Este trabalho foi financiado por um subsídio do coração e derrame Foundation do Canadá e o Morris e Bella Fainman Family Foundation. Os autores gostaria de agradecer sua ajuda técnica com o sistema de imagens de ultra-som VEVO770 Veronique Michaud.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo institucional Animal conta Comissão de McGill University Montreal, QC, Canadá. Todos os equipamentos necessários é listado na tabela eu.
1. murino (C57BL/6J) protocolo de estase de veia cava inferior
<ol><li>Preparação da cirurgia Nota: Esta é uma cirurgia de sobrevivência e, portanto, uma técnica asséptica adequada precisa ser seguido em todos os momentos. Isso inclui certificando-se de todos os materiais estão na mão, limpeza e esterilização de instrumentos antes e entre uso e designando uma área estéril na superfície de trabalho para todo o material estéril.<ol>
<li>Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e materiais em autoclave. Um esterilizador de grânulo de vidro é suficiente para esterilizar dicas de instrumento entre animais, se mais de um procedimento está sendo feito de uma só vez.</li>
		<li>Anestesia os ratos masculinos C57Bl/6 8-10 semanas com uma mistura de 100% oxigênio e 2,5% de isoflurano. Nota: Ajuste o fluxo de oxigênio e isoflurano conforme necessário.</li>
		<li>Confirme anesthetization beliscando a pata traseira do animal entre os dedos com fórceps. Não responde a pitada indica que o animal é anestesiado.</li>
		<li>Administre analgésico de liberação lenta (buprenorfina) através da injeção subcutânea. Dê uma dose de 1 mg de analgésico por 1 kg de peso corporal (1 mg/kg)-ratos.</li>
		<li>Coloque pomada em ambos os olhos do animal para assegurar sem dessecação da córnea para a duração do procedimento.</li>
		<li>Administre 0,2 - 0,5 mL de isotônicos por 10 g de peso corporal por via subcutânea.</li>
		<li>Fixar o animal para a mesa de cirurgia, usando fita cirúrgica. Coloque o animal em posição supina para expor o abdome. Realizar a cirurgia em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia.</li>
		<li>Remova pelos do abdômen do mouse pela aplicação de um creme para 1-2 min.. Limpe a área abdominal limpar com gaze e água destilada, da remoção do cabelo se necessário.</li>
		<li>Como alternativa, remova os pelos do abdômen por fazer a barba com um barbeador elétrico pequeno.</li>
		<li>Esterilize o abdômen com Baxedin (solução de BP de gluconato de clorexidina) antes de fazer as incisões. Aplica álcool levemente com gaze para evitar a perda de calor excessivo causada pela evaporação do álcool.</li>
	</ol></li>
	<li>Exposição da veia Cava Inferior (VCI)
	<ol>
<li>Usando uma tesoura cirúrgica, realize uma laparotomia para abrir a cavidade abdominal.<ol>
<li>Levantar a pele com pinças na parte inferior do abdome e faça uma incisão vertical paralelo para ambos os lados da linea alba. Façam a primeira incisão à esquerda ou à direita do linea alba, dependendo da destreza do operador. A incisão é feita longe da linha média para auxiliar na ultra-sonografia mais tarde.</li>
			<li>Faça uma incisão segunda, horizontal na parte superior do abdômen. Nota: Sobre a penetração no abdómen, a musculatura deve ser "tendas" e penetrou com tesoura cirúrgica para evitar qualquer dano aos órgãos abdominais.</li>
			<li>Repita as incisões verticais e horizontais sobre a camada de músculo abdominal do animal. Certifique-se que tenda a musculatura durante a penetração no abdômen para não danificar os órgãos abaixo. Cuidado: Levante a pele e músculo longe de intestinos e outros órgãos internos ao fazer incisões para não perfurar os.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dobre a pele e o músculo longe da incisão para expor na cavidade abdominal.</li>
		<li>Aplique gaze umedecida com solução isotônica, para os lados da ferida abertura e exteriorizar os intestinos. Aplica pressão para ambos os lados do abdome para auxiliar a exteriorização do intestino. Use movimentos suaves com um aplicador de ponta de algodão para mover os intestinos. Embeba a gaze na solução isotônica e coloque sobre os intestinos exteriorizados.<ol>
<li>Gaze deve ser pre-umedecido antes da sua colocação no tecido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mudar de lado qualquer gordura peritoneal e expor a veia cava inferior entre as veias renais e ilíacas.</li>
		<li>Fazer uma identificação inicial de ramos laterais óbvio. Um ramo lateral aparecerá como menor, mas significativa veia que Ramos longe a veia cava inferior, entre o renais e ilíacas veias. Vasculatura pode variar muito entre ratos. Os ratos podem ter ramificações laterais presentes em um ou ambos os lados a veia cava inferior.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligadura dos ramos laterais Nota: Se ramos laterais estão presentes, o seguinte procedimento para cada um. Se não estiver presente, avance para o passo 4: colocação de sutura inicial sob a veia cava inferior. O site da ligadura da veia cava inferior será imediatamente distal para a veia renal esquerda, independentemente da presença de ramos laterais.<ol>
<li>Realize dissecção romba de cada lado do ramo lateral. Dissecção romba é o processo de abertura repetidamente fórceps rombudo com pressão suave, a fim de romper a fáscia sem danificar vasos circundantes. Atenção: Evite furar ou danificar a veia.</li>
		<li>Levante o ramo e passar uma seção de sutura de seda 6-0 debaixo da veia. Sempre cuide quando levantar ou mover os vasos. É melhor pegar a gordura ao redor dos vasos, caso contrário existe o risco de danificar a nave.</li>
		<li>Usando a pinça de sutura, fazer uma ligadura cirúrgica em torno da filial de lado usando padrão nó cirúrgico subordinação técnica. Ligadura completa é feita para garantir 100% de oclusão da veia. Use pelo menos três lances subordinante para garantir que a ligadura é segura.</li>
		<li>Repita a etapa 1.3 para qualquer restantes ramos laterais.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção da aorta abdominal da veia cava inferior
	<ol>
<li>Realizar dissecção romba próximo a veia cava inferior imediatamente distal da veia renal esquerda. A aorta abdominal é anexada para a veia cava inferior através da fáscia, portanto, realizar a dissecção romba inicial em torno da veia cava inferior e a aorta abdominal. Atenção: Evite furar ou danificar a veia. Não romper nem perfure a qualquer embarcação. Esta é a parte mais crítica do processo, com o maior risco de lesões nos vasos.</li>
		<li>Continue a aplicar uma pressão suave através de dissecção romba até uma janela transparente é feita entre a aorta e a veia cava inferior.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocação de sutura e ligadura da veia cava inferior
	<ol>
<li>Passe uma seção de sutura de seda 6-0 debaixo da veia cava inferior e aorta abdominal.</li>
		<li>Localize a sutura através da janela criada entre a veia cava inferior e a aorta. Use pinça para puxar a sutura e passe-o entre a aorta abdominal e a veia cava inferior. A sutura através da linha cuidadosamente, tentando não puxar/punção da veia cava inferior e a aorta abdominal.</li>
		<li>Fazer uma ligadura cirúrgica em torno da veia cava inferior com pinça de sutura, assegurando uma total oclusão da veia. Mais uma vez, fazer a ligadura imediatamente distal da veia renal esquerda.</li>
		<li>Fazer três lançamentos de sutura para fixar a ligadura. Nota: Também é possível passar a sutura debaixo da veia cava inferior e a aorta antes de separar os dois como uma opção alternativa. Alternativamente, as suturas de Prolene 7-0 podem ser usadas para ligadura dos ramos colaterais e a veia cava inferior.</li>
	</ol></li>
	<li>Fechamento da ferida e cuidados pós-operatórios
	<ol>
<li>Verifique se que a aorta abdominal foi deixada sem interrupções e que todos os ramos laterais têm sido ligados. A veia cava inferior aparecerá dilatação distal do site da ligadura e sem sangue fluxo será visível.</li>
		<li>Coloque toda a gordura peritoneal e os intestinos de volta na cavidade abdominal.</li>
		<li>Feche a ferida, usando pinça de sutura e sutura seda 6-0. Use uma sutura de execução (simples contínua) e certifique-se de que a sutura não será muito apertada. Uma sutura apertada se romper quando o animal acorda e se move em torno de sua gaiola.<ol>
<li>Como alternativa, use grampos PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon ou aço inoxidável para fechar ferimentos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>A camada do músculo abdominal, primeiro usando sutura adequada, amarrando a técnica de sutura.</li>
		<li>Repita a técnica de sutura para a pele e verifique se o fechamento da ferida é suficiente. Nota: Se usar a mesma agulha de sutura e linha para vários animais, esterilize ambos em etanol a 70% antes de cada utilização.</li>
		<li>Retire o animal do gás anestésico e colocá-los numa incubadora de 34 ° C durante pelo menos 30 minutos.</li>
		<li>Novamente, administre 0,2 - 0,5 mL de isotônicos por 10 g de peso corporal por via subcutânea. Fluidos podem ser dado em dias seguintes para manter o peso corporal pré-operatório, se necessário.</li>
		<li>Monitore o animal até recuperação para garantir a cirurgia bem sucedida e avaliar a saúde geral do animal. Atenção: Espero uma postura encurvada ligeira para um procedimento invasivo como este, mas o animal irá se comportar normalmente logo em operação após 30 minutos.</li>
		<li>Coloque o animal em sua própria gaiola e não colocá-lo com outros animais até que se recuperou totalmente.</li>
		<li>Re-administrar analgésico diariamente para até 48 h de pós-operatório.</li>
		<li>Coloque os alimentos no chão da gaiola para o animal tempo em recuperação. Outros cuidados especiais geralmente não é necessário.</li>
		<li>Examinamos o local da ferida para vermelhidão, inchaço, ou quitação e outros sinais de infecção.</li>
		<li>Se necessário, remova suturas após 7-10 dias.</li>
		<li>Realizar eutanásia imediatamente se não for bem sucedida cirurgia (por exemplo, navio significativos danos e/ou sangue perda) ou animal não melhora com cuidados pós-operatórios. Eutanásia é geralmente realizada no pós-operatório de 48 h. Para mais experiências, use Prolene 7-0 para ligate ramos laterais e a veia cava inferior e suturas de Vicryl 5-0 para fechar a cavidade abdominal.<ol>
<li>Realizar eutanásia por anesthetization do animal em uma indução como descrito anteriormente, exceto em 5% de isoflurano. Isto é seguido por asfixia com 100% CO2 enquanto anestesiados.</li>
			<li>Após a confirmação da eutanásia por asfixia (perda de pulsação e respiração não), realize deslocamento cervical para garantir a completa eutanásia.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. protocolo de ultra-som de alta frequência de
Nota: Este protocolo é uma adaptação da senhora Davis Instituto roedor fenotipagem núcleo SOP para ultra-sonografia de alta frequência. Este protocolo é realizado pós-operatório de 24 h, mas pode ser feito mais cedo, enquanto o animal está respondendo bem à cirurgia. O protocolo pode ser realizado a qualquer momento em ratos saudáveis e muitas vezes é feito para comparar o antes e depois da cirurgia.
<ol><li>
Preparação do Animal
	<ol>
<li>Coloque o animal em uma câmara de indução e anestesiar o animal com uma mistura de 100% oxigênio e 2,5% de isoflurano.</li>
		<li>Ligue o monitor de temperatura e frequência cardíaca. Lâmpada de calor posição acima da tabela para manter o animal aquecido durante o procedimento.</li>
		<li>Remover o animal da câmara de indução e aplique o lubrificante de olho para evitar a dessecação da córnea. Posição do animal na plataforma de análise e fixar o tubo anestésico para boca/nariz do animal.</li>
		<li>Ultrasom quente do gel a 37 ° C e colocar o gel no abdômen do animal. O gel de ultra-som é aquecido através de um sistema de aquecimento de água que as bombas de água através de bobinas que são enrolados em torno da garrafa de gel quente.</li>
		<li>Para a medição de frequência cardíaca (se necessário), colocar gel de eletrodo nos 4 eléctrodos da plataforma de análise e corrigir as patas do animal para os plataforma/eletrodos com esparadrapo. Coloque o animal em posição supina para a imagem latente da veia cava inferior. O sistema de imagem de ultra-som inclui uma plataforma de análise que é aquecida e contém eletrodos para monitorar o animal.</li>
		<li>Para medições de temperatura, colocar o gel de eletrodo no termômetro e introduza no recto do animal.</li>
		<li>Ajustar a lâmpada de calor e isoflurano conforme necessário para garantir que o animal é confortável, tem uma respiração entre 30-70 bpm e é mantido a 37 ° C.</li>
		<li>Se necessário, raspe o abdômen do animal ou remover cabelo com creme depilatório. Candidatar-se 1-2 minutos e limpe com gaze e água destilada. Nota: Muito cabelo pode afetar a qualidade das imagens.</li>
		<li>Coloque gaze debaixo ou ao lado do animal para pegar qualquer gel de ultra-som em excesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagem latente do IVC e trombo
	<ol>
<li>Ativar o software de imagem e iniciar um novo estudo.</li>
		<li>Selecione um scanhead apropriado para a imagem latente. O scanhead usado aqui é para órgãos abdominais (frequência: 35 MHz, distância focal: 12,8 mm).</li>
		<li>Grave informações relevantes sobre o animal. Isto pode incluir o animal ID, sexo, peso, data de nascimento, tensão, etc.</li>
		<li>Baixe o scanhead até é comovente o gel de ultra-som do animal.</li>
		<li>Começa a sonda scanhead para começar a 2-D imagens do animal. Neste modo, imagens são apresentadas como duas dimensões, em vários tons de cinza.</li>
		<li>Localize a veia cava inferior e a aorta abdominal, movendo a plataforma do rato ao longo do x - ou y-avião, enquanto também se move o scanhead através de z-plano. Nota: Sangue vasos aparecerá com branco as paredes e o sangue dentro quase preto. A aorta abdominal será pulsam intensamente e têm paredes mais grossas, enquanto a veia cava inferior será têm paredes mais finas e comprimir/expandir facilmente a imagem da tela quando o scanhead é movido para cima e para baixo. O site da ligadura será aparente, como a veia vai ser dilatada e a parede da veia vai chegar a um ponto. Qualquer trombo formado dentro será sólido sob ecografia e não irá comprimir facilmente, como faz a parede da veia. A veia irá comprimir apenas acima da ligadura, onde não há trombo é formado.</li>
		<li>Após localizar a veia cava inferior e o local da ligadura, centralizá-las no ponto focal do ultra-som, a fim de obter a imagem mais precisa.<ol>
<li>Se a imagem for muito escura para ver claramente, ajustar o gel e remover quaisquer bolhas de ar com um aplicador de ponta de algodão.</li>
			<li>Se necessário, incline o scanhead 45° para a esquerda ou direita e reajustar a plataforma animal para ver a veia claramente. Isso é feito se houver interferência com a scanhead. Nesse cenário, a veia precisa ser fotografada em um ângulo de lado para evitar a sutura. Nota: Interferência de imagem geralmente é causada por manchas escuras da pele no animal, na colocação de sutura de ferida pobre ou bolhas no gel ultrasom.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando o software, tirar fotos de todas as estruturas desejadas e fazer medições usando quaisquer ferramentas de medição. Medições comuns incluem a área de seção transversal de trombo ou largura do local da ligadura.</li>
		<li>Altere o modo de imagem de Doppler da onda de pulso para fazer medições de fluxo de sangue. Este modo permite a geração de imagens de fluxo sanguíneo vascular e a medição da velocidade de fluxo, entre outras variáveis.</li>
		<li>Incline a plataforma de análise para abaixar a extremidade posterior do animal.</li>
		<li>Altere a posição/ângulo do scanhead para que ele entrará em contato com o gel em um ângulo de 30° da extremidade posterior do animal.</li>
		<li>Reposicione o animal plataforma e scanhead. Realoca a veia cava inferior e a ligadura, se necessário.</li>
		<li>Fazer medições de fluxo de sangue ao redor do local da ligadura para confirmar a estase e levar todas as imagens desejadas. Medições comuns do fluxo de sangue incluem a velocidade média, velocidade máxima ou velocidade mediana.</li>
		<li>Salve quaisquer medições ou imagens tiradas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperação de limpeza e animal
	<ol>
<li>Levante o scanhead para posição inicial e reposicionar a plataforma animal para sua posição inicial, também.</li>
		<li>Remova o excesso de gel fora o animal com gaze. Fazer isso com cuidado para que a sutura da ferida não vai ser rompida.</li>
		<li>Retire o termómetro do reto do animal e levar o animal fora da plataforma.</li>
		<li>Coloque o animal em sua gaiola e uma incubadora de 34 ° C.</li>
		<li>Monitore o animal até se recuperar. O procedimento é muito menor e não-invasiva. O animal vai acordar rapidamente. Continue a acompanhar o animal no dia seguinte acordo com o ponto 1.6 do presente protocolo.</li>
		<li>Limpe a plataforma animal com gaze e desinfectante.</li>
		<li>Limpe o scanhead limpo com gaze e água destilada. Atenção: Limpar o scanhead muito delicadamente e apenas com água destilada.</li>
		<li>Repita a etapa 2 para o próximo animal.<ol>
<li>Se feito com todas as disciplinas, verificar que todas as imagens e gravações foram salvos. Em seguida, desligue todos os equipamentos e software.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Existem várias etapas críticas para a formação de trombo venoso bem sucedida usando o modelo de estase. Indução da trombose venosa profunda é mais desafiador em ratos velhos, devido ao acúmulo de gordura em torno da veia cava inferior e a aorta. Idealmente, os ratos submetidos a este procedimento devem ser de 8 - 10 semanas de idade. Deve ter grande cuidado para não induzir dano endotelial na veia cava inferior durante a dissecção romba e ligadura. Além disso, é crucial para manter o animal em uma incubadora...

Tromboembolismo venoso (TEV), que é composto de trombose venosa profunda (TVP) e embolia pulmonar, é a terceira causa principal de morte cardiovascular após infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. É uma condição comum que afeta 1-2% da população, com uma incidência anual de 1 em 5001. VTE pode levar a: 1) morte por embolia pulmonar; 2) pós-trombótica síndrome, caracterizada por dor crônica, edema e ulceração; ou 3) hipertensão pulmonar crônica, resultando em significativo compromisso respiratório crônico. TeV é uma doença multi fatorial e pode resultar de estase do fluxo de sangue, danos nas paredes dos vasos, e/ou Estados de hipercoagulabilidade, devido a uma perturbação do equilíbrio entre a coagulação e os sistemas fibrinolíticos, como tem sido descrito há mais de uma centena de anos por Virchow e é conhecido como Tríade de Virchow.
Porque na maioria dos casos, é impossível obter amostras humanas de TVP, pesquisadores desenvolveram modelos animais experimentais de TVP. Vários animais, incluindo rato2rato3, coelho4, porco5, cão6e primatas não humanos7 têm sido utilizados. Os ratos podem ser geneticamente modificados e são os animais mais frequentemente usados para estudar a TVP. No entanto, como em todos os animais, DVT espontâneo não é observado em ratos. Assim, alterações físicas ou químicas da parede da veia são usadas para criar a trombose em ratos. Anteriormente nós usamos o modelo de cloreto férrico para induzir trombose na veia cava inferior (VCI) de ratos8,9,10. Este modelo tem a vantagem de produzir confiantemente trombos oclusivos em poucos minutos e pode ser usado para investigar o papel das drogas anticoagulantes e plaquetária durante TVP aguda. No entanto, é um procedimento de terminal. Assim, para estudar TVP aguda e crônica, o modelo de estase é mais adequado. Neste modelo, formação de trombos é induzida pela interrupção completa do fluxo de sangue na veia cava inferior, um dos fatores na tríade de Virchow para desenvolvimento de TVP. Este modelo pode ser usado para estudar a formação de TVP e resolução, que é uma vantagem em comparação com o FeCl3 modelo11.
Nós desenvolvemos um método não-invasivo para acompanhar a formação de trombos e resolução ao longo do tempo usando um sistema de ultra-som de alta frequência de micro imagem12. Demonstramos anteriormente que medição da trombose venosa por ultra-som correlaciona-se favoravelmente com trombos obtidos patologicamente. Confirmamos em dois estudos subsequentes que medições obtidas com ultra-som se correlacionam com o peso do trombo e área de trombo quantificada por histoquímica9,10. Mais importante, nós mostraram que o ultra-som de alta frequência pode ser usado para monitorar a formação de trombose venosa profunda em ratos12. Ele também pode ser usado para quantificar a resolução do trombo em uma forma não-invasiva.
Aqui, descrevemos o protocolo que permite a formação de trombos, usando o modelo do rato de trombose induzida em estase e como formação de trombos pode ser monitorizada de forma não-invasiva ao longo do tempo usando o ultra-som de alta frequência.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-0 perma-hand silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>706G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture tying forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt forceps (straight and curved)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>20830-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Driver</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15396-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26G needles</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEVO 770 High Resolution Imaging System</td>
			<td>Visualsonics</td>
			<td>No longer sold</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SR Buprenorphine</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td></td>
			<td>Given to LDI by Vet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgery Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica M651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systan eye oinment</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>288/28062-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x2 sterile Gauze</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>#104148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicators</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>from JGH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transpore hypoallergenic surgical tape</td>
			<td>CDMV</td>
			<td>#7411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound gel (Aquasonic-100)</td>
			<td>Dufort &#38; Lavigne</td>
			<td>#AKEN4061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From JGH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment</td>
			<td>Dispomed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair remover</td>
			<td>Nair</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water heated hard pad</td>
			<td>Braintree Scientific, Inc.</td>
			<td>#HHP-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaymar heater water pump TP500</td>
			<td>MATVET Inc.</td>
			<td>#R-500305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infra-red heating lamp</td>
			<td>electrimat inc.</td>
			<td>#1R175R-PAR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse rectal temperature prope</td>
			<td>emkaTECHNOLOGIES</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>From JGH</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deep vein thrombosis induced by stasis in mice monitored by high frequency ultrasonography

Trombose venosa profunda é uma condição comum que afeta 1-2% da população, com uma incidência anual de 1 em 500. Trombose venosa profunda pode levar à morte por embolia pulmonar ou resultados na síndrome pós-trombótica, caracterizada por dor crônica, edema e ulceração, ou em hipertensão pulmonar crônica, resultando em significativa crônica respiratória compromisso. Esta é a mais comum doença cardiovascular após infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral isquêmico e é um desafio clínico para todas as disciplinas médicas, como isso pode complicar o curso de outras doenças como o câncer, doença sistêmica, cirurgia e grande trauma.
Modelos experimentais são necessários para estudar esses mecanismos. O modelo de estase induz o tamanho do trombo consistente e uma quantidade quantificável de trombo. No entanto, é necessário sistematicamente ligate ramos laterais da veia cava inferior para evitar a variabilidade em tamanhos de trombo e qualquer interpretação de dados errôneos. Nós desenvolvemos uma técnica não-invasiva para medir o tamanho do trombo usando a ultra-sonografia. Usando esta técnica, que podemos avaliar o desenvolvimento do trombo e resolução ao longo do tempo, no mesmo animal. Essa abordagem limita o número de ratos necessários para quantificação da trombose venosa consistente com o princípio da substituição, redução e refinamento de animais na investigação. Nós demonstramos que o peso do trombo e análise histológica de trombo tamanho se correlacionam com medição obtidos com ultra-sonografia. Portanto, o presente estudo descreve como induzir trombose venosa profunda em camundongos, usando o modelo de estase de veia cava inferior e como monitorá-lo usando o ultra-som de alta frequência.

Modelo de trombose venosa estase
No modelo de estase, ratos são anestesiados, e é feita uma incisão para expor a veia cava inferior (VCI). A incisão é feita no lado esquerdo ou direito do mouse em vez de uma laparotomia mediana de uma forma que não iria interferir com a sonda de ultra-som. A pele e os músculos abdominais são dobra para expor a veia cava inferior (Figura 1). ...

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Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

O presente protocolo descreve as etapas para obter a trombose venosa, usando um modelo de estase. Além disso, estamos usando um método não-invasivo para medir a formação de trombos e resolução ao longo do tempo.

Trombose venosa profunda induzida por estase em camundongos monitorado por ultra-sonografia de alta frequência

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

deep-vein-thrombosis-induced-stasis-mice-monitored-high-frequency

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K visualizações.  McGill University. O presente protocolo descreve as etapas para obter a trombose venosa, usando um modelo de estase. Além disso, estamos usando um método não-invasivo para medir a formação de trombos e resolução ao longo do tempo.

Vídeo: Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative tumor of vascular endothelial cells and produces rare B cell lymphoproliferative diseases in the form of pleural effusion lymphomas (PEL) and some forms of multicentric Castleman's disease.3-5 Only 1-5% of cells in KS lesions actively support lytic replication of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), the etiological agent associated with KS, and it is clear that cellular factors must interact with viral factors in the process of oncogenesis and tumor progression.6,7 Identifying novel host-factor determinants which contribute to KS pathology is essential for developing prognostic markers for tumor progression and metastasis as well as for developing novel therapeutics for the treatment of KS.8 The accompanying video details the methods we use to identify host cell gene expression programs altered in dermal microvascular endothelial cells (DMVEC) after KSHV infection and in KS tumor tissue.9 Once dysregulated genes are identified by microarray analysis, changes in protein expression are confirmed by immunoblot and dual labeled immunofluorescence. Changes in transcriptional expression of dysregulated genes are confirmed in vitro by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Validation of in vitro findings using archival KS tumor tissue is also performed by dual labeled immunochemistry and tissue microarrays.8,10 Our approach to identifying dysregulated genes in the KS tumor tissue microenvironment will allow the development of in vitro and subsequently in vivo model systems for discovery and evaluation of potential novel therapeutic for the treatment of KS.

Identifying Dysregulated Genes Induced by Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus KSHV

Host cell factors play a critical role in the establishment and maintenance of Kaposi's sarcoma (KS). We outline methods to identify host cell factors altered in KSHV-infected DMVEC cells, and in KS tumor tissue. Cellular genes altered by virus will serve as potential target(s) for novel therapeutics.

Identificação de genes desregulados Induzida pelo Herpesvirus sarcoma de Kaposi-associado (KSHV)

Currently KS is the most predominant HIV/AIDS related malignancy in Southern Africa and hence the world.1,2 It is characterized as an angioproliferative ...

Imunologia e Infecção

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Autoimmune phenomena occur in healthy individuals, but when self-tolerance fails, the autoimmune response may result in specific pathology. According to Witebsky's postulates, one of the criteria in diagnosing a disease as autoimmune is the reproduction of the disease in experimental animals by the passive transfer of autoantibodies. For epidermolysis bullosa acquisita (EBA), a prototypic organ-specific autoimmune disease of skin and mucous membranes, several experimental models were recently established. In the animal model described in our present work, purified IgG antibodies against a stretch of 200 amino acids (aa 757-967) of collagen VII are injected repeatedly into mice reproducing the blistering phenotype as well as the histo- and immunopathological features characteristic to human EBA 1. Full-blown widespread disease is usually seen 5-6 days after the first injection and the extent of the disease correlates with the dose of the administered collagen VII-specific IgG. The tissue damage (blister formation) in the experimental EBA is depending on the recruitment and activation of granulocytes by tissue-bound autoantibodies 2,-4. Therefore, this model allows for the dissection of the granulocyte-dependent inflammatory pathway involved in the autoimmune tissue damage, as the model reproduces only the T cell-independent phase of the efferent autoimmune response. Furthermore, its value is underlined by a number of studies demonstrating the blister-inducing potential of autoantibodies in vivo and investigating the mechanism of the blister formation in EBA 1,3,-6. Finally, this model will greatly facilitate the development of new anti-inflammatory therapies in autoantibody-induced diseases. Overall, the passive transfer animal model of EBA is an accessible and instructive disease model and will help researchers to analyze not only EBA pathogenesis but to answer fundamental biologically and clinically essential autoimmunity questions.

In the animal model described in our present work, purified IgG antibodies against a stretch of 200 amino acids (aa 757-967) of collagen VII are injected repeatedly into mice reproducing the blistering phenotype as well as the histo- and immunopathological features characteristic to human epidermolysis bullosa acquisita (EBA)1.

Granulócitos-dependente Blistering pele induzida por auto-anticorpos

Autoimmune phenomena occur in healthy individuals, but when self-tolerance fails, the autoimmune response may result in specific pathology. According to ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Indução de paralisia e lesão do sistema Visual em camundongos por específicos de células T para Neuromielite Óptica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Estenose da veia Cava Inferior: um modelo murino de trombose venosa profunda

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Evaluation of Blood Lactate and Plasma Insulin During High-intensity Exercise by Antecubital Vein Catheterization

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different exercise modalities. During some exercise modalities (e.g., high-intensity interval exercise), blood metabolites and hormonal levels change in short periods of time. In the present study, we describe a method to catheterize the antecubital vein, which allows the collection of several blood samples during exercise. Insulin and venous lactate concentrations were measured during high-intensity exercise by the application of the described method. The exercise consisted of three 30 s bouts of high-intensity exercise separated by 4 min of recovery. After the last recovery period, a Wingate test was performed. Blood samples from the antecubital vein were obtained before and after each 30 s bout and before and after the Wingate test. As a result, it was possible to evaluate the plasma insulin and venous blood lactate variations during the exercise.

Here we present a protocol to obtain several blood samples from the antecubital vein during high-intensity interval training. This protocol may be useful for the measurement of blood metabolites and endocrinal markers during exercise.

Avaliação do lactato sanguíneo e Plasma insulina durante o exercício de alta intensidade por cateterização da veia Antecubital

The measurement of metabolic and endocrinal markers during physical activity is of relevance to understanding the physiological implications of different ...

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability to role and adhere to the endothelial layer. Visualization of circulating cells by injection of fluorescent dyes or fluorophore-coupled antibodies is commonly used. Alternatively, fluorescent reporter mice can be used. Interactions of leukocytes, in particular lysozyme M+ (LysM+) monocytes, with the vessel wall play pivotal roles in promoting vascular dysfunction and arterial hypertension. We here present the technique to visualize and quantify leukocyte rolling and adhesion in carotid arteries in angiotensin II (AngII)-induced hypertension in mice by IVM.
The implantation of a catheter damages the vascular wall and leads to altered blood cell responses. We compared different injection techniques and administration routes to visualize leukocytes in a LysMCre+IRG+ mouse with widespread expression of red fluorescent protein and conditional expression of green fluorescent protein in LysM+ cells. To study LysM+ cell activation, we used AngII infused mice in which rolling and adhesion of leukocytes to the endothelium is increased. We either injected acridine orange using a jugular catheter or directly though the tail vein and compared the amount of rolling and adhering cells. We found that jugular catheter implantation per se increased the number of rolling and adhering LysM+ cells in sham-infused LysMCre+IRG+ mice compared to controls. This activation was augmented in AngII-infused mice. Interestingly, injecting acridine orange directly through the tail vein did not increase LysM+ cell adhesion or rolling in sham-infused mice. We thereby demonstrated the importance of transgenic reporter mice expressing fluorescent proteins to not interfere with in vivo processes during experimentation. Furthermore, tail vein injection of fluorescent tracers might be a possible alternative to jugular catheter injections.

This manuscript describes the use of transgenic reporter mice and different administration routes of fluorescent dyes in angiotensin II-induced hypertension using intravital video microscopy of blood vessels to evaluate the activation of immune cells and their ability to roll and adhere to the endothelium.

Visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina II-infundido ratos: técnicas e armadilhas

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T (iNKT) cells. Patients with active RA present fewer iNKT cells, defective cell function, and excessive polarization of Th1. In this study, an RA animal model was established using a mixture of hGPI325-339 and hGPI469-483 peptides. The iNKT cells were obtained by in vivo induction and in vitro purification, followed by infusion into RA mice for adoptive immunotherapy. The in vivo imaging system (IVIS) tracking revealed that iNKT cells were mainly distributed in the spleen and liver. On day 12 after cell therapy, the disease progression slowed down significantly, the clinical symptoms were alleviated, the abundance of iNKT cells in the thymus increased, the proportion of iNKT1 in the thymus decreased, and the levels of TNF-&#945;, IFN-&#947;, and IL-6 in the serum decreased. Adoptive immunotherapy of iNKT cells restored the balance of immune cells and corrected the excessive inflammation of the body.

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

This protocol uses G6PI mixed peptides to construct rheumatoid arthritis models that are closer to that of human rheumatoid arthritis in CD4+ T cells and cytokines. High purity invariant natural killer T cells (mainly iNKT2) with specific phenotypes and functions were obtained by in vivo induction and in vitro purification for adoptive immunotherapy.

Imunoterapia adotiva de células iNKT em Isomerase Isomerase Induzida de Glicose-6-Fosfato (G6PI)-Induzido RaMice

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...