우리 축산 및 데이터 수집 지원 다음과 같은 사람들에 게 감사: D. Tegtmeier, C. 드 종, J. 호크스, K. Fossen, S. 퍼시벌, M. 맥 윌리엄스, L. Bertola, M., 명 Harney, 스튜어트와 T. Knavel; 그리고 해와 지원에 대 한 M. Merces입니다. 우리 또한 M. 맥 퍼 든, 피 할로 타롱가 동물원 alpina v. L., 양육에 대 한 G. Marantelli P. 코양육에 대 한 감사 하 고 싶습니다. F. Pasmans, A. 마 텔 apoptosis 분석 실험, C. 콘스탄틴, A. Kladnik, R. Webb TUNEL 분석 결과, 지원에 대 한 조언 감사 그리고 T. Emeto와 W. Weßels에 대 한 프로토콜 및 caspase 3/7 분석 결과 대 한 키트 도움이. 이 원고와 프로토콜은 Brannelly 외 2017 피어 J22. 에서 적응

제임스 쿡 대학 승인 응용 프로그램 A1875 P. 코 와 A1897 및 A2171 L. alpina 대동물 윤리.
1. 축산 및 모니터링
<ol><li>적절 한 물, 수 유 및 일정을 청소와 종족에 대 한 적절 한 환경에서 동물을 개별적으로, 집. 매일 동물을 확인 합니다.<ol>
<li>비판적으로 멸종 위기에 놓인된 Pseudophryne 코 의 성인 개인 (TUNEL 분석 결과, 제 4)를 사용 하 고 (Caspase 3/7 분석 결과, 5)에 대 한 위협된 Litoria verreauxii 피나 에서 기증 포로 사육 시설. 이끼에 15-18 ° C에서 동물을 유지 하 고 자갈 기판, 역방향 삼 투 물으로 매일 그들을 안개 창 로드 귀뚜라미와 3 번 매주 피드.</li>
	</ol>
</li>
	<li>매주 각 개인 한 번에 데이터를 수집 합니다. 면봉 Bd 에 대 한 개인 단계 2.1에 설명 된 대로. Neared 0.1 g, 규모를 사용 하 여 각 동물의 무게 하 고 그들의 주 둥이 환기 (SVL) 길이 다이얼 캘리퍼스를 사용 하 여 가장 가까운 0.01 m m를 측정 한다.</li>
	<li>(섹션 3에서 설명)로 접종 후 매일 동물 윤리 지침을 준수 (불규칙 한 피부 슬 라우, inappetence, 다리 빨갛게, 혼 수, 또는 지연된 righting 반사) 감염의 임상 증상에 대 한 동물을 확인 합니다. 임상 증상 및 병 적 동물을 안락사.<ol>
<li>Tricaine methanesulfonate (MS222)의 과다와 안락사 (0.1 %w / v MS222 ~ 세 수도 물에 중 탄산 나트륨으로 pH 6-7). 10 분 후 모든 움직임을 중단 하 고 그들은 자극에 대 한 응답이 표시 MS222에 동물 유지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bd 감염에 대 한 테스트
<ol><li>Bd 를 보라고
	<ol>
<li>새로운 살 균 주 면봉 (동물 당 1 개의 면봉)으로 각 동물 면봉. 다음 swabbing 메서드를 사용 하 여:는 venter에 5 번, 5 번 각 허벅지, 측면, 그리고 다리에. 이것은 45 획의 총 이다.</li>
		<li>부드럽게 돌려 면봉 중 DNA의 효과적인 캡처 되도록 선 사이의. 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 면봉 끝을 끊다 고 추출까지-20 ° C에서 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA 추출 및 정량 분석 결과<ol>
<li>0.5 m m 실리 카 구슬의 30-40 mg와 상용 DNA 추출 시 약의 50 µ L을 추가 하 여 면봉에서 게놈 DNA를 추출 합니다. 구슬 구슬 때리는 셀 disrupter 2 분에 대 한 최대 속도에서 샘플을 이길. 비드 때리는 단계 1 분에 2000 x g에서 샘플 원심.</li>
		<li>10 분, 100 ° C에서 샘플을 품 어과 냉각 수 있습니다. 3 분, 5000 x g에서 샘플 원심 다음 개별 1.5 mL 마이크로 원심 관에는 상쾌한을 전송 하 고 정량까지-20 ° C에서 저장.</li>
		<li>사용 양이 많은 PCR (정량) 다음 보일 외. 200418 감염 부하 분석을 합니다. 사용 하 여 다음과 같은 수정:<ol>
<li>DNA 추출 샘플 6:100 이중 이온을 제거 된 물으로 희석. 각 잘 PCR 저해 방지를 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 0.7 µ L를 추가 합니다. Singlicate에서 각 샘플을 실행 합니다. 각 접시에 네거티브 (템플릿) 제어 및 긍정적인 통제 희석 기준의 시리즈를 사용 zoospore (감염) 부하 추정.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 접종
<ol><li>문화 Bd
	<ol>
<li>Tryptone의 16 g, 젤라틴의 2 세대 및 4g 유 (TGHL)의 이온을 제거 된 물 1 L에 추가 하 여 문화 국물을 준비 합니다. 오토 클레이 브 (40 분 동안 121 ° C) 냉각 국물을 허용.</li>
		<li>(이 경우, 뉴 사우스 웨일즈 격리, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, 통로 번호 11에서에서 분리)에 Bd 분리 접종 TGHL 국물에 23 ° C에서 7 d에 대 한 성장 그리고 TGHL 한 천 배지를 국물 문화를 전송.</li>
		<li>접시, 추가 tryptone의 16 g, 젤라틴의 2 세대, 유 당 (TGHL)의 4 g와 세균 agar의 10 g의 이온을 제거 된 물, 고압 (40 분 동안 121 ° C) 1 l. 일단 혼합물은 충분히 멋진 터치, 하지만 그것은 고형화 하기 전에 TGHL agar에 붓고 92 m m 직경 문화 접시 그래서 그들은 클래스 II 생물 안전 캐비닛에 1/4 ~ 1/3 가득.</li>
		<li>때는 한 천 경화가 고 완전히 냉각, 각 접시 액체 국물에서 Bd 의 0.5 mL를 접종 하 고 균등 하 게 확산. 약 1 시간에 대 한 접시에 건조 하 고 다음 플라스틱 파라핀 영화와 번호판 봉인 Bd 국물 혼합물을 허용 한다. 5-7 d 23 ° C에서 내려 접시 한 쪽을 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>홍수 zoospore 접종 솔루션에 대 한 번호판<ol>
<li>접종 전에 매일 생존을 보장 하기 위해 거꾸로 가벼운 현미경 zoospore 운동 성을 확인 합니다. Zoospore 릴리스는 높은, 많은 zoospores는 sporangia 외부 수영으로 때 문화는 접종에 대 한 준비.</li>
		<li>접시에 물을 붓는 하 고 물으로 출시 zoospores 수 있도록 10 분 동안 실 온에서 배양 하 여 각 접시 세 수도 물 또는 인공 연못 물 3 mL를 홍수. 인큐베이션 기간이 지난 후 새로운 멸 균 용기에 zoospore 현 탁 액을 가만히 따르다.</li>
		<li>견적 zoospore 농도 haemocytometer를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라. Zoospore 현 탁 액의 농도가 되 면, 세 꼭지 물 3 mL 당 1 x 106 zoospores의 농도에 정지 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동물 접종<ol>
<li>개별 50 mL 용기에서의 벤 터19 위로 쏟아지는 3 mL inoculum 혼합물에 의해 각 동물 접종. 초과 inoculum 접종 컨테이너의 자료로 수집을 허용 합니다. 감염, 되도록 24 h에 대 한 개별 접종 컨테이너에 각 동물을 두고 고 24 h 접종 후 소독된 terrarium을 각각 반환 합니다.<ol>
<li>울림 13% 볼륨/볼륨 (v/v) 상업적인 표 백제 솔루션20를 사용 하 여 소독, 두 번 이상 물으로 씻어 다음 보다 24 h 동안 건조를 허용 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bd에 대 한-컨트롤을 부정, 모의 3.2 3.3와 동일한 방법을 사용 하 여 동물 접종 하지만 Bd홍수- Bd 의 세 수돗물의 5 mL와 함께 무료 한 천 배지 대신는 한 천 배지를 주사.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. TUNEL 분석 결과
<ol><li>1.3.1, 단계 및 Bd의 동등한 수에서 설명한 대로 chytridiomycosis의 임상 증상을 보이고 있다 동물 안락사-부정적인 제어 동물.</li>
	<li>피부를 해 부 (등, 복 부, 그리고 허벅지) 각 동물에서 샘플. 4 %v / v 인산 염 버퍼 포름알데히드에 2 h의 피부 샘플을 수정. 짧은 하 고 일관 된 시간을 고정 수 있습니다 완벽 하 게 고정, 조직 뿐만 아니라 효과적이 고 정확한 immunohistochemistry 얼룩에 대 한 수 있습니다. 다음 단면에 대 한 포함까지 80% 에탄올으로 전송 합니다.</li>
	<li>다음과 같은 표준 메서드21조직학 준비를 위한 파라핀 왁 스에 피부를 포함 합니다. 간단히, 프로토콜은 다음과 같습니다.<ol>
<li>에탄올의 등급된 시리즈에 조직을 탈수 하 고 에탄올 크 실 렌을 취소 합니다. 파라핀 왁 스에 조직을 포함 하 고 한 파라핀 블록에 각각에 대 한 모든 세 가지 피부 샘플을 배치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다음 표준 조직학 준비21톰을 사용 하 여 섹션 피부. 섹션 5 µ m에서 순차적으로 조직 하 고 친수성 유리 슬라이드에 부착. 피부 타입 슬라이드 당 당 4 개의 직렬 histosections 장소. 직렬 피부 섹션 개인 당 세 개의 슬라이드, 각 슬라이드 각 조직 부착의 4 개의 단면도 기억.</li>
	<li>다음과 같은 순서로 슬라이드를 얼룩:<ol>
<li>되며 (H & E) counterstaining 오신 다음으로 첫 번째 슬라이드를 얼룩. 이 슬라이드는 Bd sporangia 피부 내에서 위치를 시각화 하는 것입니다.</li>
		<li>조직학 준비에 대 한 상용 TUNEL 분석 결과 다음 두 번째 슬라이드를 얼룩 하 고 아래 설명 된 제조업체의 지침을 따르십시오.<ol>
<li>첫째, 세척, 당 5 분 크 실 렌의 3 개의 변경 슬라이드를 세척 하 여 coplin jar에서 조직 섹션 deparaffinize와 5 분 동안 100% 에탄올의 변화 2 함께 각 세척 하십시오. 5 분에 대 한 PBS의 한 세척과 95% 에탄올 3 분 그리고 3 분 마무리에 대 한 70% 에탄올의 한 세척을 따르십시오.</li>
			<li>갓 희석 단백질 소화 효소 (가수분해는 PBS에 희석 20 μ g/mL의 농도에서 K), 조직 pretreat을 슬라이드에 직접 추가 합니다. 15 분 세척 2 분 coplin jar에 PBS의 두 가지 변화에 대 한 알을 품을 수 있습니다.</li>
			<li>과잉 액체를 누르고 방 온도에서 2 분 동안 coplin jar에 PBS에 3.0%의 과산화 수소에에서 끄다. 린스 두 번 PBS, 5 분 동안 각 세척 합니다.</li>
			<li>과잉 액체를 누릅니다 다음 슬라이드에는 조직에 직접 평형 버퍼의 75 µ L/5 c m2 을 적용 합니다. 10 미 탭 섹션 주위 초과 액체를 incubate 고 터미널 deoxynucleotidyl tranferase (TdT) 효소의 55 µ L/5 c m2 을 적용 합니다. 37 ° c.에서 1 h 습도 챔버에 품 어</li>
			<li>작업 강도 중지/워시 버퍼, coplin jar에 슬라이드를 넣어 TdT 부 화 후 15 선동 s와 실 온에서 10 분 동안 품 어. 워시 워시 당 1 분에 대 한 PBS의 3 개의 변경 슬라이드. 과잉 액체를 누릅니다.</li>
			<li>안티 digoxigenin 공액 (rhodamine) 조직, 65 µ L/5 c m2에 실내 온도에 예 열을 적용. 온도 실 온에서 30 분 동안 습도 챔버에 incubate 고 빛에 노출 하지 마십시오. 워시 워시 당 2 분에 대 한 PBS의 4 개의 변화. 과잉 액체를 누릅니다.</li>
			<li>0.5-15 µ L 추가 하 여 마무리 역할 카운터 얼룩을 슬라이드에 슬라이드 설치 중간에 1 µ g/mL DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole). 다음 커버 슬립 커버와 매니큐어 또는 고무 시멘트와 함께 인감. 분석 결과 빛에 민감한 어둠을 슬라이드 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>얼룩 세 번째 슬라이드 TUNEL 분석 결과 DAPI counterstain를 사용 하 여 스테인드는 하지만 각 샘플에 대 한 긍정적이 고 부정적인 제어로 사용. 참고: 컨트롤 슬라이드 4 histosections의 첫 번째 2는 긍정적인 제어 복제 되며 지난 2 부정적인 제어 복제.<ol>
<li>단계 4.5.2.2, 대신 긍정적인 컨트롤에 대 한 사전 DN 버퍼 (30 m m trizma, pH 7.2, 4 mM MgCl2, 0.1 m m DDT) 조직 치료 그리고 5 분 동안 실 온에서 품 어. 다음 Dnase I DN에 0.1ug의 최종 농도 대 한 버퍼를 분해 / mL, 슬라이드에 직접 적용. 실 온에서 15 분 동안 품 어.  그런 다음, 씻어 슬라이드 dH2O 5 세척 3 분 동안 각 세척. 과잉 액체를 되 리. 다음 단원의 4.5.2.3 지시 대로 TUNEL 분석 결과 다시 시작 합니다.</li>
			<li>부정적인 컨트롤에 대 한 추가 하지 마십시오 터미널 deoxynucleotidyl tranferase (TdT) 효소 그 샘플에 (섹션에서에서 설명한 대로 4.5.2.4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석 결과의 완료 되 면 즉시 TUNEL 슬라이드를 관찰 합니다.<ol>
<li>받아 사진을 무작위로 각 피부 부분 모두 rhodamine 얼룩, apoptotic 세포를 보여준다는 빨강과 DAPI는 모든 핵을 밝혀 나타나고 파란색 표시에 대 한 필터를 사용 하 여 형광 현미경을 사용 하 여 X 200에 따라 간격을의 오버레이 세포를 생성할 수 있습니다. 적어도 100 셀 샘플 당 피부 섹션 당 사진 확인 합니다. -20 ° c.에 있는 어두운 현미경 상자에 슬라이드 저장</li>
		<li>이미지 당 셀 (블루 DAPI 스테인드)을 계산. 적어도 100 셀 피부 섹션 당 계산 됩니다 확인 합니다. 100 셀에 도달, 이미지 내의 모든 셀을 계산. 적은 다음 100 셀 하나의 이미지에 존재 하는 경우 적어도 100 셀은 피부 섹션 동물 당 당에 도달할 때까지 또 다른 이미지를 계산 합니다.</li>
		<li>다음, 같은 이미지 (붉은 rhodamine 스테인드)에 TUNEL 긍정적인 셀의 수를 계산 합니다. TUNEL 긍정적인 세포 apoptosis와 괴 사 또는 배경 나타내는 명확한 세포 가장자리 (막 아무 세포와 본래 이다)와 단일 세포 이다. 때로는 세포 형태 apoptotic 시체를 축소합니다.</li>
		<li>TUNEL 분석 결과에 계산 영역 찾아서 H & E histosections 스테인드에 해당 영역을 분석 합니다. H & E 섹션 스테인드 보장 Bd, Bd 감염의 사이트에 해당 확인-감염 된 사이트 TUNEL 분석 결과에 apoptotic 세포를 계산 하는 경우에 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Caspase 3/7 분석 결과
<ol><li>( Bd-노출 및 Bd-부정) 각 동물에서 발가락 끝을 수집 한번 매주 3 주 게시물 접종, 및을 통해 격주 개인 당 8 발가락까지 실험의 끝.<ol>
<li>두 번째 지 골에서 화 염 소독가 위, 발가락 끝을 잘라 고 1.5 mL microtube 놓고-80 ° c.에 즉시 동결</li>
	</ol>
</li>
	<li>냉동된 발가락 샘플에서 단백질을 추출 합니다.<ol>
<li>2 스테인리스 구슬 (3.2 m m) 1.5 mL 나사 모자 microtube 샘플 버퍼 (25mm HEPES pH 7, 5 mM MgCl2)의 100 µ L에 샘플을 배치 합니다. 최대 속도 (1.2.1에서 사용 단계로 같은 구슬 때리는) 얼음에 3 분 뒤에 1 분 구슬의 4 사이클에 의해 샘플을 lyse. 세포의 용 해, 후 12000 g x와 5 분 수집 상쾌한 분석 결과에 사용을 위한 4 ° C에서 샘플 원심.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bradford 분석 실험을 사용 하 여 샘플 당 단백질 농도 계량.<ol>
<li>384 잘 플레이트에서 Bradford 시의 10 µ L 10 µ L의 단백질 추출 혼합 하 고 실 온에서 2 분 동안 품 어. 중복에서 각 샘플을 실행, 5 시리즈와 함께 접어 BSA 희석 기준. 595에서 흡 광도 읽고 nm 흡 광도 플레이트 리더에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>또는, 발가락 끝 샘플 (단백질 농도 낮은 표준 근처 단계 4.3.1에서 Bradford 분석 실험에서 결정 또는 샘플링 개구리 3 g 총 중량) 너무 작은 경우, 표준화 샘플 피부 표면을 추정 하 여 Bradford 분석 실험 대신 사진을 사용 하 여 영역.<ol>
<li>Caspase 분석 결과 대 한 샘플에서 단백질을 추출 하기 전에 40 X 확대를 거꾸로 가벼운 현미경을 사용 하 여 각 발가락 사진.</li>
		<li>발가락의 위치를 추정 하 여 이미징 소프트웨어, 컴퓨터를 사용 하 여 발가락 샘플을 분석 합니다. 발가락 클립의 가장자리 주위 선 그리기 하 여이 작업을 수행 하 고 모양 내 이미징 소프트웨어 예상 지역. 다음 3 차원 피부 샘플의 표면적을 대략적인 것 이다 pi (3.14)를 곱하면 그 지역 (길이 단면적 x로 (pi x 직경) 튜브의 바깥 표면 영역을 제공).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Caspase 3/7 분석 결과 수행 합니다.<ol>
<li>384 잘 발광 접시에서 상용 caspase 3/7 시 약의 10 µ L 및 단백질 추출 10 µ L를 추가 합니다. 3 중에서 각 샘플을 실행 합니다.</li>
		<li>실 온에서 30 분 동안 빛에서 접시 15 미 품에 대 한 접시를 천천히 흔들어는 시 약을 혼합. 발광은 발광 격판덮개 리더를 사용 하 여 측정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide.">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li><li>Skerratt, L. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+invasive+chytrid+fungus+of+amphibians+paralyzes+lymphocyte+responses.">The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses.</a> Science. 342 (6156), 366-369 (2013).</li><li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li><li>Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+(Batrachochytrium+dendrobatidis)+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay.">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).</li><li>Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+with+infectious+disease+increase+their+reproductive+effort:+evidence+for+the+terminal+investment+hypothesis.">Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis.</a> Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).</li><li>Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+disinfectants+effective+against+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis.">Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).</li><li>Woods, A., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).</li><li>Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+cell+death+in+frogs+with+chytridiomycosis.">Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis.</a> PeerJ. 5, e2925 (2017).</li></ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

우리는 표 피 apoptosis와 세포 죽음의 치명적인 질병 chytridiomycosis 병리학 또는 Bd 취약 종에 질병 저항 메커니즘의 잠재적인 메커니즘으로 탐험. 우리 세포 죽음 표 피, 표 피 세포 죽음 분석, 현장에 대 한 분석 결과 TUNEL 및 감염의 진행을 통해 표 피 세포 죽음을 모니터링을 위한 caspase 3/7 분석 결과 평가의 두 가지 방법을 사용 합니다. 우리는 세포 죽음 및 apoptosis 감염 부하와 상관은 ?...

양서류는 현재 발생 하나 모든 척추 동물 taxa1의 세계 생물 다양성의 가장 큰 손실. 이러한 하락의 주요 원인 치명적인 피부 질병 chytridiomycosis, Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2곰 팡이 병원 균에 의해 발생 이다. 병원 체는 표면적으로 표 피, 피부 기능 심한 전해질 손실, 심장 마비, 그리고 사망3결과의 중단으로 이어질 수 있는 감염. Bd 에 대 한 다양 한 잠재적인 호스트 면역 메커니즘은 현재 공부 되 고, 항균 성 펩 티 드4,5, 피부 세균 식물6,8, 면역 세포의 수용 체7, 그리고 림프 구 활동9,10. 그러나, 몇 가지 연구는 상피 apoptosis와 세포 죽음은이 치명적인 병원 체에 대 한 면역 메커니즘을 탐구 한다.
세포 죽음, apoptosis (프로그램 된 세포 죽음) 또는 괴 사 (unprogrammed 죽음), 표 피에서 통해 Bd 감염의 병리학을 있을 수 있습니다. 이전 연구 Bd 감염 세포내 접합의 피부 explants zoospore supernatants 생체 외에서11. 에 노출 되는 때 관찰 하기 때문에 apoptosis를 유도 수 있습니다 하는 것을 건의 한다. 또한, Bd에 퇴행 성 상피 변화-감염 된 개구리 전자 현미경12,13를 사용 하 여 관찰 된다. Transcriptomic 분석 나타냅니다 apoptosis 경로 감염 된 피부14, upregulated 양서류 splenocytes 그들은 체 외에서 Bd supernatants15에 노출 되 면 apoptosis를 받 다. Bd 를 일으킬 수 있는 제안 하는 증거의 증가 볼륨에도 불구 하 고 apoptosis와 호스트 죽음 생체 외에서 vivo에서 연구에 하거나 감염의 진행을 통해 메커니즘 부족 apoptosis를 계량 하는 세포. 또한, 그것 아니다 알려진 호스트 Bd 감염을 방지 하기 위해 면역 방어 전략으로 apoptosis를 사용 하는 경우 또는 apoptosis 질병의 병 리.
이 연구에서 우리가 감염된 동물에서 vivo에서 두 가지 방법을 사용 하 여 표 피 세포 죽음 및 apoptosis를 감지 목적: caspase 3/7 단백질 분석 결과, 및 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 현장에서 시험. 각 분석 결과 감지 세포 죽음16의 다른 측면, 함께 이러한 방법을 세포 죽음에 관련 된 메커니즘의 완전 한 이해를 제공 하 고 효과의 정확한 측정을 보장. Caspase 3/7 분석 결과 단정 이펙터 caspases 3, 7, 내장 및 외부 apoptosis 경로의 정량화를 가능 하 게의 활동. 반면, TUNEL 분석 결과 검색 DNA 파편, apoptosis, 괴 사 및 pyroptosis17를 포함 하 여 세포 죽음 메커니즘에 의해 발생 합니다. TUNEL 분석 결과 사용 하 여 세 가지 다른 피부 섹션을 사용 하 여 모두 임상적으로 감염 되 고 감염 되지 않은 동물의 표 피 내 세포 죽음의 위치를 조사 하는 우리: 고 등는 venter와 Pseudophryne 코의 허벅지. 이 메서드는 특정 상피 층 내에서 위치를 구별 뿐만 아니라 세포 죽음의 해 부 사이트를 식별 합니다. 우리는 다음 caspase 3/7 분석 결과 사용 하 여 Litoria verreauxii alpina에 8 주 감염을 통해 apoptosis의 시간 시리즈 정량화를 수행. 우리 같은 동물에서 발가락 끝 샘플을 격주 걸릴 고 caspase 3/7 활동 병원 체 감염 부하를 연결할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>POLARstar Omega</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td>Luminescent plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well flat clear bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well low flange white flat bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar Bacteriological (Oxoid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>OXLP0011B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>6764254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lactose Broth (Oxoid)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>OXCM0137B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP328-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricane-S (MS-222)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0872873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15561020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile rayon swab</td>
			<td>Medical Wire &#38; Equipment</td>
			<td>MW-113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Bradford reagent</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspase Glo&#160; 3/7</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H0887-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1374248-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin hydrolysate Enzymatic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X)</td>
			<td>Thermo/Life</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prepman</td>
			<td>Thermo/Life</td>
			<td>4318930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4444556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clorox bleach</td>
			<td>Clorox</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEISS Axio Scan florescent miscroscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Florescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2mm stainless steel beads</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079132SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer ITSI-3 Chytr (5&#8242;-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer 5.8S Chytr (5&#8242;-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minor groove binder probe Chytr MGB2(5&#8242;-CGAGTCGAAC-3&#8242;)</td>
			<td>Taqman</td>
			<td></td>
			<td>Individual design for primers and probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor-Gene qPCR Instruments</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>qPCR machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5ml</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-681-372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture petri plates</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>263991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>11079105Z</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using terminal transferase-mediated dutp nick end-labelling (tunel) and caspase 3/7 assays to measure epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis

양서류 세계적으로 생물 다양성에 큰 손실을 겪고 그리고 주요 원인 중 하나 전염병 chytridiomycosis. 이 병은 곰 팡이 병원 균 Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), 감염 하 고 개구리 표 피;를 방해에 의해 발생 그러나, 병 적인 변화는 계속 명시적으로 특징 되지. Apoptosis (프로그램 된 세포 죽음) 호스트 조직 손상에 병원 균에 의해 사용할 수 있습니다 하지만 병원 체 제거에 대 한 질병 저항의 호스트 메커니즘을 수도 있습니다. 이 연구에서 우리는 두 개의 서로 다른 분석 실험을 사용 하 여 감염 되 고 감염 되지 않은 동물의 표 피 세포 죽음 계량: 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-라벨 (TUNEL) 및 caspase 3/7. 사용 하, 등, 복 부 및 허벅지 피부 조직을 TUNEL 분석 결과에 우리가 관찰 세포 죽음 표 피 세포에는 제자리에서 임상적으로 감염 된 동물의 고 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 감염 되지 않은 동물 세포 죽음을 비교. 표 피에서 apoptosis 수준 감염의 과정을 통해 변경 하는 방법을 결정 하기 위해 우리는 8 주 동안 격주 발가락 끝 샘플을 제거 하 고 추출 된 단백질 caspase 3/7 분석 결과 사용 하 여 샘플 내에서 활동을 계량. 우리는 다음 감염 부하 caspase 3/7 활동을 상관 관계. TUNEL 분석 결과 세포 죽음에서 제자리에서의 지역화에 대 한 유용 하지만 비용과 시간 샘플 당 집중. Caspase 3/7 분석 결과 큰 샘플 크기와 시간에 대 한 효율적인 실험 과정. 그러나, 개구리 발가락 팁 biopsies 작기 때문에 있다 제한 추출 샘플 표준화 Bradford 분석 실험과 같은 단백질 정량화 방법을 통해 사용할 수 있습니다. 따라서, 피부 표면 영역 샘플 표준화 동안 추출 물을 사용 하지 않으려면 발가락 biopsies의 사진 분석을 통해 추정 하는 것이 좋습니다.

TUNEL 분석 결과
감염된 제어 동물에 더 많은 TUNEL 긍정적인 세포 보다 감염 된 동물에 있었습니다. 셀에 달랐다 긍정적인 TUNEL 제자리에 위치 감염 하 고 동물을 제어. 제어 동물, TUNEL 셀 및 표 피는 피부를 통해 피부 레이어 (참조 그림 1A), 수준 낮은 하지만 감염 된 동물에 TUNEL 긍정적인 세포 ?...

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Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

우리는 두 가지 방법을 사용 하 여 chytridiomycosis와 개구리에서 상피 세포 죽음 계량. 먼저, 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 제자리에서 조직학 사용 하 여 임상적으로 감염 되 고 감염 되지 않은 동물 간의 차이 확인 하려면. 둘째, 우리는 caspase 3/7 단백질 분석을 사용 하 여 감염을 통해 apoptosis의 시간 시리즈 분석을 실시 합니다.

사용 하 여 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝-라벨 (TUNEL) 및 Caspase 3/7 Chytridiomycosis와 개구리에 측정 상피 세포 죽음을 분석 실험

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

using-terminal-transferase-mediated-dutp-nick-end-labelling-tunel

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

10.3K 조회수.  James Cook University. 우리는 두 가지 방법을 사용 하 여 chytridiomycosis와 개구리에서 상피 세포 죽음 계량. 먼저, 터미널 전이 효소 중재 dUTP 닉 끝 라벨 (TUNEL) 제자리에서 조직학 사용 하 여 임상적으로 감염 되 고 감염 되지 않은 동물 간의 차이 확인 하려면. 둘째, 우리는 caspase 3/7 단백질 분석을 사용 하 여 감염을 통해 apoptosis의 시간 시리즈 분석을 실시 합니다.

비디오: Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling TUNEL and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

연구

면역학 및 감염병학

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell culture assays are performed under aerobic conditions, these in vitro models may not accurately represent the in vivo environment in which the host-pathogen interactions take place. We have developed an in vitro model of infection that permits the coculture of bacteria and host cells under different medium and gas conditions. The Vertical Diffusion Chamber (VDC) model mimics the conditions in the human intestine where bacteria will be under conditions of very low oxygen whilst tissue will be supplied with oxygen from the blood stream. Placing polarized intestinal epithelial cell (IEC) monolayers grown in Snapwell inserts into a VDC creates separate apical and basolateral compartments. The basolateral compartment is filled with cell culture medium, sealed and perfused with oxygen whilst the apical compartment is filled with broth, kept open and incubated under microaerobic conditions. Both Caco-2 and T84 IECs can be maintained in the VDC under these conditions without any apparent detrimental effects on cell survival or monolayer integrity. Coculturing experiments performed with different C. jejuni wild-type strains and different IEC lines in the VDC model with microaerobic conditions in the apical compartment reproducibly result in an increase in the number of interacting (almost 10-fold) and intracellular (almost 100-fold) bacteria compared to aerobic culture conditions1. The environment created in the VDC model more closely mimics the environment encountered by C. jejuni in the human intestine and highlights the importance of performing in vitro infection assays under conditions that more closely mimic the in vivo reality. We propose that use of the VDC model will allow new interpretations of the interactions between bacterial pathogens and host cells.

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Performing cell culture assays for investigating bacterial adhesion and invasion under aerobic conditions is usually unrepresentative of the in vivo environment. A Vertical Diffusion Chamber model allows study of interactions of the human pathogen Campylobacter jejuni with intestinal epithelial cells under more in vivo-like conditions, resulting in enhanced bacterial invasion.

장 상피 세포의 장내 세균의 침입<em&gt; 체외</em&gt; 크게 수직 확산 챔버 모델을 사용하여 향상

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

호스트 세포 RN​​A의 합성에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 클릭 화학을 사용하여

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. Products are routinely stored at 22 &#176;C on an agitating shaker, a condition that can promote bacterial growth. Although the total number of bacteria believed to be introduced into a platelet product is extremely low, these bacteria can multiply to a very high titer prior to transfusion, potentially resulting in serious adverse events. The aim of this study was to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against a panel of bacteria that have been identified as common contaminants of platelet products. This panel included the following organisms: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa and K. pneumoniae. Each platelet unit was inoculated with a high bacterial load and samples were removed both before and after treatment. A colony forming assay, using an end point dilution scheme, was used to determine the pre-treatment and post-treatment bacterial titers. Log reduction was calculated by subtracting the post-treatment titer from the pre-treatment titer. The following log reductions were observed: S. epidermidis 4.7 log (99.998%), S. aureus 4.8 log (99.998%), S. mitis 3.7 log (99.98%), S. pyogenes 2.6 log (99.7%), S. marcescens 4.0 log (99.99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99.95%), B. neotomae 5.4 log (99.9996%), B. cereus 2.6 log (99.7%), E. coli &#8805;5.4 log (99.9996%), P. aeruginosa 4.7 log (99.998%) and K. pneumoniae 2.8 log (99.8%). The results from this study suggest the process could help to lower the risk of severe adverse transfusion events associated with bacterial contamination.

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

리보플라빈과 혈소판 제품 및 자외선 치료 : 높은 역가 세균 오염에 대해 효과

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

호중구의 분리 및 분석 치료제에 림프종 세포 감도에서 자신의 역할을 확인하는 방법

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

X 선 결정학, 생물 물리학 및 기능 분석 실험을 사용하면 메커니즘 집행 T 세포 암 항원의 수용체 인식을 확인하는 방법

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is based on the injection of non-pathogenic particles into insects, as the particles will be detected by the immune system and will induce the production of immune effectors. We focus here on the stimulation of the melanization response in the mosquito Anopheles gambiae. The melanization response results in the encapsulation of foreign particles and parasites with a dark layer of melanin. To stimulate this response, mosquitoes are inoculated with beads in the thoracic cavity using microcapillary glass tubes. Then, after 24 hr, the mosquitoes are dissected to retrieve the beads. The degree of melanization of the bead is measured using image analysis software. Beads do not have the pathogenic effects of parasites, or their capacity to evade or suppress the immune response. These injections are a way to measure immune efficacy and the impact of immune stimulations on other life history traits, such as fecundity or longevity. It is not exactly the same as directly studying host-parasite interactions, but it is an interesting tool to study immunity and its evolutionary ecology.

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

접종<em&gt; 아노 펠 레스 gambiae</emMelanization 면역 반응을 유도하고 측정하는 비즈&gt; 모기

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...