飼育とデータ収集を支援した以下の人々 に感謝我々: D. Tegtmeier、C. De Jong、j. ホークス、k. Fossen、s. パーシバル、m. マクウィリアムス、l ・ ベルトーラ、m. スチュワート、N. ハーニー、t. Knavel;M. Merces 解剖について。我々 はまた m ・ マクファデン、P. ハーローとl ・ v ・ アルピナを上げるためタロンガ動物園、G. P. コロボリーを高めるため Marantelli に感謝したいと思います。F. Pasmans、a. マーテル、C. コンスタンティン、A. Kladnik、TUNEL 法について・ r ・ ウェッブのアポトーシスの分析についてのアドバイスを感謝し、t. Emeto との w. Weßels、プロトコル、カスパーゼ 3/7 試金のためのキット。この原稿とプロトコルは Brannellyら2017年ピア J22.から適応します。

ジェームス ・ クック大学は、 l ・ v ・ アルピナのP. コロボリーと A1897 と A2171 アプリケーション A1875 で動物の倫理を承認しました。
1. 動物飼育および監視
<ol><li>適切な水の供給とクリーニングのスケジュールと、種のために適切な環境で動物を個別に家します。動物を毎日チェックします。<ol>
<li>絶滅危惧Pseudophryne コロボリーのアダルト個体 (Tunel、セクション 4) を使用し、(カスパーゼ 3/7 試金のため、セクション 5)、絶滅危惧Litoria verreauxii アルピナ寄付から飼育下繁殖施設。苔上の 15-18 ° C で動物を維持し砂礫質、逆浸透膜水を毎日それらを霧し、読み込んでコオロギと毎週 3 回をフィードします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>毎週ごとの個別の 1 回のデータを収集します。ステップ 2.1 で説明されるようにBdの個人、綿棒します。近づいたときの 0.1 g、尺度を使用してそれぞれの動物の重量を量るし、ダイヤルのカリパスを使用して最も近い 0.01 mm (SVL) 長さを口に鼻を測定します。</li>
	<li>(セクション 3 に従って) 接種後動物の倫理ガイドラインに準拠して (不規則な皮膚泥沼、inappetence、足の発赤、倦怠感、または遅延の立ち直り反射) 感染の臨床症状に毎日動物をチェックします。臨床症状と合併症が存在する場合、動物を安楽死させます。<ol>
<li>トリカインメタネスルフォネイト (MS222) の過剰摂取で安楽死 (0.1 w/v MS222 高齢者の水道水中の炭酸水素ナトリウムと ph 6-7)。10 分停止の動きすべての後、彼らは刺激への応答を表示しない MS222 で動物を飼います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bd感染試験
<ol><li>Bdのかみ
	<ol>
<li>各動物は、新しい滅菌レーヨン綿棒 (1 頭につき 1 つ綿棒) と綿棒します。次の拭き取り方法: 各太もも、サイド、および四肢の 5 回にあわせて、5 回。これは、45 ストロークの合計です。</li>
		<li>中に、DNA の効果的なキャプチャを確保するためストローク間やさしく綿棒を回転します。1.5 mL 遠心管を綿棒の先端を切るし、抽出まで-20 ° C で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA の抽出と qPCR 法<ol>
<li>0.5 mm シリカビーズの 30-40 mg の市販 DNA 抽出試薬 50 μ L を追加することによって、綿棒からゲノム DNA を抽出します。ビーズは、2 分の最大速度でビーズ ビーター細胞ホルモンでサンプルを破った。次のビーズ ビーター ステップ 1 分 2,000 x g でサンプルを遠心します。</li>
		<li>100 ° C 10 分でサンプルをインキュベート、冷まします。3 分間 5,000 × g でサンプルを遠心し、個々 の 1.5 mL マイクロ遠心チューブに上清を転送 qPCR まで-20 ° C で保存します。</li>
		<li>ボイルらを次の量的な PCR (qPCR) を使用します。200418感染の負荷を分析します。次の変更を使用します。<ol>
<li>DNA 抽出のサンプル 6:100 二重脱イオン水で希釈します。ウシ血清アルブミン (BSA) の 0.7 μ L を各ウェル PCR 阻害を防ぐために追加します。Singlicate では、各サンプルを実行します。各プレートの希釈標準の一連の遊走子 (感染症) の負荷を推定するのに負 (テンプレートなし) コントロールと肯定的なコントロールを使用します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 接種
<ol><li>文化Bd
	<ol>
<li>1 L の脱イオン水にトリプトンの 16 g、ゼラチン加水分解物、2 g および 4 g の乳糖 (TGHL) を追加することによって文化のスープを準備します。オートクレーブ (121 ° C で 40 分) スープを冷却することができ。</li>
		<li>(この場合は、ニューサウス ウェールズ州分離、AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1 通路番号 11 から分離された) でBd分離を接種する TGHL スープの 23 ° c、7 d のため成長し、スープ文化を TGHL 寒天培地プレートに転送。</li>
		<li>板をするためには、トリプトンの 16 g、ゼラチン加水分解物 2 g、4 g の乳糖 (TGHL)、および細菌寒天 10 g を 1 L の脱イオン水とオートクレーブ (40 分のための 121 ° C) に追加します。混合物が十分に、クールなしかし、それが固化する前に、TGHL 寒天に注ぐ 92 mm 直径培養皿、クラス II 生物学的安全キャビネットでは、1/4、1/3 完全。</li>
		<li>寒天が固化と完全に冷却、液体スープからBdの 0.5 mL、各プレートを接種して均等に。約 1 h の皿の上を乾燥させると、プラスチック パラフィン フィルム プレートをシールBdスープ混合物を許可します。5-7 d の 23 ° c 下平板寒天培地側を孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遊走子接種ソリューションの洪水プレート<ol>
<li>接種前に「毎日の生存を確保するため倒立顕微鏡下で遊走運動を確認します。水泳の遊走子のう外多数の遊走子を高い、遊走子リリースのとき文化は接種の準備ができて。</li>
		<li>高齢者の水道水や人工池の水 3 mL、各プレートをプレートに水を注ぐと水の中に解放する遊走子を許可する 10 分間室温でインキュベート洪水します。潜伏期間後に、新しい滅菌コンテナーに遊走子懸濁液をデカントします。</li>
		<li>製造元の指示に従って、haemocytometer を使用して遊走子濃度を推定します。遊走子懸濁液の濃度が判明すると、高齢者の水道水を 3 mL あたり 1 x 106遊走子の濃度に懸濁液を希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>動物に接種します。<ol>
<li>そのベンター19個別 50 mL 容器の上接種混合注ぐ 3 mL を各動物を接種します。過剰接種接種コンテナーのベースに収集するを許可します。感染症を確実に 24 h の個別接種コンテナーで各動物を残すし、24 h, 接種後消毒テラリウムに個々 を返します。<ol>
<li>13% のボリューム (v/v) 商業漂白ソリューション20を使用して terraria を消毒、すすぎ、少なくとも 2 回水、24 時間以上乾かします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bdの-負のコントロール、模擬 3.2 3.3 の場合と同じ方法を使用して動物に接種するが、 Bdの洪水-接種した寒天版Bdの高齢者の水道水 5 mL で無料寒天を代わりに。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Tunel
<ol><li>1.3.1、ステップとBdの等しい数で説明されているようにはツボカビの臨床徴候を示している動物の安楽死-負の制御動物。</li>
	<li>皮膚の解剖 (背側、腹側と太もも) それぞれの動物からのサンプル。4 %v/v リン酸緩衝ホルムアルデヒドの 2 h の肌サンプルを修正します。短いと一貫性のある時間を修正により、完全に確定するために組織の効果的かつ正確な免疫組織化学染色ができます。区分のための埋め込みまでを 80% エタノールに転送します。</li>
	<li>次の標準的な方法21組織の準備のためのパラフィン ワックスに皮膚を埋め込みます。簡単に言えば、プロトコルは次のとおりです。<ol>
<li>エタノールの一連の階級における組織の脱水、キシレンとエタノールをクリアします。組織をパラフィン ワックスで埋め込むし、1 つのパラフィン ブロック内の個々 のすべての 3 つの皮膚のサンプルを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次の標準的な組織学的準備21ミクロトームを使用してセクションのスキンです。セクションは 5 μ m で連続的組織、親水性のガラス スライドを押さなければ。スライドごとに肌タイプごとの 4 つのシリアル histosections を配置します。シリアル皮膚セクションと個人ごとの 3 つのスライドは、各スライドが貼付されている各組織の 4 つのセクションを持っていることを覚えています。</li>
	<li>次の順序でスライドを染色するには。<ol>
<li>ヘマトキシリン エオシン (H & E) counterstaining が続くと、最初のスライドを染色します。このスライドは、皮膚内でBd胞子嚢の位置を視覚化することです。</li>
		<li>2 番目のスライドは次の組織学的準備のため市販の tunel 染色し、は以下の製造元の指示に従ってください。<ol>
<li>まず、キシレン洗浄、あたりの 5 分の 3 つの変更とスライドを洗浄することにより coplin jar に切片を deparaffinize、100% のエタノールの 5 分の 2 つの変更で洗うたびに従ってください。5 分の PBS のワンウォッシュと 95% のエタノールの 3 分し、3 分仕上げの 70% のエタノールの 1 洗浄に従ってください。</li>
			<li>新鮮な希薄蛋白質消化酵素 (20 μ g/mL の PBS で希釈した濃度ではプロテアーゼ K) と組織を前処理し、スライドに直接追加します。15 分洗浄 2 分の coplin jar に PBS の 2 つの変化間インキュベートすることができます。</li>
			<li>余分な液体をオフにタップし、室温で 2 分間 coplin jar に PBS の 3.0% 過酸化水素で癒します。5 分間、PBS で 2 回すすぎ洗うたび。</li>
			<li>余分な液体をオフにタップ、スライドの組織に直接平衡バッファーの 75 μ L/5 cm2を適用します。セクションの周り余分な液体を 10 s. タップ間インキュベートし、遊離 tranferase (TdT) 酵素の作業の 55 μ L/5 cm2を適用します。37 ° C で 1 時間加湿チャンバー内で孵化します。</li>
			<li>作業強度停止/洗浄バッファーの coplin jar にスライドを置く TdT 孵化後 15 の扇動 s と室温で 10 分間インキュベートします。洗浄あたり 1 分の PBS の 3 つの変更を使用してスライドを洗います。余分な液体オフをタップします。</li>
			<li>組織、65 μ L/5 cm2に部屋の温度に温められてアンチ ジゴキシゲニン共役 (ローダミン) を適用します。室温で 30 分間加湿チャンバー内で孵化、光への暴露を避けます。洗浄あたり 2 分の PBS の 4 つの変更で洗ってください。余分な液体オフをタップします。</li>
			<li>0.5 - 15 μ L 追加で仕上げカウンター染色として動作するスライド スライド マウント中 1 μ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)。その後、カバー スリップでカバーし、爪のマニキュアやゴム系のシール。試金は光に敏感、暗闇の中で乾燥するスライドを許可します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>汚れ 3 スライドは染色 DAPI 対比染色、tunel を使用して、各サンプルのポジティブおよびネガティブ コントロールとして使用します。 メモ: コントロールのスライド 4 の histosections の最初の 2 が肯定的な制御の複製と最後の 2 が陰性対照をレプリケート。<ol>
<li>肯定的なコントロールの代わりに、ステップ、4.5.2.2 前 DN バッファー (pH 7.2、MgCl2、4 mM 0.1 mM DDT 基本、30 mM trizma) で組織を扱うし、5 分間室温でインキュベートを聞かせてください。Dnase DN では 0.1ug の最終濃度のバッファーを溶解し/mL、スライドに直接それを適用します。室温で 15 分間インキュベートします。 その後、スライドで洗う dH2O 5 洗浄 3 分洗うたび。余分な液体オフのしみ。4.5.2.3 のセクションの指示に従って、tunel を再開します。</li>
			<li>マイナス コントロールの追加しないでください遊離 tranferase (TdT) 酵素それらのサンプルを (前述のセクション 4.5.2.4)。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>分析の完了後直ちに TUNEL スライドを観察します。<ol>
<li>かかる写真、アポトーシス細胞を明らかにし、紅白 DAPI すべて核を明らかにし、青で表示されますが表示されます、ローダミン汚れ両方のフィルターを使用して、蛍光顕微鏡を用いた X 200 の各皮膚セクションに沿って間隔をランダムに、オーバーレイ細胞を生成することができます。セルが少なくとも 100 サンプルごと皮膚セクションごと撮影されているを確認します。-20 ° c. で暗い顕微鏡ボックスでスライドを保存します。</li>
		<li>画像あたり (青い DAPI 染色) のセルをカウントします。皮膚セクションあたり少なくとも 100 セルがカウントされますを確認します。セルが 100 に達すると、イメージ内のすべてのセルをカウントします。以下、100 のセルが 1 つのイメージに存在する場合は、動物あたり皮膚セクションあたり少なくとも 100 のセルに達するまで別のイメージをカウントします。</li>
		<li>次に、同じ画像 (赤いローダミン染色) における TUNEL 陽性細胞数をカウントします。壊死や背景ではなく、アポトーシスを示す TUNEL 陽性細胞は、明細胞エッジ (膜がない溶解をそのまま) を持つ単一のセルです。時々 セル縮小アポトーシス体を形成します。</li>
		<li>TUNEL 法でカウントを設置し、H & E 染色の histosections に対応する領域を分析します。H & E 染色標本がBdを保証するBd伝染のサイトに対応していることを確認-TUNEL 法でアポトーシス細胞をカウントする場合は、感染したサイトが使用されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. カスパーゼ 3/7 アッセイ
<ol><li>( Bd- 露出とBd- 負の両方)、それぞれの動物からつま先のヒントを収集一度毎週週 3 ポスト接種と隔週個人ごと 8 つま先までの実験の終わりを通して。<ol>
<li>火炎滅菌ハサミで第 2 指骨でつま先先端をカットし 1.5 mL マイクロ チューブに配置し、-80 ° c. ですぐにフリーズ</li>
	</ol>
</li>
	<li>冷凍つま先サンプルからタンパク質を抽出します。<ol>
<li>サンプルバッファー (25 mM HEPES pH 7、5 mM MgCl2) 1.5 mL スクリュー キャップ チューブの 2 つのステンレス ビーズ (3.2 mm) の 100 μ L のサンプルを置きます。4 サイクル 1 分ビーズ氷の上 3 分続く (で使用されるステップ 1.2.1 として同じビーズ ビーター) の最大の速度で打つことによってサンプルを溶解させます。溶解後、12,000 g x と 4 ° C、アッセイに使用する 5 分上澄みでサンプルを遠心します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ブラッドフォードの試金を使用してサンプルあたりのタンパク質濃度を定量化します。<ol>
<li>384 ウェル プレートでブラッドフォード試薬を 10 μ l 添加 10 μ L 蛋白質のエキスをミックスし、室温で 2 分間インキュベートします。重複の各サンプルを実行、5 のシリーズと一緒に折る BSA 希釈標準。595 で吸光度を読み nm 吸光プレート リーダーに。</li>
	</ol>
</li>
	<li>また、つま先先端サンプルが小さすぎる (タンパク質濃度最低標準に近い手順、4.3.1 でブラッドフォードの試金から決定されたまたはある場合はサンプリング カエル未満 3 g 総重量) 場合は、皮膚表面を推定してサンプルを標準化します。ブラッドフォードの試金の代わりに写真を使用しての領域。<ol>
<li>カスパーゼの試金のためのサンプルからタンパク質を抽出する前に写真の倒立顕微鏡を使用して 40 倍の倍率で指を実行します。</li>
		<li>つま先部の推定によるイメージング ソフトウェア、コンピューターを使用してつま先のサンプルを分析します。つま先クリップの端の周りに線を描画することによってこれを行うし、図形のイメージング ソフトウェア見積もりエリアがあります。3次元皮膚サンプルの表面積を概算 π (3.14) でその領域を乗算 (断面積 × 長さとして (円周率 × 直径) チューブの外側の表面の領域を与える)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カスパーゼ 3/7 分析を実行します。<ol>
<li>384 よく発光板で市販カスパーゼ 3/7 試薬を 10 μ l 添加し、タンパク質抽出液の 10 μ L を追加します。3 通では、各サンプルを実行します。</li>
		<li>室温で 30 分間光から離れたプレート 15 s. 加温のためゆっくりと板を振ることによって試薬を混ぜます。発光プレート リーダーを使用して発光を測定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide.">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li><li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spread+of+chytridiomycosis+has+caused+the+rapid+global+decline+and+extinction+of+frogs.">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li><li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+chytridiomycosis,+a+cause+of+catastrophic+amphibian+declines.">Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines.</a> Science. 326 (5952), 582-585 (2009).</li><li>Woodhams, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+trends+associated+with+skin+peptide+defenses+against+chytridiomycosis+in+Australian+frogs.">Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs.</a> Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).</li><li>Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicted+disease+susceptibility+in+a+Panamanian+amphibian+assemblage+based+on+skin+peptide+defenses.">Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses.</a> Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).</li><li>Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+defenses+of+amphibian+skin:+antimicrobial+peptides+and+more.">Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more.</a> Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).</li><li>Savage, A. E., Zamudio, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+genotypes+associate+with+resistance+to+a+frog-killing+fungus.">MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus.</a> PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).</li><li>Bataille, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+amphibians+to+chytridiomycosis+is+associated+with+MHC+class+II+conformation.">Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation.</a> Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).</li><li>Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+local+immune+responses+by+the+frog-killing+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).</li><li>Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chytridiomycosis+on+hematopoietic+tissue+in+the+spleen,+kidney+and+bone+marrow+in+three+diverse+amphibian+species.">Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species.</a> Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).</li><li>Brutyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Batrachochytrium+dendrobatidis+zoospore+secretions+rapidly+disturb+intercellular+junctions+in+frog+skin.">Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin.</a> Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).</li><li>Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+cycle+stages+of+the+amphibian+chytrid+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).</li><li>Pasmans, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chytridiomycosis+related+mortality+in+a+midwife+toad+(Alytes+obstetricans)+in+Belgium.">Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium.</a> Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).</li><li>Ellison, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+skin+deep:+Functional+genomic+basis+for+resistance+to+amphibian+chytridiomycosis.">More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis.</a> Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).</li><li>Fites, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+invasive+chytrid+fungus+of+amphibians+paralyzes+lymphocyte+responses.">The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses.</a> Science. 342 (6156), 366-369 (2013).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+determine+specificity+and+sensitivity+of+the+TUNEL+reaction+in+the+quantitation+of+apoptosis.">A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis.</a> American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).</li><li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+(Batrachochytrium+dendrobatidis)+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay.">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).</li><li>Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+with+infectious+disease+increase+their+reproductive+effort:+evidence+for+the+terminal+investment+hypothesis.">Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis.</a> Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).</li><li>Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+disinfectants+effective+against+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).</li><li>Woods, A., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).</li><li>Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cell+death+in+frogs+with+chytridiomycosis.">Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis.</a> PeerJ. 5, e2925 (2017).</li></ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

我々 は、上皮のアポトーシスおよび致命的な病気カエルツボカビの検査またはBdの影響を受けやすい種の病害抵抗性のメカニズムの潜在的なメカニズムとして細胞死を探った。表皮、tunel 表皮細胞死解析その場での感染の進行中の表皮細胞死を監視するためのカスパーゼ 3/7 アッセイにおける細胞死を評価する 2 つの方法を使いました。細胞死・ アポトーシス伝染ロードに関連?...

両生類が現在 1 つすべての脊椎動物の分類群の1のグローバル生物多様性の最大の損失を経験してください。これらの減少の主要な原因は、ツボカビ菌 Bd2病原菌によって引き起こされる致命的な皮膚疾患ツボカビです。病原体表面的に重篤な電解質の喪失、心停止と死3皮膚機能の中断につながることが表皮に感染します。抗菌ペプチド4、5、皮膚細菌叢6免疫細胞受容体7、8など、 Bdに対してさまざまな潜在的なホスト免疫メカニズムを検討中リンパ球の活動9,10。しかし、ほとんどの研究は、上皮のアポトーシスと細胞死がこの致命的な病原体に対して免疫機構かどうかを します。
細胞死のいずれかを介してアポトーシス (プログラムされた細胞死) や表皮の壊死 (プログラムされていない死)、 Bd感染病理があります。前の研究Bd感染可能性があります皮膚外植体を遊走子清体外11.にさらされているとき細胞接合の破壊を観察がアポトーシスを誘導することを示唆しています。さらに、 Bdの退行性表皮変化-電子顕微鏡12,13を使用して感染したカエルを観察。トランスクリプトーム解析を示しアポトーシス経路は、感染した皮膚14で亢進、両生類の脾細胞アポトーシスを受けるは、 Bd の in vitro培養上清15にさらされる場合。Bdが引き起こすことができることを示唆する証拠の増加量にもかかわらずアポトーシスとホストの細胞死体外、体内の研究を探索したり、感染の進行中のメカニズムに欠けているアポトーシスを定量化します。さらに、それは、ホストがBd感染と戦うため防御免疫戦略としてアポトーシスを使用している場合、またはアポトーシスと疾患の病理は、知られているは。
本研究では感染している動物の生体内で2 つの方法を使用して表皮細胞死・ アポトーシスを検出目指して: カスパーゼ 3/7 蛋白質の試金と端末媒介 dUTP ニック終わりラベル (TUNEL)その場での試金。各測定は、細胞死の16のさまざまな側面を検出した、一緒にこれらのメソッドは細胞死に関与するメカニズムの完全な理解を提供し、効果の正確な測定を確保します。カスパーゼ 3/7 アッセイは、両方の組み込みと外因性アポトーシス経路の定量化を可能にするエフェクター カスパーゼ 3 および 7 の活動を定量化します。対照的に、TUNEL アッセイは、アポトーシスや壊死 pyroptosis17を含む細胞死のメカニズムによって引き起こされる DNA 断片化を検出します。TUNEL 法を使用して、3 つの異なる肌のセクションを使用して臨床的に感染していると感染していないの両方の動物の表皮内の細胞死の場所を調査する: 背部、ベンターとPseudophryne のお祭りの腿。このメソッドは、特定の表皮層内での位置を区別することと同様、細胞死の解剖学的サイトを識別します。Litoria verreauxii アルピナで 8 週感染症全体のアポトーシスの時間シリーズの定量化を実施するのにカスパーゼ 3/7 試金を使用しています。我々 は同じ動物から隔週つま先先端サンプルを取る、カスパーゼ 3/7 活動に病原体伝染ロードを関連付けることです。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>POLARstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Luminescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well flat clear bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well low flange white flat bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological (Oxoid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>OXLP0011B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>6764254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactose Broth (Oxoid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>OXCM0137B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane-S (MS-222)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0872873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15561020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile rayon swab</td>
			<td>Medical Wire &#38; Equipment</td>
			<td>MW-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Bradford reagent</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase Glo&#160; 3/7</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1374248-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin hydrolysate Enzymatic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X)</td>
			<td>Thermo/Life</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepman</td>
			<td>Thermo/Life</td>
			<td>4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4444556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Scan florescent miscroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Florescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm stainless steel beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079132SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer ITSI-3 Chytr (5&#8242;-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5.8S Chytr (5&#8242;-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minor groove binder probe Chytr MGB2(5&#8242;-CGAGTCGAAC-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene qPCR Instruments</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petri plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>263991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using terminal transferase-mediated dutp nick end-labelling (tunel) and caspase 3/7 assays to measure epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis

両生類は、世界的に生物多様性に大きな損失を経験している主要な原因の一つ、伝染性の病気カエルツボカビです。病原菌ツボカビ菌(Bd) に感染するとカエルの表皮の妨害によって引き起こされるしかし、病理学的変化があるされて明示的に特徴付けられない。アポトーシス (プログラムされた細胞死) は、ホスト組織を損傷する病原体により使用できますが、耐病性の病原体の除去のためのホスト メカニズムことができます。本研究で我々 は 2 つの異なるアッセイを使用して感染し、感染動物の表皮細胞死を定量化: ターミナル トランスフェラーゼを介した dUTP ニック終わりラベル (TUNEL) とカスパーゼ 3/7。遵守、tunel の腹側、背側と太ももの皮膚組織を使用して細胞表皮細胞はその場で臨床的に感染している動物の死と蛍光顕微鏡を用いた感染動物と細胞死を比較します。感染症はもちろん、表皮におけるアポトーシス レベルはどのように変化を決定するためには、8 週間以上隔週趾先サンプルを削除し、抽出されたタンパク質とカスパーゼ 3/7 試金を使用して、サンプル内の活動を定量化します。我々、伝染ロード カスパーゼ 3/7 アクティビティに関連付けます。TUNEL 法は細胞死の場でのローカリゼーションのため便利ですが、サンプルあたりコストと時間がかかるのです。カスパーゼ 3/7 試金は大きいサンプルの大きさと時間の効率的なコースの実験。ただし、カエルつま先先端生検が小さいので限られた抽出利用できるあるサンプル標準化等を通じたタンパク質定量、ブラッドフォードの試金のため。したがって、サンプルの標準化の中にエキスを消費を避けるためにつま先生検の写真分析を通して皮膚表面積の推定をお勧めします。

Tunel
感染していない対照動物のよりも感染した動物にもっと TUNEL 陽性細胞があった。Tunel 陽性細胞の異なるその場の場所は、感染し、動物を制御します。対照動物の TUNEL 陽性細胞、真皮と表皮皮膚 (図 1A参照)、低レベル層が、感染している動物には TUNEL 陽性細胞が表皮 (<strong class="xfig...

Watch this Scientific Journal Video about Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis at JoV

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

ツボカビの 2 つの方法を使用して、カエルの表皮細胞死を定量化します。まず、臨床的に感染し、感染動物の差異端末媒介 dUTP ニック終わりラベル (TUNEL)その場で組織を使用します。第二に、カスパーゼ 3/7 タンパク質解析を用いた感染症でアポトーシスの時系列分析を行っています。

ターミナル媒介 dUTP を使用してニック終わりラベル (TUNEL) とカスパーゼ 3/7 がカエルツボカビ、カエルのメジャー表皮細胞死に試金します。

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

using-terminal-transferase-mediated-dutp-nick-end-labelling-tunel

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

10.4K ビュー.  James Cook University. ツボカビの 2 つの方法を使用して、カエルの表皮細胞死を定量化します。まず、臨床的に感染し、感染動物の差異端末媒介 dUTP ニック終わりラベル (TUNEL)その場で組織を使用します。第二に、カスパーゼ 3/7 タンパク質解析を用いた感染症でアポトーシスの時系列分析を行っています。

ビデオ: Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

腸管指向性T細胞の移動を研究するために競争力のあるホーミングアッセイ

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

免疫・感染学

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

傷害性Tリンパ球によって媒介ベータ細胞死を評価するための方法

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

定量的な<em&gt;インビトロ</em静的な条件の下で活性化された初代ヒト微小血管内皮細胞への好中球の接着を測定するために&gt;アッセイ

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

腸管上皮細胞の腸内細菌の侵入<em&gt;インビトロ</em&gt;劇的垂直拡散室モデルを用いた強化され

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. Products are routinely stored at 22 &#176;C on an agitating shaker, a condition that can promote bacterial growth. Although the total number of bacteria believed to be introduced into a platelet product is extremely low, these bacteria can multiply to a very high titer prior to transfusion, potentially resulting in serious adverse events. The aim of this study was to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against a panel of bacteria that have been identified as common contaminants of platelet products. This panel included the following organisms: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa and K. pneumoniae. Each platelet unit was inoculated with a high bacterial load and samples were removed both before and after treatment. A colony forming assay, using an end point dilution scheme, was used to determine the pre-treatment and post-treatment bacterial titers. Log reduction was calculated by subtracting the post-treatment titer from the pre-treatment titer. The following log reductions were observed: S. epidermidis 4.7 log (99.998%), S. aureus 4.8 log (99.998%), S. mitis 3.7 log (99.98%), S. pyogenes 2.6 log (99.7%), S. marcescens 4.0 log (99.99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99.95%), B. neotomae 5.4 log (99.9996%), B. cereus 2.6 log (99.7%), E. coli &#8805;5.4 log (99.9996%), P. aeruginosa 4.7 log (99.998%) and K. pneumoniae 2.8 log (99.8%). The results from this study suggest the process could help to lower the risk of severe adverse transfusion events associated with bacterial contamination.

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

リボフラビンとUVライトと血小板製品の治療：高力価の細菌汚染に対する有効

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

がん抗原の機構理事T細胞受容体の認識を決定するためにX線結晶学、生物物理学、および機能アッセイを使用して、

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

接種<em&gt;ハマダラカ</emメラニン免疫応答を誘導し、測定するためにビーズと&gt;蚊

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...