この作品は、心臓や脳卒中財団、カナダからの助成金、そして、モリスとベラ Fainman 財団にサポートされていました。著者は、VEVO770 の超音波イメージング システムの彼女の技術的なヘルプのベロニク ミショーを感謝したいです。

すべてのプロシージャは、機関の動物ケア委員会のマギル大学モントリオール、QC、カナダによって承認されました。必要なすべての機器は、表に記載されて私。
1. マウス (c57bl/6 j) 下大静脈うっ滞プロトコル
<ol><li>手術準備 注: これはサバイバル術、したがって、適切な無菌法は常に続かれるべき必要があります。これには、すべての材料が手もとを確かめる、洗浄および滅菌装置の使用とする前にすべて滅菌材料の作業面の無菌領域を指定することが含まれます。<ol>
<li>すべての手術器具とオートクレーブによる材料を殺菌します。ガラス ビーズ滅菌器は 1 つ以上の手順が同時に行われている場合、動物間の楽器のヒントを殺菌する十分です。</li>
		<li>100% 2.5% と酸素イソフルランの混合物と 8-10 週古い c57bl/6 男性マウスを麻酔します。 注: 必要に応じてイソフルランと酸素の流れを調整します。</li>
		<li>鉗子で指の間動物の後部足を締めつけることにより anesthetization を確認します。ピンチからの応答は、動物の麻酔がないことを示します。</li>
		<li>皮下注射を介して低速リリース鎮痛剤 (ブプレノルフィン) を管理します。マウスの鎮痛剤 (1 mg/kg) の体重の 1 kg あたり 1 mg の線量を与えます。</li>
		<li>プロシージャの持続期間のための角膜の乾燥を防ぐために動物の両方の目の上には、眼軟膏を置きます。</li>
		<li>0.2 - 体重 10 g 当たりの等張液 0.5 mL を皮下に管理します。</li>
		<li>サージカル テープを使用して外科テーブルの場所で動物を修正します。場所動物仰臥位で腹部を公開します。低体温症を防ぐために加熱パッドの上には、手術を行います。</li>
		<li>必要に応じてマウスの腹部から 1-2 分ワイプ腹部のガーゼで拭き取ります、蒸留水、クリーム脱毛のアプリケーションによって髪を削除します。</li>
		<li>また、小さな電気かみそりでシェービングによる腹部から髪を削除します。</li>
		<li>Baxedin (クロルヘキシジン ・ グルコン酸・ BP ・ ソリューション) と腹部を切開する前に殺菌します。アルコールの蒸発によって引き起こされる過度の熱の損失を防ぐために、ガーゼで軽くエタノールを適用します。</li>
	</ol></li>
	<li>下大静脈 (IVC) の露出
	<ol>
<li>外科はさみを使用して、開腹し, 腹腔内を開くを実行します。<ol>
<li>下腹部にピンセットで皮膚を持ち上げ、縦切開をリネアの両側に平行になるようアルバ。リネアの右または左に最初の切開を行うオペレーターの利き手に応じてアルバ。超音波イメージング後に支援するために、正中線から切開です。</li>
			<li>腹部の上部に第二に、水平切開を確認します。 注: の際に腹部への浸透、筋肉が「テント」、外科はさみ腹部臓器に損傷を防ぐため浸透していますいません。</li>
			<li>動物の腹部の筋肉層に垂直方向と水平方向の切開を繰り返します。必ずテントの筋肉の下にある臓器を損傷しないように腹部に浸透中。 警告: 持ち上げ皮膚や腸や他の臓器から筋肉それらを穿刺しないように切開を行う際。</li>
		</ol>
</li>
		<li>皮膚や筋肉腹腔内に公開する切開からを折る。</li>
		<li>傷の開口部の両側に、等張液で湿らせたガーゼを適用し、腸を外部化します。腸の外在化を支援するために腹部の両側に圧力を適用されます。綿の先端アプリケータと穏やかな動きを使用すると、腸内を移動します。等張液にガーゼを浸して、外在の腸の上に置きます。<ol>
<li>ガーゼは必要があります組織に配置する前にあらかじめ湿らせた。</li>
		</ol>
</li>
		<li>任意の腹膜の脂肪を脇へ移動し、腎・総腸骨静脈と下大静脈を公開します。</li>
		<li>明白な側枝の最初の識別を行います。側枝はより小さいと表示されますが、下大静脈、腎と腸骨との間から分岐する重要な静脈静脈。血管系は、マウスによって大きく異なります。マウスは、下大静脈の片側または両側に側枝の存在があります。</li>
	</ol></li>
	<li>側枝の結紮術 注: の側枝が存在する場合、それぞれの次の手順が続いてください。存在しない場合は、手順 4 に進みます: 下大静脈下最初縫合の位置決め。下大静脈結紮部位は側枝の有無にかかわらず、左腎静脈のすぐ遠位になります。<ol>
<li>側枝の両側に鈍的切離を実行します。鈍的切離は、穏やかな圧力、周囲の血管を損傷することがなく筋膜を突破するように鈍い鉗子を繰り返し開くのプロセスです。 注意:穴をあけるまたは静脈の損傷を避けるため。</li>
		<li>枝を持ち上げて静脈下 6-0 絹糸のセクションを渡します。持ち上がるか、または容器を移動するとき常に世話をします。血管の周りの脂肪をつかむことをお勧め、それ以外の場合、容器の損傷の危険性があります。</li>
		<li>縫合鉗子を使用して、標準手術ノット結束テクニックを使用して側枝のまわりに外科的結紮を行います。完全結紮は、100% 閉塞、静脈を確保するため行われます。少なくとも 3 同点スローを使用して、結紮がセキュリティで保護されたことを確認します。</li>
		<li>任意の残りの側枝の 1.3 のステップを繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>下大静脈から腹部大動脈の解離
	<ol>
<li>左腎静脈から下大静脈のすぐ遠位周り鈍的切離を実行します。腹部大動脈は、筋膜を介して下大静脈に接続されて、そのため下大静脈と腹部大動脈の周りの初期の鈍的切離を実行します。 注意: は、穿刺または静脈を損傷を避けます。破裂したり、どちらかの船を穿刺しないでください。これは、血管損傷のリスクが最も高いと、プロシージャの最も重要な部分です。</li>
		<li>引き続き大動脈、下大静脈間ウィンドウの消去が行われるまで鈍的切離で穏やかな圧力を適用します。</li>
	</ol></li>
	<li>縫合の配置と下大静脈結紮
	<ol>
<li>下大静脈と腹部大動脈の下に 6-0 絹糸のセクションを渡します。</li>
		<li>下大静脈と大動脈の間に作成されたウィンドウを縫合を探します。縫合糸を引くと、腹部大動脈と下大静脈の間スレッド鉗子を使用します。スレッドを縫合に慎重、プル/穿刺下大静脈と腹部大動脈にしようとしています。</li>
		<li>縫合鉗子、静脈の完全閉塞を確保すると下大静脈を結紮を行います。再び、結紮をするすぐに左腎静脈より遠位の。</li>
		<li>3 つの縫合糸を結紮をセキュリティで保護するスローを確認します。 注: 下大静脈と大動脈の前に 2 つの代替オプションとして分離するの下に縫合糸を渡すことが可能ですも。また、7-0 プロレン縫合糸は、側枝の下大静脈結紮に使用できます。</li>
	</ol></li>
	<li>傷の閉鎖と手術後のケア
	<ol>
<li>腹部大動脈が途切れない残されているすべての側枝を結紮されているを確認します。下大静脈が拡張表示されます結紮サイトおよび血から遠位の流れが表示されます。</li>
		<li>すべての腹腔内脂肪を置き、腸が腹腔内でバックアップします。</li>
		<li>縫合鉗子と 6-0 絹糸を使用して傷を閉じます。実行縫合 (簡易連続) 縫合糸はきつくなりますようにしてください。タイトな縫合は動物が目覚めるし、そのケージの周りを移動するときに破裂します。<ol>
<li>また、閉創時に PDS、Ethilon、Vicryl、デキソン、またはステンレス鋼クリップを使用します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>まず結束テクニック適切な縫合糸を使用して腹部の筋層を縫合します。</li>
		<li>皮膚の縫合方法を繰り返し、傷の閉鎖が十分なことを確認します。 注: 同じ縫合針と糸を使用して、複数の動物のため場合、両方を使う前に 70% のエタノールで滅菌します。</li>
		<li>麻酔ガスから動物を削除し、少なくとも 30 分間 34 ° C のインキュベーターで配置します。</li>
		<li>再び、0.2 - 体重 10 g 当たりの等張液 0.5 mL を皮下管理します。流体は、必要であれば術前の体重を維持するために次の日に指定できます。</li>
		<li>手術の成功を確認動物の全体的なヘルスを評価し回復まで動物を監視します。 注意:このような侵襲的なプロシージャのわずかな背を丸めて姿勢を期待が、動物は通常、早ければ 30 分後操作動作します。</li>
		<li>独自のケージに動物を配置し、完全に回復するまで他の動物とそれを配置しないでください。</li>
		<li>最大 48 時間以上経過したため毎日鎮痛を再管理します。</li>
		<li>回復中の動物のケージの床に食料を置きます。その他の特別なケアは一般的に必要ありません。</li>
		<li>赤み、腫れ、または放電感染の兆候に傷のサイトを調べます。</li>
		<li>必要な場合は 7-10 日後抜糸します。</li>
		<li>手術が成功した場合、すぐに安楽死を実行 (重要な容器の損傷および/または血液の損失など) または動物が手術後のケアと改善しません。安楽死は、48 時間以上経過したで一般的に行われます。長い実験、腹腔を閉じるに側枝と下大静脈と 5-0 Vicryl の縫合糸を結紮するのに 7-0 プロレンを使用します。<ol>
<li>Anesthetization 5% イソフルランでを除いて、以前ように誘導の動物の安楽死を実行します。これは 100% CO2麻酔中に窒息が続きます。</li>
			<li>窒息 (ハートビートとない呼吸の損失) によって安楽死の確認、完全な安楽死できるように頚部転位を実行します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 高周波超音波プロトコル
注: このプロトコルは高周波超音波イメージングのための女性デイビス研究所齧歯動物フェノタイピング コア SOP から適応です。このプロトコルは 24 時間後手術を実施が、限り、動物は手術にも対応して、早く行うことができます。プロトコルは、健康なマウスでいつでも実施することができ前に、と術後後を比較するためにしばしば行われます。
<ol><li>
動物の作製
	<ol>
<li>誘導区域の動物を置き、100% 2.5% と酸素イソフルランの混合物と動物を麻酔します。</li>
		<li>心拍数、温度モニターをオンにします。手順の中に動物を暖かく保つためにテーブルの上の位置熱ランプ。</li>
		<li>誘導室から動物を削除し、角膜の乾燥を防ぐために目を潤滑します。解析プラットフォームに動物を置き、動物の口/鼻に麻酔のチューブを貼付します。</li>
		<li>温かみのある超音波は 37 ° C へのゲルし、ジェルを動物の腹部。超音波ゲルはゲルのボトルの周りラップ コイルを介して水をポンプに暖かい水暖房システムを使用してウォーム アップします。</li>
		<li>心拍数測定は (必要な) 場合、解析プラットフォームの 4 電極電極ゲルを置く、サージカル テープでプラットフォーム/電極に動物の足を固定します。下大静脈のイメージングの仰臥位に動物を配置します。超音波撮像システムは暖められ、動物を監視するための電極を含む解析プラットフォームが含まれています。</li>
		<li>温度測定温度計に電極ゲルを置くおよび動物の直腸へ挿入します。</li>
		<li>熱ランプとその動物は快適、30-70 bpm の間呼吸、37 ° C で保持されますように、必要に応じて、イソフルランを調整します。</li>
		<li>必要に応じて、動物の腹部を剃るか脱毛クリームで毛を削除します。1-2 分を適用し、ガーゼと水で拭いてください。 注: すぎる髪画像の品質に影響することができます。</li>
		<li>ガーゼの下でまたは任意の余分なゲルをキャッチする動物の側に配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
下大静脈血栓をイメージング
	<ol>
<li>イメージング ソフトウェアをオンにし、新しい研究を開始します。</li>
		<li>イメージングのための適切な scanhead を選択します。ここで使用される scanhead が腹部臓器 (周波数: 35 MHz、焦点距離: 12.8 mm)。</li>
		<li>動物に関連情報を記録します。これは動物を含めることができますID、性別、体重、生年月日、ひずみなど。</li>
		<li>それは動物に超音波ゲルを触れてまで、scanhead もっと下します。</li>
		<li>動物の 2 D イメージングを開始する scanhead プローブを開始します。このモードでのイメージはさまざまな階調のグレーで、二次元として表されます。</li>
		<li>また z 平面を通る scanhead を移動させながら、x または y 平面全体でマウスのプラットフォームを移動することによって、下大静脈と腹部大動脈を探します。 注: 黒の血容器はほぼ彼らの白の壁と内部の血と表示されます。腹部大動脈がない激しく脈動と厚い壁、イメージ画面、scanhead が動いたとき上下の下大静脈は薄い壁を持っているし、圧縮/展開で簡単に。結紮サイトは静脈が拡張した静脈壁のポイントに来ると、明白であります。内部で形成、血栓は超音波映像下で強固になるし、静脈壁のように簡単に圧縮しません。静脈結紮術、血栓が形成されない上記のみ圧縮します。</li>
		<li>下大静脈および結紮術のサイトを検索する時に中央に、超音波の焦点の最も正確な画像を達成するために。<ol>
<li>場合は、イメージが明確に参照してください、ゲルを調整および綿の先端アプリケータと空気の泡を削除するあまりにも暗いです。</li>
			<li>必要に応じて、scanhead 左または右に 45 ° に傾けるし、静脈をわかりやすいように動物のプラットフォームを再調整。これは、scanhead との干渉がある場合です。このシナリオでは、静脈の縫合を避けるために側角度でイメージを作成する必要があります。 注: イメージ干渉は、動物、悪い傷の縫合位置、その超音波ゲル中の気泡の皮膚の暗いパッチが原因ほとんどの場合です。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ソフトウェアを使用すると、任意の目的の構造物の写真を撮るし、任意の測定ツールを使用して測定を行います。一般的な計測には、血栓の断面積または結紮サイトの幅が含まれます。</li>
		<li>パルス波ドップラー血流測定を行うことに画像のモードを変更します。このモードでは、血管・血流イメージングと他の変数間の流速の測定をことができます。</li>
		<li>動物の後端を下げるため解析プラットフォームを傾けます。</li>
		<li>それは動物の後部の端から約 30 ° の角度でゲルをご連絡いたしますので、scanhead の角度/位置を変更します。</li>
		<li>動物のプラットフォームおよび scanhead 再配置します。必要に応じて下大静脈と結紮に移動します。</li>
		<li>うっ滞を確認し、必要に応じて任意の画像を撮影する結紮部位の周り血流測定を行います。血流の一般的な測定には、平均速度、ピーク速度、平均速度が含まれます。</li>
		<li>任意の測定や撮影した画像を保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
クリーンアップと動物の回復
	<ol>
<li>最初の位置を初期位置だけでなく、動物のプラットフォームを配置し scanhead が発生します。</li>
		<li>ガーゼで動物をで余分なジェルを取り外します。傷の縫合は破裂しないように、そっとこれを行います。</li>
		<li>動物の直腸から温度計を外し、プラットフォームからの動物を取る。</li>
		<li>そのケージと 34 ° C の定温器に動物を配置します。</li>
		<li>回復まで動物を監視します。手順は非常にマイナーな非侵襲的です。動物がすぐに目覚めます。このプロトコルのセクション 1.6 に従って次の日動物の監視を継続します。</li>
		<li>ガーゼと消毒剤動物プラットフォームをクリーニングします。</li>
		<li>ガーゼと蒸留水ときれいな scanhead で拭きます。 注意:非常に軽く、scanhead をきれいと蒸留水でのみ。</li>
		<li>次の動物のためには、手順 2 を繰り返します。<ol>
<li>すべての科目で行われ、すべての画像と録画が保存されていることを確認します。すべての機器やソフトウェアの電源を切ります。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+diagnosed+deep+vein+thrombosis+in+the+general+population:+systematic+review.">Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review.</a> Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).</li><li>McGuinness, C. 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著者が明らかに何もありません。

うっ滞モデルを使用して成功した静脈血栓形成のためのいくつかの重要な手順があります。静脈血栓症の誘発は、古いマウス下大静脈と大動脈の周りの脂肪の蓄積のためにより困難です。理想的には、このプロシージャを受けるマウスは 8 - 10 週齢をする必要があります。鈍的切離および合字中に下大静脈の内皮細胞の損傷を誘発するように細心の注意する必要があります。さらに、手術後?...

構成される深部静脈血栓症 (DVT) 肺塞栓症、静脈血栓症 (静脈血栓塞栓症) は、心筋梗塞や脳卒中後の心血管死の 3 番目の主要な原因です。500 の 11の年間発生率と人口の 1-2% に影響を与える一般的な条件です。静脈血栓塞栓症につながることができます: 1) 死肺塞栓症;2) 血栓後症候群、慢性的な足の痛み、腫れ、潰瘍; 特徴または、3) 慢性の肺高血圧が重大な慢性呼吸障害の結果します。静脈血栓塞栓症は多因子疾患、血管壁および/または凝固と線溶系のバランスの破綻による凝固亢進状態への損傷、血流うっ滞起因するかもしれないようにそれは 100 年以上前に記載されています。ウィルヒョウがウィルヒョウのトライアドとして知られています。
ほとんどの場合人間の深部静脈血栓症のサンプルを得ることはない、ために、研究者は、深部静脈血栓症の実験動物モデルを開発しました。ラット2マウス3ウサギ4豚5犬の6、および非ひと霊長類7を含むいくつかの動物が使用されています。マウスは遺伝子組み換えできる、深部静脈血栓症を研究する最も頻繁に使用される動物です。ただし、すべての動物のように自発的な DVT ないマウスで観察です。したがって、静脈壁の物理的あるいは化学的変化はマウスで血栓が作成されます。以前マウス8,9,10の下大静脈 (IVC) の血栓症を誘発する塩化第二鉄モデルを使いました。このモデルは確実に数分閉塞血栓を生産の利点を持って、急性深部静脈血栓症に抗凝固・抗血小板薬の役割を調査するため使用することができます。ただし、ターミナルの手順です。このように、急性および慢性の深部静脈血栓症を研究するうっ滞モデルが適しています。このモデルでは、深部静脈血栓症の開発のためのウィルヒョウのトライアドの要因の一つ下大静脈の血流の完全な中断による血栓形成。このモデルは、深部静脈血栓症の形成とした FeCl3モデル11と比較して利点である解像度を検討する使用ことができます。
我々 はマイクロ イメージング高周波超音波システム12を使用して時間をかけて血栓形成と解決に従う非侵襲的手法を開発しました。我々 は以前、病理組織学的に得られた血栓と超音波で静脈血栓症の測定が好意的に関連を実証しました。2 その後の研究で栓重量と組織化学9,10によって定量化血栓領域超音波相関と測定値が得られることを確認しました。もっと重要なは、その高周波超音波を使用してマウス12深部静脈血栓症の形成を監視するあることを示した。非侵襲的な方法で血栓分解能の定量化にも使えます。
ここでは、うっ滞による血栓症マウス モデルとどのように血栓形成は高周波の超音波を使用して時間をかけて非侵襲的監視できるを使用して血栓形成を許可するプロトコルについて述べる。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-0 perma-hand silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>706G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt forceps (straight and curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Driver</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15396-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEVO 770 High Resolution Imaging System</td>
			<td>Visualsonics</td>
			<td>No longer sold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR Buprenorphine</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>Given to LDI by Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systan eye oinment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>288/28062-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x2 sterile Gauze</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>#104148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from JGH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore hypoallergenic surgical tape</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>#7411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel (Aquasonic-100)</td>
			<td>Dufort &#38; Lavigne</td>
			<td>#AKEN4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From JGH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water heated hard pad</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>#HHP-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymar heater water pump TP500</td>
			<td>MATVET Inc.</td>
			<td>#R-500305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infra-red heating lamp</td>
			<td>electrimat inc.</td>
			<td>#1R175R-PAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse rectal temperature prope</td>
			<td>emkaTECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From JGH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep vein thrombosis induced by stasis in mice monitored by high frequency ultrasonography

静脈血栓症は、1 で 500 の年次発生率と人口の 1-2% に影響を与える一般的な状態です。静脈血栓症は肺塞栓症や血栓後症候群、慢性的な足の痛み、腫れ、潰瘍、特徴または重要な慢性結果慢性的な肺高血圧症の結果によって死につながることができます呼吸器系妥協。これは最も一般的な心血管疾患は、心筋梗塞や虚血性脳卒中後やすべての医療分野の臨床的課題は、それは癌、全身性疾患、手術、および主要な外傷などの他の疾患のコースを複雑にすることができます。
実験モデルは、これらのメカニズムを勉強する必要があります。うっ滞モデルが誘発するは、一貫性のある血栓サイズと血栓量を定量化できます。しかし、体系的に血栓のサイズ変動や誤ったデータ解釈を避けるために下大静脈の側枝を結紮する必要があります。超音波検査法による血栓のサイズを測定する非侵襲的手法を開発しました。この手法を使用すると、我々 は同じ動物で時間をかけて血栓開発および解像度を評価できます。このアプローチは、代替・削減、・研究における動物の絞り込みの原則に一貫して静脈血栓症の定量化に必要なマウスの数を制限します。血栓重量および組織学的測定と血栓サイズ相関解析が超音波検査で得られたことを確認しました。したがって、現在の研究では、下大静脈うっ滞モデルを用いたマウスにおける深部静脈血栓症を誘発する方法と高周波超音波を用いたそれを監視する方法について説明します。

うっ血静脈血栓症モデル
うっ滞モデルのマウスを麻酔し、切開下大静脈 (IVC) を公開します。超音波プローブを妨害しない方法で正中開腹ではなくマウスの左右に切開します。腹部の筋肉と皮膚、フォールド バック下大静脈 (図 1) を公開します。まず、側枝が 6-0 絹糸 (図...

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Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

この議定書では、うっ滞モデルを用いた静脈血栓症を取得する手順について説明します。さらに、時間の経過とともに血栓形成と解像度を測定する非侵襲的な方法を用いています。

高周波超音波による監視マウスのうっ滞による深部静脈血栓症

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

deep-vein-thrombosis-induced-stasis-mice-monitored-high-frequency

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K ビュー.  McGill University. この議定書では、うっ滞モデルを用いた静脈血栓症を取得する手順について説明します。さらに、時間の経過とともに血栓形成と解像度を測定する非侵襲的な方法を用いています。

ビデオ: Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）によって誘発される調節不全遺伝子を特定

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

免疫・感染学

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Autoimmune phenomena occur in healthy individuals, but when self-tolerance fails, the autoimmune response may result in specific pathology. According to Witebsky's postulates, one of the criteria in diagnosing a disease as autoimmune is the reproduction of the disease in experimental animals by the passive transfer of autoantibodies. For epidermolysis bullosa acquisita (EBA), a prototypic organ-specific autoimmune disease of skin and mucous membranes, several experimental models were recently established. In the animal model described in our present work, purified IgG antibodies against a stretch of 200 amino acids (aa 757-967) of collagen VII are injected repeatedly into mice reproducing the blistering phenotype as well as the histo- and immunopathological features characteristic to human EBA 1. Full-blown widespread disease is usually seen 5-6 days after the first injection and the extent of the disease correlates with the dose of the administered collagen VII-specific IgG. The tissue damage (blister formation) in the experimental EBA is depending on the recruitment and activation of granulocytes by tissue-bound autoantibodies 2,-4. Therefore, this model allows for the dissection of the granulocyte-dependent inflammatory pathway involved in the autoimmune tissue damage, as the model reproduces only the T cell-independent phase of the efferent autoimmune response. Furthermore, its value is underlined by a number of studies demonstrating the blister-inducing potential of autoantibodies in vivo and investigating the mechanism of the blister formation in EBA 1,3,-6. Finally, this model will greatly facilitate the development of new anti-inflammatory therapies in autoantibody-induced diseases. Overall, the passive transfer animal model of EBA is an accessible and instructive disease model and will help researchers to analyze not only EBA pathogenesis but to answer fundamental biologically and clinically essential autoimmunity questions.

In the animal model described in our present work, purified IgG antibodies against a stretch of 200 amino acids (aa 757-967) of collagen VII are injected repeatedly into mice reproducing the blistering phenotype as well as the histo- and immunopathological features characteristic to human epidermolysis bullosa acquisita (EBA)1.

顆粒球に依存する自己抗体誘発皮膚水疱形成

Autoimmune phenomena occur in healthy individuals, but when self-tolerance fails, the autoimmune response may result in specific pathology. According to ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

下大静脈狭窄: 深部静脈血栓症のマウスモデル

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Evaluation of Blood Lactate and Plasma Insulin During High-intensity Exercise by Antecubital Vein Catheterization

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different exercise modalities. During some exercise modalities (e.g., high-intensity interval exercise), blood metabolites and hormonal levels change in short periods of time. In the present study, we describe a method to catheterize the antecubital vein, which allows the collection of several blood samples during exercise. Insulin and venous lactate concentrations were measured during high-intensity exercise by the application of the described method. The exercise consisted of three 30 s bouts of high-intensity exercise separated by 4 min of recovery. After the last recovery period, a Wingate test was performed. Blood samples from the antecubital vein were obtained before and after each 30 s bout and before and after the Wingate test. As a result, it was possible to evaluate the plasma insulin and venous blood lactate variations during the exercise.

Here we present a protocol to obtain several blood samples from the antecubital vein during high-intensity interval training. This protocol may be useful for the measurement of blood metabolites and endocrinal markers during exercise.

肘静脈カテーテル法による高強度運動時の血中乳酸および血漿インスリンの評価

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(G6PI)誘発RAマウスにおけるiNKT細胞の導入免疫療法

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...