このプロトコルは、細胞死プロセスの活性化に関する多面的な理解を提供し、疾患メカニズムへの重要な洞察を提供し、治療戦略に情報を提供することができます。このプロトコルは、より単純な技術の使用に依存しており、活性化を大きく決定するために内因性細胞の単一集団から必須の複数のカスパーゼの活性化にアクセスする。自然免疫細胞死は、感染症から炎症性疾患、癌まで、疾患スペクトル全体に関係しています。
カスパーゼ活性化による細胞死の分子メカニズムを理解することは、疾患プロセスへの重要な洞察を提供することができます。研究室のポスドク研究員であるJulieann博士が手順を実演します。骨髄を分離し、BMDMを分化させた後、細胞にインフルエンザAウイルスを感染させます。
20プラーク形成単位の感染の多様性で必要なウイルス量を計算します。BMDMから培地を取り出し、500マイクロリットルのPBSで細胞を1回洗浄します。熱不活化FBSを含まない高グルコースDMEM中の450マイクロリットルのインフルエンザAウイルスを各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で加湿インキュベーターで1時間インキュベートして吸収させます。
1時間のインキュベーションの終わりに、50マイクロリットルの熱不活性化FBSを加え、プレートを摂氏37度で合計12時間インキュベーターに戻します。12時間のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出します。上清150マイクロリットルを吸引し、これを廃棄するか、上清分析のために保存します。
残った上清は取り除かないでください。次に、ウェルあたり50マイクロリットルのカスパーゼ溶解バッファーと100マイクロリットルの4つのXSDSバッファーを組み合わせて、タンパク質収集溶液を作成します。次に、150マイクロリットルのミックスを各ウェルに加えます。
各ウェルについて、混合物をピペットで、溶解した細胞および上清を回収する。ピペッティング中に、ピペットチップでウェルの底をこすり、細胞を破壊します。スクレイピングとピペッティングの後、タンパク質ライセートを標識された1.5ミリリットルチューブに集めます。
ヒートブロックを使用して、すべてのチューブを摂氏100度に12分間加熱します。チューブをヒートブロックから取り出し、室温で14, 500 Gで30秒間遠心分離して、不溶性成分をペレット化します。10ウェルを有する12%ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動装置を調製する。
電気泳動装置にランニングバッファーを満たし、ゲルコームを取り外します。次に、サンプルを摂氏100度で5分間加熱します。ロードする前に、サンプルを室温で14, 500 Gで30秒間遠心分離します。
次に、30マイクロリットルのサンプルを各ウェルにゆっくりとロードします。カスパーゼ1、3、7、8ブロットには上清とタンパク質ライセートとカスパーゼ溶解バッファーまたは組織ホモジネートを組み合わせて使用し、プロトコルに記載されているタンパク質ライセートDN RIPAバッファーまたはカスパーゼ11および9には組織ホモジネートを使用します。6つのカスパーゼすべてを一度に評価するには、同じ手順を使用して、同じサンプルを6つのゲルのそれぞれにロードします。
電気泳動装置を電源に接続し、電力を80ボルトに設定して20分間ゲルランを開始します。最初の20分後、電力を100〜45分間60ボルトに調整します。染料の前面を観察します。
染料の前面がゲルの底に達したら、電源を切ります。ゲルが走っている間に、原稿に記載されているように転写バッファーを準備します。毎回ソリューションを新鮮にします。
ゲルリリーマーを用いて電気泳動装置からゲルを取り出す。ゲルのトランスファースタックをセットアップするには、PVDFメンブレンをメタノールに1分間浸して活性化します。2枚のろ紙、ゲル、PVDFメンブレンをプリウェットし、バッファーを5分間転送します。
この5分間のインキュベーションの間、PVDFメンブレンとゲルを別々の容器に保管してください。セミドライシステムでトランスファースタックの組み立てを開始します。下のプラチナナノ側に、1枚のろ紙、PVDF膜、ゲル、そして最後に1枚のろ紙を置きます。
層間の気泡をゆっくりとロールアウトまたは押し出し、システムの上部を閉じます。次に、電源に接続します。電力を25ボルトに設定して40分間。
移し替え後、移し上げ筒を分解し、メンブレンを回収し、四角いペトリ皿に入れます。次に、15ミリリットルの5%スキムミルク溶液を加えてメンブレンブロッキングを行い、メンブレンをロッキングシェーカーで50〜70RPMで室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、ブロッキング溶液を除去し、10ミリリットルの希釈抗体溶液を加え、前述のように、ロッキングシェーカーで室温または摂氏4度で一晩インキュベートします。
その後、抗体溶液を回収し、15ミリリットルのTBSTを室温で10分間揺とう機でメンブレンに添加してメンブレンを洗浄します。TBSTを破棄します。15ミリリットルのTBSTで洗浄を3回繰り返します。
10ミリリットルの希釈した二次HRP結合抗体溶液を加える。ロッキングシェーカーで室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、抗体溶液を除去したら、15ミリリットルのTBSTをロッキングシェーカー上で室温で10分間添加してメンブレンを洗浄します。
洗浄ステップを完了し、TBSTを除去した後、10ミリリットルの高感度HRP基板を追加します。室温で1分間放置します。基板から膜を取り外します。
化学発光イメージャーを使用して、アクセサリの白いトランストレイを下の位置に挿入して、イメージングに直接進みます。自動露出モードを使用して膜を露光します。A型インフルエンザウイルス感染後の野生型およびZBP1変異体におけるプロおよび活性化カスパーゼ1、11、3、7、8および9、HSV1感染後の野生型およびAIM2変異体、ならびにフランシセラノビシダ感染、またはリポ多糖およびATP刺激後の野生型およびNLRP3変異型BDMを分析する。
上流のPANoptosisセンサーを欠く細胞は、同族のPANoptosis誘導刺激に応答して堅牢な細胞死を受けません。A型インフルエンザウイルス感染はZBP1-PANノプトソームの形成を誘導し、ZBP1欠損細胞はA型インフルエンザウイルス感染時の細胞死から有意に保護される。同様に、HSV1およびフランシセラノビシダ感染症はAIM2パンノプトソームの形成を誘導し、AIM2欠損細胞はこれらの感染に応答して堅牢な細胞死を受けることができません。
上流のインフラマソームセンサーを欠く細胞は、それぞれの刺激に応答して細胞死から保護され、NLRP3欠損細胞は、リポ多糖およびATPに応答して細胞死を受けない。特定のカスパーゼを決定するために、両方の細胞ライセートの混合物を準備することを忘れないでください。ジェットを装填した後、フォローアップのためのカスパーゼの目標の完全性を維持するために、発光サンプルをマイナス20度保存する必要があります このプロトコルと組み合わせて、リアルタイムの細胞死イメージングまたはLDHアッセイを使用して細胞死の実行を監視でき、ELIZAを使用して、さまざまな種類の細胞死を受けている細胞からのサイトカインまたはDAMPの放出を確認できます。
