-RNA-Moleküle aus der Probe zu entfernen.</li>
		<li>Whirl-Mischung der Probe und Spin 3 min bei 25.000 x g in einer Tischplatte Zentrifuge. Hinweis: Phenol ist giftig und sollte in einer Dampfhaube Verschleißschutz Haut behandelt werden. Die leicht saure pH-Wert sorgt dafür, dass nur RNA und nicht DNA extrahiert. Die RNA wird in der oberen wässrigen Phase aufgrund der hydrophilen Gebühren bleiben. Die hydrophobe Kerne von Proteinen werden Phenol zu binden und die untere Bio Phenol-Phase bewegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Phenol-Chloroform Extraktion durchführen
	<ol>
<li>Aspirieren Sie soviel obere Phase wie möglich (ca. 190 µL 200 µL, je nach Erfahrung im Handling) und verschieben Sie ihn auf ein Rohr mit 200 µL Phenol/Chloroform, pH 6,6 (Vorsicht: giftig, siehe Anmerkung). Achten Sie darauf, die gleiche Menge über Proben Aspirieren.</li>
		<li>Whirl Mischen der Probe und Spin für 3 min bei 25.000 x g. Hinweis: Chloroform ist giftig und sollte in einer Dampfhaube Verschleißschutz Haut behandelt werden. Chloroform wird hinzugefügt, Phenol, entfernen die nachgelagerte Analyse der RNA durch Hemmung der reversen Transkription14 und Polymerase-Kettenreaktionen15beeinflussen können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Chloroform Extraktion durch Absaugen der oberen wässrigen Phase als vor (jetzt rund 180 µL) durchzuführen und zu einem Schlauch mit 200 µL Chloroform übertragen. Whirl mischen die Probe und spin 3 min bei 25.000 x g.</li>
	<li>Aspirieren der oberen wässrigen Phase als vor (jetzt ca. 170 µL) und überträgt es auf ein Rohr mit 17 µL (1/10-bändige) 3 M CH3COONa, pH 6.0. Fügen Sie zu neutralisieren und RNA aus der wässrigen Lösung auszufällen, 2 µL Glykogen (20 mg/mL), die Ausscheidungen zusammen mit RNA und RNA-Pellet sichtbarer macht.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL 96 % Ethanol um Bindung zwischen den Salzionen und RNA und Mischung zu erhöhen durch Umdrehen der Röhre ein paar Mal. Lassen Sie das Röhrchen über Nacht bei-20 ° C oder 15 min auf Trockeneis.</li>
	<li>Drehen Sie die Probe bei 25.000 x g, 4 ° C für 30 min. verwerfen überstand ohne zu stören das Pellet und waschen Sie das Pellet in 185 µL 75 % Ethanol, Salz zu entfernen. Mit 25.000 x g, 4 ° C für 5 min drehen.</li>
	<li>Verwerfen Sie überstand vollständig zu, ohne zu stören das Pellet und lassen Sie das Pellet 5-10 min mit einem geöffnetem Deckel trocknen. Aufschwemmen Sie in 10 µL RNase-freie H2O auf der Seite der Röhre angewendet, um nicht zu stören das Pellet.</li>
</ol>5. Analyse der RNA
<ol><li>Bereiten Sie cDNA mit einer cDNA reversen Transkription kit (siehe Tabelle der Materialien) oder jede andere bevorzugte Methode mit 2 µL RNA-Probe und 1 µg Hefe Gesamt-RNS als Träger RNA für die cDNA-Synthese-Reaktion (nicht verwendet, wenn cDNA für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet wird). Verwenden Sie 1 µg RNA ohne Hefe RNA für cDNA Vorbereitung der entsprechenden Eingabe.</li>
	<li>Verdünnte cDNA 01:25 und Mix 9 µL verdünnt cDNA mit 10 µL qPCR Mischung und 1 µL Fluorogenic Sonde, beherrschen beide angegeben in der Tabelle der Materialien. Hinweis: Die cDNA-Verdünnung richtet sich nach der cDNA Vorbereitung und qPCR-Methode verwendet.</li>
	<li>Führen Sie das folgende qPCR-Programm (z. B. auf einem 7500 schnell Real-Time PCR System oder Äquivalent): 2 min bei 50 ° C, 20 s bei 95 ° C, 40 Zyklen von 3 s bei 95 ° C und 30 s bei 60 ° C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kofoed, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polo-like+kinase+2+modulates+&#945;-synuclein+protein+levels+by+regulating+its+mRNA+production.">Polo-like kinase 2 modulates &#945;-synuclein protein levels by regulating its mRNA production.</a> Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).</li><li>Imamachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRIC-seq:+A+genome-wide+approach+for+determining+RNA+stability+in+mammalian+cells.">BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells.</a> Methods. 67, 55-63 (2014).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).</li><li>Lee, T. I., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+Regulation+and+its+Misregulation+in+Disease.">Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease.</a> Cell. 152, 1237-1251 (2014).</li><li>Farrer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+kindreds+with+parkinsonism+and+&#945;-synuclein+genomic+multiplications.">Comparison of kindreds with parkinsonism and &#945;-synuclein genomic multiplications.</a> Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).</li><li>Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+alpha-synuclein+with+a+microRNA-embedded+silencing+vector+in+the+rat+substantia+nigra:+Positive+and+negative+effects.">Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects.</a> Brain Res. , 47-60 (2014).</li><li>Cooper, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+exosomal+siRNA+delivery+reduced+alpha-synuclein+aggregates+in+brains+of+transgenic+mice.">Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice.</a> Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).</li><li>Magdalan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Amanitin+induced+apoptosis+in+primary+cultured+dog+hepatocytes.">alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes.</a> Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).</li><li>Lu, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinomycin+D+inhibits+cell+proliferations+and+promotes+apoptosis+in+osteosarcoma+cells.">Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells.</a> Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).</li><li>Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+eukaryotic+transcription.+Which+compound+to+choose?+How+to+evaluate+its+activity?.">Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?.</a> Transcription. 2, 103-108 (2011).</li><li>Tani, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).</li><li>Meneni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Alkynyl-2'-deoxyuridines:+chromatography-free+synthesis+and+cytotoxicity+evaluation+against+human+breast+cancer+cells.">5-Alkynyl-2'-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells.</a> Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).</li><li>Meola, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Nuclear+Exosome+Decay+Pathway+for+Processed+Transcripts.">Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts.</a> Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).</li><li>Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+gene+regulation+by+mRNA+modifications.">Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).</li><li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+inhibitors+-+occurrence,+properties+and+removal.">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).</li><li>Paulsen, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Bru-Seq+and+BruChase-Seq+for+genome-wide+assessment+of+the+synthesis+and+stability+of+RNA.">Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA.</a> Methods. 67, 45-54 (2014).</li><li>D&#246;lken, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay.">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> Rna. , 1959-1972 (2008).</li><li>Raghavan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+mRNA+decay+in+resting+and+activated+primary+human+T+lymphocytes.">Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes.</a> Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).</li><li>Sharova, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+for+mRNA+half-life+of+19+977+genes+obtained+by+DNA+microarray+analysis+of+pluripotent+and+differentiating+mouse+embryonic+stem+cells.">Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells.</a> DNA Res. 16, 45-58 (2009).</li><li>Pandya-Jones, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Splicing+kinetics+and+transcript+release+from+the+chromatin+compartment+limit+the+rate+of+Lipid+A-induced+gene+expression.">Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression.</a> RNA. 19, 811-827 (2013).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz des BrU-IP für Bestimmung der RNA-Produktion durch Kennzeichnung von neu RNA für 1 h mit BrU produzierten, gefolgt von sofortige RNA-Extraktion und Immunopräzipitation BrU gekennzeichnet RNA. Diese Methode ist bisher in Referenz16beschrieben worden, und dieser Artikel enthält einige zusätzliche Schritte, um IP-Spezifität und RNA Reinheit, von Pre-Behandlung von Perlen mit niedrigen Konzentrationen von BrU sowie eine Phenol-Chloroform Reinigungsstufe zu...

5-Bromouridine (BrU) Immunopräzipitation (IP) ermöglicht die Untersuchung der RNA-Produktion in Zellen ohne oder sehr begrenzte Auswirkungen auf die Zelle Physiologie während der kurzen Periode1,2Kennzeichnung. Die Methode basiert auf Einbeziehung der synthetischen Uridin Ableitung BrU in neu synthetisierte RNA gefolgt von IP-Adresse des gekennzeichneten RNA mit Anti-BrU-Antikörpern (Abbildung 1).
Es ist bekannt für Jahrzehnte die Proteinsynthese transcriptionally geregelt werden kann, und die Existenz von Transkriptionsfaktoren wurde vor mehr als 50 Jahren die Hypothese3. Heute ist bekannt, dass verschiedene Krankheiten durch Dysregulation der Transkription und der Stabilität der RNA entstehen (ergänzende Abbildung S1 in Referenz4), und die Fähigkeit, Veränderungen in der Produktion von RNA zu messen ist von großer Bedeutung im Verständnis der Krankheit Entwicklung.
Auf der anderen Seite bieten Werkzeuge, RNA-Produktion zu regulieren neue Möglichkeiten für die Behandlung von Krankheiten, die durch zu wenig oder zu viel Protein-Expression oder Protein Akkumulation wie z. B. bei Morbus Parkinson (PD). Das vorherrschende Protein akkumulieren als unlösliche Aggregate in PD ist α-Synuclein und das Niveau der α-Synuclein knüpft direkt an die Krankheit, wie gen-Multiplikation des α-Synuclein Gens familiäre PD5verursacht. Darüber hinaus sammelt α-Synuclein in gewissem Sinne Konzentration abhängig. Herabregulation von α-Synuclein-mRNA-Niveaus ist daher eine interessante therapeutische Strategie, die erfolgreich erreicht worden ist, mit RNA-Interferenz, um neuronaler Zellverlust im PD Nager-Modelle6,7zu verringern.
Es ist wichtig, um Änderungen in der RNA Produktion verursacht durch Krankheit oder therapeutische Interventionen zu messen können. Modernste Methoden verändert für Steady-State Messhöhen RNA, wie reverse Transkription, gefolgt von quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR), nicht in der Lage sind, die Unterscheidung zwischen Änderungen durch transcriptional Regelung oder RNA-Stabilität. Eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung der RNA Zerfall Sätze blockiert der transkriptionellen Maschinen mit Verbindungen wie α-Amanitin oder Actinomycin D gefolgt von Messungen der verfallenden RNAs. Allerdings gibt es einige Probleme im Zusammenhang mit einer allgemeinen Blockade der Transkription in Zellen, wie Induktion der Apoptose8,9. Neben der zytotoxischen Effekte präsentieren transcriptional Hemmer auch mehrere technische Probleme wie langsame zelluläre Aufnahme von α-Amanitin und mangelnde Spezifität von Actinomycin D (rezensiert in Referenz10).
Um die allgemeine Blockierung der Transkription zu vermeiden, wurden Nukleotidanaloga verwendet, z. B. 5-Ethynyl Uridin (5-EU) und 4-Thiouridine (4-TU) BrU. Diese sind leicht von Säugerzellen aufgegriffen und integriert neu synthetisierte RNA ermöglichen, Puls-Kennzeichnung von RNA innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens. BrU ist weniger toxisch als EU-5- und 4-TU, so dass es die bevorzugte Analogon zur Wahl11,12.
BrU-IP kann verwendet werden, zu untersuchen, die bei RNA-Synthese und Stabilität, und somit zu unterscheiden zwischen den zugrunde liegenden Ursachen der Veränderungen im Gesamt-RNS. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Messung der RNA-Synthese und bezieht sich auf2 für Details zur Untersuchung der Stabilität der RNA um zu verweisen. Um RNA-Synthese zu untersuchen, werden Zellen kurz mit BrU z.B. für 1 h, gefolgt von BrU-IP-1 (Abbildung 1) gekennzeichnet. Dies ermöglicht Messungen der RNA synthetisiert innerhalb der kurzen Zeit der Kennzeichnung und beobachtete Veränderungen geben eine bessere Schätzung der Vorschriften in der RNA-Synthese als durch die Messung von Veränderungen im gesamten RNA durch RT-qPCR. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass obwohl die Kennzeichnung, z. B. nur 1 h dauert Abbau noch einen Einfluss auf die RNA-Ebenen beobachtet haben kann.
RNS von BrU-IP-Experimente eignen sich für nachgelagerte Analyse von RT-qPCR1 oder nächste Generation Sequenzierung2,13. Andere standard RNA Nachweisverfahren, wie Nordbeflecken oder Ribonuklease-Protection-Assay können auch für bestimmte RNAs gelten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ribolock Rnase inhibitor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EO0381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11202D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Bromodeoxyuridine mouse antibody</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>555627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 1000</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Ultraviolet-visible spectrophotometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-Saturated Phenol pH 6.6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pure RNA isolation Kit</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11828665001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4368814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4444557</td>
			<td>qPCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman RNA probes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1</td>
			<td>Flurogenic probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-Time PCR system</td>
			<td colspan="2">Applied Biosystems</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>S0115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>A2213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xBrU-IP Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer supplemented with 1 &#956;g/&#956;L BSA and 80 U/mL Ribolock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrU-IP+ 1 mg/mL heparin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1xBrU-IP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 &#956;g/&#956;L BSA and 20 U/mL Ribolock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elution buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.1% SDS in RNAse-free H2O</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigation of rna synthesis using 5-bromouridine labelling and immunoprecipitation

Wenn Steady-State RNA-Ebene zwischen zwei Bedingungen verglichen werden, ist es nicht möglich zu unterscheiden, ob Änderungen durch Veränderungen in der Produktion oder Abbau der RNA entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung der RNA-Produktion, mit 5-Bromouridine Kennzeichnung von RNA, gefolgt von Immunopräzipitation, die Untersuchung der RNA synthetisiert innerhalb eines kurzen Zeitraums (z.B. 1 h) ermöglicht. Der Vorteil von 5-Bromouridine-Kennzeichnung und Immunopräzipitation über die Verwendung von giftigen transcriptional Hemmer wie α-Amanitin und Actinomycin D ist, dass es keine oder sehr geringe Auswirkungen auf die Zellviabilität bei kurzfristigen Einsatz. Da 5-Bromouridine-Immunopräzipitation nur RNA produziert innerhalb der kurzen Kennzeichnung Zeit erfasst, langsam erzeugt sowie schneller abgebaut kann RNA jedoch schwierig, mit dieser Methode zu messen sein. Die 5-Bromouridine-gekennzeichnete RNA durch 5-Bromouridine-Immunopräzipitation erfasst kann durch reverse Transkription, quantitative Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzierung der nächsten Generation analysiert werden. Alle Arten von RNA untersucht werden können, und die Methode beschränkt sich nicht auf mRNA zu messen, wie in diesem Beispiel dargestellt wird.

Unsere ersten Tests der BrU-Kennzeichnung Zeit wurden AsPC-1-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden für 0, 1, 2 und 4,5 h, gefolgt von insgesamt RNA-Extraktion und BrU-IP mit BrU behandelt. GAS5 und GAPDH wurden in BrU-IP-RNA, gemessen, die bewiesen, dass 1 h Kennzeichnung ausreichend, eine ca. 9 - und 44 - fache-Änderung im Vergleich zum Hintergrund (0 h) für GAPDH und GAS5, bzw. zu erreichen war.
BrU-IP und der oben beschr...

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Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

Diese Methode kann verwendet werden, um RNS-Synthese zu messen. 5-Bromouridine Zellen hinzugefügt und synthetisierte RNA eingebaut. RNA-Synthese wird durch RNA-Extraktion unmittelbar nach der Kennzeichnung, gemessen, gefolgt von 5-Bromouridine-gezielte Immunopräzipitation gekennzeichneten RNA und Analyse durch reverse Transkription und quantitative Polymerase-Kettenreaktion.

Untersuchung der RNS-Synthese mit 5-Bromouridine Kennzeichnung und Immunopräzipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K Aufrufe.  Aarhus University. Diese Methode kann verwendet werden, um RNS-Synthese zu messen. 5-Bromouridine Zellen hinzugefügt und synthetisierte RNA eingebaut. RNA-Synthese wird durch RNA-Extraktion unmittelbar nach der Kennzeichnung, gemessen, gefolgt von 5-Bromouridine-gezielte Immunopräzipitation gekennzeichneten RNA und Analyse durch reverse Transkription und quantitative Polymerase-Kettenreaktion.

Serie: Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a synthetic RNA duplex created to specifically target a mRNA transcript to induce its degradation and it has been used to identify novel pathways in various cellular processes. Few reports exist regarding the role of phosphorylated heat shock protein 27 (HSP27) in corneal epithelial wound healing. Herein, cultured human corneal epithelial cells were divided into a scrambled control-siRNA transfected group and a HSP27-specific siRNA-transfected group. Scratch-induced directional wounding assays, and western blotting, and flow cytometry were then performed. We conclude that HSP27 has roles in corneal epithelial wound healing that may involve epithelial cell apoptosis and migration. Here, step-by-step descriptions of sample preparation and the study protocol are provided.

Herein, we present a protocol to use heat shock protein 27 (HSP27)-specific small interfering RNA to assess the function of HSP27 during corneal epithelial wound healing. RNA interference is the best method for effectively knocking-down gene expression to investigate protein function in various cell types.

RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Forschung

Genetik

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Analyse des c-KIT-Liganden-Promotors unter Verwendung von Chromatin-Immunpräzipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

Untersuchung von Protein-Rekrutierung, DNA-Läsionen mit 405 Nm Micro-Laserbestrahlung

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of a wide range of transcription factors (TFs) and cofactors mediating transcriptional activation or repression via changes in chromatin structure. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a useful molecular biology approach for mapping histone modifications and profiling transcription factors/cofactors binding to DNA, thus providing a snapshot of the dynamic nuclear changes occurring during different biological processes.
To study transcriptional regulation in adipose tissue, samples derived from in vitro cell cultures of immortalized or primary cell lines are often favored in ChIP assays because of the abundance of starting material and reduced biological variability. However, these models represent a limited snapshot of the actual chromatin state in living organisms. Thus, there is a critical need for optimized protocols to perform ChIP on adipose tissue samples derived from animal models.
Here we describe a protocol for efficient ChIP-seq of both histone modifications and non-histone proteins in brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. The protocol is optimized for investigating genome-wide localization of proteins of interest and epigenetic markers in the BAT, which is a morphologically and physiologically distinct tissue amongst fat depots.

Here we describe a protocol for efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) followed by high-throughput DNA sequencing (ChIP-seq) of brown adipose tissue (BAT) isolated from a mouse. This protocol is suitable for both mapping histone modifications and investigating genome-wide localization of non-histone proteins of interest in vivo.

Chromatin Immunopräzipitation der murinen braunen Fettgewebe

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene expression. The cellular transcriptional machinery and its chromatin modification proteins coordinate to regulate transcription. To analyze transcriptional regulation at the molecular level, several experimental methods such as electrophoretic mobility shift, transient reporter and chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays are available. We describe a modified ChIP assay in detail in this article because of its advantages in directly showing histone modifications and the interactions between proteins and DNA in cells. One of the key steps in a successful ChIP assay is chromatin shearing. Although sonication is commonly used for shearing chromatin, it is difficult to identify reproducible conditions. Instead of shearing chromatin by sonication, we utilized enzymatic digestion with micrococcal nuclease (MNase) to obtain more reproducible results. In this article, we provide a straightforward ChIP assay protocol using MNase.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool for understanding the molecular mechanisms of gene regulation. However, the method involves difficulties in obtaining reproducible chromatin fragmentation by mechanical shearing. Here, we provide an improved protocol for a ChIP assay using enzymatic digestion.

Chromatin Immunoprecipitation Assay mit Mikrokokken-Nukleasen in Säugetierzellen

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT employs two purification steps. First, immunoprecipitation of a tagged RNP subunit is followed by mild RNase digestion and subsequent non-denaturing affinity elution. A second immunoprecipitation of another RNP subunit allows for enrichment of a defined complex. Following a denaturing elution of RNAs and proteins, the RNA footprints are converted into high-throughput DNA sequencing libraries. Unlike the more popular ultraviolet (UV) crosslinking followed by immunoprecipitation (CLIP) approach to enrich RBP binding sites, RIPiT is UV-crosslinking independent. Hence RIPiT can be applied to numerous proteins present in the RNA interactome and beyond that are essential to RNA regulation but do not directly contact the RNA or UV-crosslink poorly to RNA. The two purification steps in RIPiT provide an additional advantage of identifying binding sites where a protein of interest acts in partnership with another cofactor. The double purification strategy also serves to enhance signal by limiting background. Here, we provide a step-wise procedure to perform RIPiT and to generate high-throughput sequencing libraries from isolated RNA footprints. We also outline RIPiT&#39;s advantages and applications and discuss some of its limitations.

Identification of Footprints of RNA:Protein Complexes via RNA Immunoprecipitation in Tandem Followed by Sequencing RIPiT-Seq

Here, we present a protocol to enrich endogenous RNA binding sites or &#34;footprints&#34;&#160;of RNA:protein (RNP) complexes from mammalian cells. This approach involves two immunoprecipitations of RNP subunits and is therefore dubbed RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT).

Identifizierung von Fußabdrücken von RNA:Protein-Komplexe über RNA-Immunpräzipitation im Tandem gefolgt von Sequenzierung (RIPiT-Seq)

RNA immunoprecipitation in tandem (RIPiT) is a method for enriching RNA footprints of a pair of proteins within an RNA:protein (RNP) complex. RIPiT ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

High-Density DNA und RNA Mikroarrays - Photolithographische Synthese, Hybridisierung und Vorbereitung von großen Nukleinsäurebibliotheken

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...