アリソン教会鳥で、オーバーン大学学校の獣医流れ Cytometry 施設は、オーバーン大学細胞分子生物学専攻する EHS R15 R15 AI107773 と NIH からの資金からの技術支援に感謝しております夏に PBR に研究資金。

すべての動物の仕事は、ケアと国立衛生研究所の実験動物の使用のためのガイドに記載されている推奨事項に従ってオーバーン大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 骨髄コレクションのための準備
<ol><li>ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 培 50 μ M 2-メルカプトエタノール、0.22 μ m フィルター真空フラスコ単位の先頭に、2 mM グルタミン 10% ウシ胎仔血清のソリューションを追加することによって 250 mL 完全なメディアを準備し、真空を適用します。 注: 完全培地は 4 ° C で最大 2 ヶ月間保存できます。</li>
	<li>150 mL 滅菌 H2O の 500 mL フラスコ 100% エタノールの 350 mL を混ぜて 70% エタノール溶液を準備します。</li>
	<li>4 ° C に設定する遠心</li>
	<li>70% エタノールではさみ、メス、鉗子を滅菌します。</li>
	<li>血清ピペットを使用して、3 つの 60 mm のペトリ皿に mL の完全培地 5 を追加します。</li>
	<li>血清ピペットを使用して、50 mL の円錐管に完全なメディアの 30 mL を追加します。</li>
</ol>2. マウス骨髄細胞のコレクション
<ol><li>安楽死に関する 2013 アメリカ獣医医学連合 (AVMA) ガイドラインの定める規則に従い CO2麻酔による c57bl/6 マウスを安楽死させます。</li>
	<li>
削除し、後ろ足をストリップします。
	<ol>
<li>75% エタノール、後ろ足と胴体を飽和し、湾曲した組織用のハサミで股関節の周りの皮膚から浅いカットを作る。明らかに筋肉、足首に向かってヒップから皮膚を引っ張ってしっかりと鉗子を使用して。皮弁を削除するのにには、はさみを使用します。</li>
		<li>大腿骨・股関節のすぐ上の骨を介して切断して後ろ足全体を削除します。 注: 滅菌領域、に加えてエタノールきれいな切口を提供する援助、サンプルを汚染から髪を防止します。</li>
		<li>足は、骨髄採取のための新しい場所に転送されます、もし完全なメディアの足が水没します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌バイオ セーフティ キャビネットでの作業、事前に準備されたペトリ皿のいずれかに足を転送します。</li>
	<li>だけをカットするはさみを使用、足首から下の慎重にできるだけ筋肉や弾性結合組織の多くを削除します。洗浄の骨を 2 番目の準備されたペトリ皿に転送します。 注: すべての筋肉を削除する必要はありませんがあまりにも多くの残りの組織が難しく骨髄を洗い流す。</li>
	<li>
大腿骨、膝および脛骨を区切ります。
	<ol>
<li>鉗子を使用して、膝で脚を保持し、骨髄を探します。 注: 骨髄は骨空洞は大腿骨と脛骨の端の方の上部の内側にかすかな赤い線として表示する必要があります。<ol>
<li>3 つのカットを次のようにするはさみを使用して、します。<ol>
<li>脛骨骨髄が最後に表示される場所のすぐ上をカットします。</li>
				<li>ひざの関節のすぐ下をカットします。</li>
				<li>ちょうど膝上カットします。</li>
				<li>股関節を大腿骨に接続したまま、股関節のすぐ下をカットします。</li>
			</ol>
</li>
			<li>ペトリ皿に 3 つの断片を返し、もう一方の足でこの手順を繰り返します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
大腿骨と脛骨から骨髄をフラッシュします。
	<ol>
<li>23 G 針を用いて 50 mL のコニカル チューブとキャップから完全なメディアは、10 mL シリンジを入力します。</li>
		<li>第 3 準備ペトリ皿上鉗子で骨を持ち、骨運河に針を挿入、を通じて (そのままの「プラグイン」、またはいくつかのクラスターとして現れることがあります) 細胞をフラッシュ メディアをプッシュします。骨ないより多くの色を見ることができるまで繰り返します。必要に応じて、メディアで注射器を補充します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
骨端をつぶします。
	<ol>
<li>2 番目のシャーレで鉗子を膝のキャップをしっかりし、注射器の先端で膝をマッシュ アップします。骨端が赤いされなくなるまで続けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>注射器を使用して、50 mL のチューブに 2 番目と 3 番目のシャーレからセルを転送します。上下に軽くピペッティングして塊を解散。泡を生成しないようにします。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。</li>
	<li>
赤い血液細胞を溶解させます。
	<ol>
<li>血清ピペットで上澄みを取り外して、フリックすることでペレットを取り除く部屋の温度で 1 分の ACK (アンモニウム塩化カリウム) 換散バッファーの 1 つの mL での孵化によって赤血球を溶解させます。</li>
		<li>血清ピペットを使用して、40 mL の HBSS (ハンクス平衡塩溶液) バッファーを追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>血清ピペットを使用して、フィルター処理セルが 70 μ m の細胞ストレーナー新しい 50 mL の円錐管に。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。</li>
	<li>血清ピペットを使用して、40 ml の完全なメディアの上澄みと洗浄のセルを削除します。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。 注: この段階で系統の肯定的なリンパ球は FACS または磁気コラムの浄化によって削除できます。しかし、リンパ球は文化の長期的を保持されません。欠席しているほぼすべての肯定的な細胞の数が多いが前のヴィヴォ骨髄における Ly6C CD115 個体群の存在が、日ごとに 5 (図 2)。</li>
	<li>血清ピペットを使用して、上清を除去し、10 ng/ml の 1 x 106セル/ml の密度で遺伝子組換えマウス GM-CSF の完全なメディアの骨髄細胞の培養します。 注: 通常、4 x 107総細胞が赤血球溶解後収穫できます。しかし、期待 2 x 107として少し初心者のため、最大 5 x 107セル経験豊富な収穫のため。</li>
	<li>血清ピペットを使用して、組織培養プレートにセルを転送し、, 5% CO2の 37 ° C で。各シード 24 ウェル プレートを用いた場合の細胞懸濁液 2 mL でも。</li>
	<li>すべての 48 時間は、メディアの半分を削除して置き換える新鮮な完全なメディアと GM-CSF 血清ピペットを使用します。 注: 文化を 9 日に維持できます。しかし、時間をかけて組成を変更します。詳細については、セクション 3 を参照してください。</li>
</ol>3 種の日を選択します。
<ol><li>セル人口の組成物は、時間をかけて変更、任意のセルの最大数を生成する日を選択します。</li>
	<li>1 x 10 の7セルごと GM-CSF の文化の 3、5、および 7 日後各人口の期待されるセル収量記事並べ替えのテーブル 1を参照してください。</li>
</ol>4. 戦略の染色
<ol><li>セルの小さい因数を使用すると、コントロールのサンプルを準備できます。無染色調節、補正制御サンプルごとに、1 つだけの蛍光抗体で染色し、蛍光マイナス 1 を制御する全ての抗体は、そのチャンネルの非特異蛍光用のコントロールの 1 つを除いて追加。プライマリだけで、セカンダリだけで、間接的なラベリングを使用して含まれている場合、両方のプライマリとセカンダリです。 注: フィコエ リスリン (PE)、アロフィコシアニン (APC) タグ抗体、最小限の出血をはっきりと分離併用可能です。ただし、螢光色素のオプションが限られている場合 CD115 は、Ly6C は非常に高いレベルで表現しながら比較的低レベルで表されます。したがって、明るい螢は反 CD115、望ましい、反 Ly6C 螢で出血を防ぐために選択されます。</li>
	<li>50 mL の円錐管に牛胎児血清の 3 ml チルド ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 97 mL を混合することによって 100 mL の FACS 洗浄バッファー (FWB) を準備し、氷浴中で配置。</li>
	<li>やさしく、しかし徹底的にピペットの上下に緩く付着性のセルを除去するのに細胞にピペットを使用します。</li>
	<li>
血清ピペットを使用して、50 mL の円錐管にセルを転送します。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
	<ol>
<li>セル容量は、50 mL を超える場合、チューブの必要な数のセルに転送し、染色の段階で結合します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>優しく、上澄みを離れて注ぎ、血清ピペットと FWB の 30 mL を追加することによって小球形にされた細胞を洗浄します。4 ° C 10 分で 250 × gで遠心分離し、洗浄を繰り返します。 注: 高い細胞死が予想される場合細胞による洗浄が可能で FWB 0.5% 牛胎児血清 (FCS) と低い。これは細胞の凝集を防ぐ。</li>
	<li>
中断し、抗体の製造元の指示に従って細胞を染色します。
	<ol>
<li>FWB の 1 mL に 5 x 10 の7セルの中断および反 Ly6C とアンチ CD115 (研究員の選択) の fluorophores が付いている分類の各 2 μ を追加します。さらに (両方とも Ly6C - と CD115-) 研から CMP を区別する抗 CD11c 抗体の 2 μ g を追加 (CMP は CD11c-; 研は CD11c+)。氷の上で 30 分間インキュベートします。 注:図 3は、Ly6C PE と CD115 APC を使用して生成されました。</li>
	</ol>
</li>
	<li>血清ピペットを使用すると、250 × g 10 分のための 4 ° c で、FWB と遠心分離機の 10 mL を追加します。</li>
	<li>優しく、上澄みを離れて注ぎ、血清ピペットと FWB の 30 mL を追加することによって小球形にされた細胞を洗浄します。4 ° C 10 分で 250 × gで遠心分離し、洗浄を繰り返します。</li>
	<li>細胞を中断する前に徹底的にペレットを取り除くためチューブをフリックします。血清ピペットを使用して、1 x 107セル/FWB、mL でセルを中断し、35 μ m の細胞のフィルターをフィルター処理します。血清ピペットを使用してポリプロピレン チューブにフィルターが適用されたセルを転送し、ソートする準備ができるまで氷の場所します。 注: ポリプロピレンを使用できない場合は、蛋白質のコーティング (脱脂乾燥したミルクまたは FCS) ポリスチレン管は結合を減らすために使用できます。</li>
</ol>5. 設定コントロールのサンプルに基づいてゲート
注: 高速流れの圧力による細胞破壊を防ぐためには、細胞選別の 100-130 μ m ノズルを使用します。
<ol><li>
無染色のコントロールを実行 (手順 4.1 参照)、セルソーターを小さな破片 (低前方散乱; を除外するゲートを適用し、FSC) と非常にきめ細かい (ハイサイド散布。SSC) 粒子。
	<ol>
<li>後の段階の (単球、moMac/MoDP 研) を分析するには、だけより大きいセル (高 FSC) を含めるためのゲートを適用します。</li>
		<li>生存の汚れを使用している場合 (図 1に例を示します) ステンド グラス、非実行可能なイベントを除外するこれらを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>、セルソーターを単一蛍光コントロールのサンプルを実行し、必要に応じて補正を調整します。</li>
	<li>多重ラベル サンプルのサンプルを実行します。4 つの異なる集団を観察: Ly6C + CD115-(適性)、Ly6C + CD115 + (球)、Ly6C-CD115 + べき乗剰余 (moMacs/moDP) と Ly6C-CD115 - (Cmp/moDCs)。4 つの主要な人口のそれぞれを分離するゲートを適用します。 注: Cmp と研 Ly6C CD115 表現型を共有します。しかし、彼らは CD11c 表現に基づいて区別することができる: MoDCs は CD11c 表現に対し、CMP は CD11c を欠いています。</li>
</ol>6. 隔離集団のコレクション
<ol><li>採血管準備の少なくとも 20% を達成するために十分な FCS を追加最終濃度がいっぱい。たとえば、5 mL の管を使用している場合、並べ替えの前に FCS の 1 mL を追加し、5 mL の容量に達したときにチューブを削除します。</li>
	<li>
膜の売り上げ高および抗体の吸収を防ぐためには、並べ替えで 4 ° c (混合および並べ替え) すべてのサンプルを保持します。
	<ol>
<li>できない場合は、可能な限り氷に並べ替えられ、必要に応じてソーターに因数を転送するセルを含むチューブを保ちます。</li>
		<li>さらに、氷の 20-30 分ごとに並べ替えられたサンプルを転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>必要なセル数が収集された後は、新しい円錐管にセルを転送するのに血清ピペットを使用します。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。<ol>
<li>各収集された人口からの小さい因数の並べ替え後解析と純度を確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>上澄みを除去、FWB 10 mL、4 ° C で 250 x gで 10 分繰り返し、合計 2 つの洗浄の間遠心で中断します。 注: それはペレットを外れなしすべての上澄みを除去することは困難することができます。真空ラインにピペット チップを取り付けると、除去に役立ちます。このオプションが利用できない場合は、ペレットの解離の場合新鮮なチューブに上清を収集することをお勧めします。</li>
	<li>2 番目の洗浄後、上清を削除します。</li>
	<li>ユーザーの実験的なデザインは、セルは再培養する順序を決定する手順 2.12-2.14。それ以外の場合、セルは、即時の分析に使用される場合、は、目的のプロトコルに従ってセルを準備します。 注: 機能分析の典型的な例は、図 4に含まれます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+the+development+and+function+of+dendritic+cell+subsets+by+GM-CSF:+more+than+a+hematopoietic+growth+factor.">The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor.</a> Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).</li><li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+cytokine,+GM-CSF,+alters+the+developmental+outcome+of+murine+dendritic+cells.">The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells.</a> Eur J Immunol. , (2012).</li><li>van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. 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著者を開示するとの競合があります。

このプロトコルは細胞機能体外、または注入の生体内の生化学的アッセイを含む分析のいくつかのタイプの十分な数の GM 主導 CSF 前駆細胞および前駆細胞型の分離を促進します。このメソッドより一般的に信頼性の高い分離とこの経路のそれらの分化細胞の種類と同様に、開発の早い段階で細胞の同定を可能にする単球由来樹状細胞の開発の分野で重要な進歩を表します先行研?...

サイトカインによるマウス骨髄細胞培養顆粒球マクロファージコロニー コロニー刺激因子 (GM-CSF) 広くメソッドとして生成される単球由来樹状細胞 (研; として知られている炎症性 DC) 多数1、 2,3,4,5。これらの細胞は、樹状細胞 (DC) 関数6,7,8の研究の様々 な非常に便利されています。通常、これらのマウス骨髄細胞培養は、6-8 日、樹状細胞機能5研究されます。これらの文化くらいと考えられていたほとんど均質な差別化研の大半から成る。最近では、この 6-8 日間の培養期間の終わりに、ある差別化された単球由来マクロファージ (moMacs) 9,10,11の大規模なサブセットと同様に、実際に多くの研が明らかになった。当社独自の調査はさらに研前駆体 (べき乗剰余 moDP)、単球などの以下の先進細胞の他のサブセットは、7 日間10後も低周波で文化に残ることを示すこれらの調査結果を拡張しています。したがって、このシステムによって生成された細胞を用いて樹状細胞 (DC) 機能の研究は感謝して以前よりも種類の細胞のより広範なコホートの応答を反映できます。
GM CSF 生成研分化12,13,14の最終段階でこれらの細胞の機能に関するの研究から多く学びました。しかし、我々 はこれらの発達の経路について以下は細胞の2,,1516と発揮する特定方法と時期のなどの機能大幅理解: 病原体関連分子に対する反応性パターン (PAMPs)、貪食能、抗原処理とプレゼンテーション13、および抗菌活性。従来 Flt3L 駆動 DC 前駆細胞および前駆物質の多数の隔離のためのプロトコルは、報告された17をなっています。Carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) を使用して、これらの異なる集団の分離が実現された-染色骨髄細胞 (分裂細胞を追跡) して 3 日間の Flt3L 文化。セルされ系統陽性細胞の枯渇、CD11c 式17に基づく前駆細胞および前駆体の個体群に分類します。GM 主導 CSF のカルチャーで DC の初期の前駆細胞を識別するために Leenen のグループによって別アプローチ CD31 と Ly6C 18に基づいてセルを並べ替えることでした。当初の目標は、前駆細胞と GM 主導 CSF 研の前駆体を得るための同様のメソッドを作成することでした。GM-CSF によって生成された特定の細胞の種類によるアプローチと戦略開発の序盤とそれ以降の段階で表現された分子の式に基づいてを並べ替えを適応しました。我々 は最終的にことを決定した Ly6C、CD115 (CSF 1 受容体)、CD11c 10型用のこれらのセルを区別するため最高のマーカー。
ここでは、GM-CSF による分化の経路に沿って開発のいくつかの異なる段階で細胞の分離法を提案する: 一般的な骨髄前駆細胞 (CMP)、顆粒球・ マクロファージ前駆細胞 (GMP)、単球、単球由来マクロファージ(MoMac) および単球由来 DC (研)。MoMac 人口さらに分離できますベース MHC クラス II 式のレベルで明らかに研前駆体人口 (べき乗剰余 moDP) 10。高速蛍光活性化セル (FACS) の Ly6C、CD115、および CD11c 表現に基づくこれらの 5 個体群を分離する戦略を並べ替えを利用します。そう、種緑化刺激への応答を明らかに機能アッセイにおけるこれらの細胞の検討を示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30014.04</td>
			<td>to supplement complete medium and FWB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050</td>
			<td>to supplement complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol (2-ME)</td>
			<td>MP Biomedical</td>
			<td>190242</td>
			<td>to supplement complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75mM Vacuum Filter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156-4045</td>
			<td>to sterilize complete media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td>to lyse red blood cell</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-020-CM</td>
			<td>to rescue leukocytes after red blood cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco&#39;s</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td>must be endotoxin free; chilled at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35&#181;m Cell filter</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>to break apart clumps before running through cytometer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Biosource</td>
			<td>PMC2011</td>
			<td>usable concentration of 10ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue cultured treated plate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10062-896</td>
			<td>for bone marrow cells after harvest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6C, Clone HK1.4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD115, Clone AFS98</td>
			<td>Tonbo Bioscience</td>
			<td>20-1152-U100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11c, Clone HL3</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557400</td>
			<td>to differeniate CMP and MoDCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XPD Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Accuri C6</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>660517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200CSPP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm Petri Dish</td>
			<td>Corning, Inc</td>
			<td>353002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL Conical tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Female; 10-20 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8354-30-0011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10mL Syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>301604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23-gauge needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810&#160;R</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software v10</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>Version 10</td>
			<td>flowjo.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of large numbers of myeloid progenitors and dendritic cell precursors from murine bone marrow using a novel cell sorting strategy

単球由来樹状細胞の (研) 顆粒球マクロファージコロニー コロニー刺激因子 (GM-CSF) を使用してマウスの骨髄から生成された文化は、前に認めよりコンピューターが混在する最近認識されています。これらの文化は、日常的に、研も単球由来マクロファージ (moMac)、および単球なども、いくつかの発展途上の細胞に含まれています。このプロトコルの目的は、固有の機能をさらに調査する場合がありますので、彼らが発展するにつれてこれらの文化内にある多くの細胞型の分離・同定のため一貫した方法を提供することです。ここに示す並べ替えの戦略は、どちらとして表され、一過性細胞によって彼らは GM 主導 CSF のカルチャーで開発の Ly6C と CD115、式に基づいて 4 つの集団にまず細胞を分離します。これらの 4 つの集団には、一般的な骨髄前駆細胞または CMP (Ly6C-、CD115-)、顆粒球・ マクロファージ前駆細胞または GMP (Ly6C +、CD115-)、(Ly6C +、CD115 +)、単球と単球由来マクロファージ moMac (Ly6C-、CD115 +) が含まれます。CD11c、Ly6C-、CD115-人口内の 2 つの集団を区別するために並べ替え方法も追加されます: CMP (CD11c-) と研 (CD11c +)。最後に、2 つの集団が内 Ly6C-、CD115 + 人口 MHC クラス II 式のレベルに基づいて更に区別されます。MoMacs 単球由来 DC 前駆体 (べき乗剰余 moDP) 表現上の MHC クラス II MHC のクラス II の低レベルを表現します。このメソッドは、様々 な機能と発達的分析のための十分な数字でいくつかの発達の異なる集団の信頼性の高い分離できます。我々 は 1 つのようなの機能読み出し、認識分子パターン (PAMPs) 刺激に対するこれらの細胞型の差動応答を強調表示します。

可能であれば、実行可能な細胞として分析に利用できる多くのチャンネルを維持するために定期的にに基づいて選ばれた前方および側面の散布図、(典型的なゲート ドット プロット図 1 aのすべてに適用される) 非常に小さいと非常に細かいイベントは除きます。このゲートの戦略はを確実に死んだ細胞を除外されている場合を決定するには、我?...

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Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

ここを識別し、分離 GM-CSF 駆動高速セルの並べ替えを使用して骨髄の細胞数が多いためメソッドを提供します。5 つの異なる集団 (一般的な骨髄前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、単球、単球由来マクロファージおよび単球由来の Dc) は、Ly6C と CD115 の式に基づいて識別できます。

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

generation-large-numbers-myeloid-progenitors-dendritic-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.0K ビュー.  Auburn University. ここを識別し、分離 GM-CSF 駆動高速セルの並べ替えを使用して骨髄の細胞数が多いためメソッドを提供します。5 つの異なる集団 (一般的な骨髄前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、単球、単球由来マクロファージおよび単球由来の Dc) は、Ly6C と CD115 の式に基づいて識別できます。

ビデオ: Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

追跡調査のためのQdot ®二ナノとマウス骨髄由来樹状細胞の世代とラベリング

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

免疫・感染学

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H mice using ALDEFLUOR/ALDH as a marker, and tested their immunogenicity using the cell lysate as a source of antigens to pulse dendritic cells (DCs). DCs pulsed with ALDHhigh CSC lysates induced significantly higher protective antitumor immunity than DCs pulsed with the lysates of unsorted whole tumor cell lysates in both models and in a lung metastasis setting and a s.c.&#160;tumor growth setting, respectively. This phenomenon was due to CSC vaccine-induced humoral as well as cellular anti-CSC responses. In particular, splenocytes isolated from the host subjected to CSC-DC vaccine produced significantly higher amount of IFN&#947; and GM-CSF than splenocytes isolated from the host subjected to unsorted tumor cell lysate pulsed-DC vaccine. These results support the efforts to develop an autologous CSC-based therapeutic vaccine for clinical use in an adjuvant setting.

Evaluated in syngeneic immunocompetent hosts, cancer stem cell (CSC) based dendritic cell (DC) vaccine demonstrated significantly higher antitumor immunity than traditional DC vaccines pulsed with heterogeneous bulk tumor cells.

黒色腫と扁平上癌幹細胞を用いた新規樹状細胞ワクチンの生成

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

ヒト胸腺からの骨髄樹状細胞と上皮細胞の単離

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during inflammatory responses. Unfortunately, study of pDC function is hindered by their low frequency in lymphoid organs, and existing methods for in vitro DC generation predominantly favor the production of cDCs over pDCs. Here we present a unique approach to efficiently generate pDCs from common lymphoid progenitors (CLPs) in vitro. Specifically, the protocol described details how to purify CLPs from bone marrow and generate pDCs by coculturing with &#947;-irradiated AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand. A unique characteristic of this culture system is that the CLPs migrate underneath the AC-6 cells and become cobblestone area-forming cells, a critical step for expanding pDCs. Morphologically distinct DCs, namely pDCs and cDCs, were generated after approximately 2 weeks with a composition of 70-90% pDCs under optimal conditions. Typically, the number of pDCs generated by this method is roughly 100-fold of the number of CLPs seeded. Therefore, this is a novel system with which to robustly generate the large numbers of pDCs required to facilitate further studies into the development and function of these cells.

In Vitro Generation of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors using the AC-6 Feeder System

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

AC-6フィーダシステムを使用してリンパ球系共通前駆細胞からマウス形質細胞様樹状細胞のインビトロ生成に

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are powerful type I interferon (IFN-I) producing cells that are activated in response to infection or during ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

マウス後肢長骨解剖や骨髄の単離

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

マウスの骨髄からGM-CSF由来肺胞のようなマクロファージや樹状細胞の生成および同定

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

マウスの骨髄から形質細胞様樹状細胞の精製のために、蛍光活性化細胞選別

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.