Name: deep vein thrombosis induced by stasis in mice monitored by high frequency ultrasonography
Uploaded: 2018-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por um subsídio do coração e derrame Foundation do Canadá e o Morris e Bella Fainman Family Foundation. Os autores gostaria de agradecer sua ajuda técnica com o sistema de imagens de ultra-som VEVO770 Veronique Michaud.

Todos os procedimentos foram aprovados pelo institucional Animal conta Comissão de McGill University Montreal, QC, Canadá. Todos os equipamentos necessários é listado na tabela eu.
1. murino (C57BL/6J) protocolo de estase de veia cava inferior
<ol><li>Preparação da cirurgia Nota: Esta é uma cirurgia de sobrevivência e, portanto, uma técnica asséptica adequada precisa ser seguido em todos os momentos. Isso inclui certificando-se de todos os materiais estão na mão, limpeza e esterilização de instrumentos antes e entre uso e designando uma área estéril na superfície de trabalho para todo o material estéril.<ol>
<li>Esterilize todos os instrumentos cirúrgicos e materiais em autoclave. Um esterilizador de grânulo de vidro é suficiente para esterilizar dicas de instrumento entre animais, se mais de um procedimento está sendo feito de uma só vez.</li>
		<li>Anestesia os ratos masculinos C57Bl/6 8-10 semanas com uma mistura de 100% oxigênio e 2,5% de isoflurano. Nota: Ajuste o fluxo de oxigênio e isoflurano conforme necessário.</li>
		<li>Confirme anesthetization beliscando a pata traseira do animal entre os dedos com fórceps. Não responde a pitada indica que o animal é anestesiado.</li>
		<li>Administre analgésico de liberação lenta (buprenorfina) através da injeção subcutânea. Dê uma dose de 1 mg de analgésico por 1 kg de peso corporal (1 mg/kg)-ratos.</li>
		<li>Coloque pomada em ambos os olhos do animal para assegurar sem dessecação da córnea para a duração do procedimento.</li>
		<li>Administre 0,2 - 0,5 mL de isotônicos por 10 g de peso corporal por via subcutânea.</li>
		<li>Fixar o animal para a mesa de cirurgia, usando fita cirúrgica. Coloque o animal em posição supina para expor o abdome. Realizar a cirurgia em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia.</li>
		<li>Remova pelos do abdômen do mouse pela aplicação de um creme para 1-2 min.. Limpe a área abdominal limpar com gaze e água destilada, da remoção do cabelo se necessário.</li>
		<li>Como alternativa, remova os pelos do abdômen por fazer a barba com um barbeador elétrico pequeno.</li>
		<li>Esterilize o abdômen com Baxedin (solução de BP de gluconato de clorexidina) antes de fazer as incisões. Aplica álcool levemente com gaze para evitar a perda de calor excessivo causada pela evaporação do álcool.</li>
	</ol></li>
	<li>Exposição da veia Cava Inferior (VCI)
	<ol>
<li>Usando uma tesoura cirúrgica, realize uma laparotomia para abrir a cavidade abdominal.<ol>
<li>Levantar a pele com pinças na parte inferior do abdome e faça uma incisão vertical paralelo para ambos os lados da linea alba. Façam a primeira incisão à esquerda ou à direita do linea alba, dependendo da destreza do operador. A incisão é feita longe da linha média para auxiliar na ultra-sonografia mais tarde.</li>
			<li>Faça uma incisão segunda, horizontal na parte superior do abdômen. Nota: Sobre a penetração no abdómen, a musculatura deve ser "tendas" e penetrou com tesoura cirúrgica para evitar qualquer dano aos órgãos abdominais.</li>
			<li>Repita as incisões verticais e horizontais sobre a camada de músculo abdominal do animal. Certifique-se que tenda a musculatura durante a penetração no abdômen para não danificar os órgãos abaixo. Cuidado: Levante a pele e músculo longe de intestinos e outros órgãos internos ao fazer incisões para não perfurar os.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dobre a pele e o músculo longe da incisão para expor na cavidade abdominal.</li>
		<li>Aplique gaze umedecida com solução isotônica, para os lados da ferida abertura e exteriorizar os intestinos. Aplica pressão para ambos os lados do abdome para auxiliar a exteriorização do intestino. Use movimentos suaves com um aplicador de ponta de algodão para mover os intestinos. Embeba a gaze na solução isotônica e coloque sobre os intestinos exteriorizados.<ol>
<li>Gaze deve ser pre-umedecido antes da sua colocação no tecido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mudar de lado qualquer gordura peritoneal e expor a veia cava inferior entre as veias renais e ilíacas.</li>
		<li>Fazer uma identificação inicial de ramos laterais óbvio. Um ramo lateral aparecerá como menor, mas significativa veia que Ramos longe a veia cava inferior, entre o renais e ilíacas veias. Vasculatura pode variar muito entre ratos. Os ratos podem ter ramificações laterais presentes em um ou ambos os lados a veia cava inferior.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligadura dos ramos laterais Nota: Se ramos laterais estão presentes, o seguinte procedimento para cada um. Se não estiver presente, avance para o passo 4: colocação de sutura inicial sob a veia cava inferior. O site da ligadura da veia cava inferior será imediatamente distal para a veia renal esquerda, independentemente da presença de ramos laterais.<ol>
<li>Realize dissecção romba de cada lado do ramo lateral. Dissecção romba é o processo de abertura repetidamente fórceps rombudo com pressão suave, a fim de romper a fáscia sem danificar vasos circundantes. Atenção: Evite furar ou danificar a veia.</li>
		<li>Levante o ramo e passar uma seção de sutura de seda 6-0 debaixo da veia. Sempre cuide quando levantar ou mover os vasos. É melhor pegar a gordura ao redor dos vasos, caso contrário existe o risco de danificar a nave.</li>
		<li>Usando a pinça de sutura, fazer uma ligadura cirúrgica em torno da filial de lado usando padrão nó cirúrgico subordinação técnica. Ligadura completa é feita para garantir 100% de oclusão da veia. Use pelo menos três lances subordinante para garantir que a ligadura é segura.</li>
		<li>Repita a etapa 1.3 para qualquer restantes ramos laterais.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissecção da aorta abdominal da veia cava inferior
	<ol>
<li>Realizar dissecção romba próximo a veia cava inferior imediatamente distal da veia renal esquerda. A aorta abdominal é anexada para a veia cava inferior através da fáscia, portanto, realizar a dissecção romba inicial em torno da veia cava inferior e a aorta abdominal. Atenção: Evite furar ou danificar a veia. Não romper nem perfure a qualquer embarcação. Esta é a parte mais crítica do processo, com o maior risco de lesões nos vasos.</li>
		<li>Continue a aplicar uma pressão suave através de dissecção romba até uma janela transparente é feita entre a aorta e a veia cava inferior.</li>
	</ol></li>
	<li>Colocação de sutura e ligadura da veia cava inferior
	<ol>
<li>Passe uma seção de sutura de seda 6-0 debaixo da veia cava inferior e aorta abdominal.</li>
		<li>Localize a sutura através da janela criada entre a veia cava inferior e a aorta. Use pinça para puxar a sutura e passe-o entre a aorta abdominal e a veia cava inferior. A sutura através da linha cuidadosamente, tentando não puxar/punção da veia cava inferior e a aorta abdominal.</li>
		<li>Fazer uma ligadura cirúrgica em torno da veia cava inferior com pinça de sutura, assegurando uma total oclusão da veia. Mais uma vez, fazer a ligadura imediatamente distal da veia renal esquerda.</li>
		<li>Fazer três lançamentos de sutura para fixar a ligadura. Nota: Também é possível passar a sutura debaixo da veia cava inferior e a aorta antes de separar os dois como uma opção alternativa. Alternativamente, as suturas de Prolene 7-0 podem ser usadas para ligadura dos ramos colaterais e a veia cava inferior.</li>
	</ol></li>
	<li>Fechamento da ferida e cuidados pós-operatórios
	<ol>
<li>Verifique se que a aorta abdominal foi deixada sem interrupções e que todos os ramos laterais têm sido ligados. A veia cava inferior aparecerá dilatação distal do site da ligadura e sem sangue fluxo será visível.</li>
		<li>Coloque toda a gordura peritoneal e os intestinos de volta na cavidade abdominal.</li>
		<li>Feche a ferida, usando pinça de sutura e sutura seda 6-0. Use uma sutura de execução (simples contínua) e certifique-se de que a sutura não será muito apertada. Uma sutura apertada se romper quando o animal acorda e se move em torno de sua gaiola.<ol>
<li>Como alternativa, use grampos PDS, Ethilon, Vicryl, Dexon ou aço inoxidável para fechar ferimentos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>A camada do músculo abdominal, primeiro usando sutura adequada, amarrando a técnica de sutura.</li>
		<li>Repita a técnica de sutura para a pele e verifique se o fechamento da ferida é suficiente. Nota: Se usar a mesma agulha de sutura e linha para vários animais, esterilize ambos em etanol a 70% antes de cada utilização.</li>
		<li>Retire o animal do gás anestésico e colocá-los numa incubadora de 34 ° C durante pelo menos 30 minutos.</li>
		<li>Novamente, administre 0,2 - 0,5 mL de isotônicos por 10 g de peso corporal por via subcutânea. Fluidos podem ser dado em dias seguintes para manter o peso corporal pré-operatório, se necessário.</li>
		<li>Monitore o animal até recuperação para garantir a cirurgia bem sucedida e avaliar a saúde geral do animal. Atenção: Espero uma postura encurvada ligeira para um procedimento invasivo como este, mas o animal irá se comportar normalmente logo em operação após 30 minutos.</li>
		<li>Coloque o animal em sua própria gaiola e não colocá-lo com outros animais até que se recuperou totalmente.</li>
		<li>Re-administrar analgésico diariamente para até 48 h de pós-operatório.</li>
		<li>Coloque os alimentos no chão da gaiola para o animal tempo em recuperação. Outros cuidados especiais geralmente não é necessário.</li>
		<li>Examinamos o local da ferida para vermelhidão, inchaço, ou quitação e outros sinais de infecção.</li>
		<li>Se necessário, remova suturas após 7-10 dias.</li>
		<li>Realizar eutanásia imediatamente se não for bem sucedida cirurgia (por exemplo, navio significativos danos e/ou sangue perda) ou animal não melhora com cuidados pós-operatórios. Eutanásia é geralmente realizada no pós-operatório de 48 h. Para mais experiências, use Prolene 7-0 para ligate ramos laterais e a veia cava inferior e suturas de Vicryl 5-0 para fechar a cavidade abdominal.<ol>
<li>Realizar eutanásia por anesthetization do animal em uma indução como descrito anteriormente, exceto em 5% de isoflurano. Isto é seguido por asfixia com 100% CO2 enquanto anestesiados.</li>
			<li>Após a confirmação da eutanásia por asfixia (perda de pulsação e respiração não), realize deslocamento cervical para garantir a completa eutanásia.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. protocolo de ultra-som de alta frequência de
Nota: Este protocolo é uma adaptação da senhora Davis Instituto roedor fenotipagem núcleo SOP para ultra-sonografia de alta frequência. Este protocolo é realizado pós-operatório de 24 h, mas pode ser feito mais cedo, enquanto o animal está respondendo bem à cirurgia. O protocolo pode ser realizado a qualquer momento em ratos saudáveis e muitas vezes é feito para comparar o antes e depois da cirurgia.
<ol><li>
Preparação do Animal
	<ol>
<li>Coloque o animal em uma câmara de indução e anestesiar o animal com uma mistura de 100% oxigênio e 2,5% de isoflurano.</li>
		<li>Ligue o monitor de temperatura e frequência cardíaca. Lâmpada de calor posição acima da tabela para manter o animal aquecido durante o procedimento.</li>
		<li>Remover o animal da câmara de indução e aplique o lubrificante de olho para evitar a dessecação da córnea. Posição do animal na plataforma de análise e fixar o tubo anestésico para boca/nariz do animal.</li>
		<li>Ultrasom quente do gel a 37 ° C e colocar o gel no abdômen do animal. O gel de ultra-som é aquecido através de um sistema de aquecimento de água que as bombas de água através de bobinas que são enrolados em torno da garrafa de gel quente.</li>
		<li>Para a medição de frequência cardíaca (se necessário), colocar gel de eletrodo nos 4 eléctrodos da plataforma de análise e corrigir as patas do animal para os plataforma/eletrodos com esparadrapo. Coloque o animal em posição supina para a imagem latente da veia cava inferior. O sistema de imagem de ultra-som inclui uma plataforma de análise que é aquecida e contém eletrodos para monitorar o animal.</li>
		<li>Para medições de temperatura, colocar o gel de eletrodo no termômetro e introduza no recto do animal.</li>
		<li>Ajustar a lâmpada de calor e isoflurano conforme necessário para garantir que o animal é confortável, tem uma respiração entre 30-70 bpm e é mantido a 37 ° C.</li>
		<li>Se necessário, raspe o abdômen do animal ou remover cabelo com creme depilatório. Candidatar-se 1-2 minutos e limpe com gaze e água destilada. Nota: Muito cabelo pode afetar a qualidade das imagens.</li>
		<li>Coloque gaze debaixo ou ao lado do animal para pegar qualquer gel de ultra-som em excesso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagem latente do IVC e trombo
	<ol>
<li>Ativar o software de imagem e iniciar um novo estudo.</li>
		<li>Selecione um scanhead apropriado para a imagem latente. O scanhead usado aqui é para órgãos abdominais (frequência: 35 MHz, distância focal: 12,8 mm).</li>
		<li>Grave informações relevantes sobre o animal. Isto pode incluir o animal ID, sexo, peso, data de nascimento, tensão, etc.</li>
		<li>Baixe o scanhead até é comovente o gel de ultra-som do animal.</li>
		<li>Começa a sonda scanhead para começar a 2-D imagens do animal. Neste modo, imagens são apresentadas como duas dimensões, em vários tons de cinza.</li>
		<li>Localize a veia cava inferior e a aorta abdominal, movendo a plataforma do rato ao longo do x - ou y-avião, enquanto também se move o scanhead através de z-plano. Nota: Sangue vasos aparecerá com branco as paredes e o sangue dentro quase preto. A aorta abdominal será pulsam intensamente e têm paredes mais grossas, enquanto a veia cava inferior será têm paredes mais finas e comprimir/expandir facilmente a imagem da tela quando o scanhead é movido para cima e para baixo. O site da ligadura será aparente, como a veia vai ser dilatada e a parede da veia vai chegar a um ponto. Qualquer trombo formado dentro será sólido sob ecografia e não irá comprimir facilmente, como faz a parede da veia. A veia irá comprimir apenas acima da ligadura, onde não há trombo é formado.</li>
		<li>Após localizar a veia cava inferior e o local da ligadura, centralizá-las no ponto focal do ultra-som, a fim de obter a imagem mais precisa.<ol>
<li>Se a imagem for muito escura para ver claramente, ajustar o gel e remover quaisquer bolhas de ar com um aplicador de ponta de algodão.</li>
			<li>Se necessário, incline o scanhead 45° para a esquerda ou direita e reajustar a plataforma animal para ver a veia claramente. Isso é feito se houver interferência com a scanhead. Nesse cenário, a veia precisa ser fotografada em um ângulo de lado para evitar a sutura. Nota: Interferência de imagem geralmente é causada por manchas escuras da pele no animal, na colocação de sutura de ferida pobre ou bolhas no gel ultrasom.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando o software, tirar fotos de todas as estruturas desejadas e fazer medições usando quaisquer ferramentas de medição. Medições comuns incluem a área de seção transversal de trombo ou largura do local da ligadura.</li>
		<li>Altere o modo de imagem de Doppler da onda de pulso para fazer medições de fluxo de sangue. Este modo permite a geração de imagens de fluxo sanguíneo vascular e a medição da velocidade de fluxo, entre outras variáveis.</li>
		<li>Incline a plataforma de análise para abaixar a extremidade posterior do animal.</li>
		<li>Altere a posição/ângulo do scanhead para que ele entrará em contato com o gel em um ângulo de 30° da extremidade posterior do animal.</li>
		<li>Reposicione o animal plataforma e scanhead. Realoca a veia cava inferior e a ligadura, se necessário.</li>
		<li>Fazer medições de fluxo de sangue ao redor do local da ligadura para confirmar a estase e levar todas as imagens desejadas. Medições comuns do fluxo de sangue incluem a velocidade média, velocidade máxima ou velocidade mediana.</li>
		<li>Salve quaisquer medições ou imagens tiradas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Recuperação de limpeza e animal
	<ol>
<li>Levante o scanhead para posição inicial e reposicionar a plataforma animal para sua posição inicial, também.</li>
		<li>Remova o excesso de gel fora o animal com gaze. Fazer isso com cuidado para que a sutura da ferida não vai ser rompida.</li>
		<li>Retire o termómetro do reto do animal e levar o animal fora da plataforma.</li>
		<li>Coloque o animal em sua gaiola e uma incubadora de 34 ° C.</li>
		<li>Monitore o animal até se recuperar. O procedimento é muito menor e não-invasiva. O animal vai acordar rapidamente. Continue a acompanhar o animal no dia seguinte acordo com o ponto 1.6 do presente protocolo.</li>
		<li>Limpe a plataforma animal com gaze e desinfectante.</li>
		<li>Limpe o scanhead limpo com gaze e água destilada. Atenção: Limpar o scanhead muito delicadamente e apenas com água destilada.</li>
		<li>Repita a etapa 2 para o próximo animal.<ol>
<li>Se feito com todas as disciplinas, verificar que todas as imagens e gravações foram salvos. Em seguida, desligue todos os equipamentos e software.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Existem várias etapas críticas para a formação de trombo venoso bem sucedida usando o modelo de estase. Indução da trombose venosa profunda é mais desafiador em ratos velhos, devido ao acúmulo de gordura em torno da veia cava inferior e a aorta. Idealmente, os ratos submetidos a este procedimento devem ser de 8 - 10 semanas de idade. Deve ter grande cuidado para não induzir dano endotelial na veia cava inferior durante a dissecção romba e ligadura. Além disso, é crucial para manter o animal em uma incubadora...

Tromboembolismo venoso (TEV), que é composto de trombose venosa profunda (TVP) e embolia pulmonar, é a terceira causa principal de morte cardiovascular após infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. É uma condição comum que afeta 1-2% da população, com uma incidência anual de 1 em 5001. VTE pode levar a: 1) morte por embolia pulmonar; 2) pós-trombótica síndrome, caracterizada por dor crônica, edema e ulceração; ou 3) hipertensão pulmonar crônica, resultando em significativo compromisso respiratório crônico. TeV é uma doença multi fatorial e pode resultar de estase do fluxo de sangue, danos nas paredes dos vasos, e/ou Estados de hipercoagulabilidade, devido a uma perturbação do equilíbrio entre a coagulação e os sistemas fibrinolíticos, como tem sido descrito há mais de uma centena de anos por Virchow e é conhecido como Tríade de Virchow.
Porque na maioria dos casos, é impossível obter amostras humanas de TVP, pesquisadores desenvolveram modelos animais experimentais de TVP. Vários animais, incluindo rato2rato3, coelho4, porco5, cão6e primatas não humanos7 têm sido utilizados. Os ratos podem ser geneticamente modificados e são os animais mais frequentemente usados para estudar a TVP. No entanto, como em todos os animais, DVT espontâneo não é observado em ratos. Assim, alterações físicas ou químicas da parede da veia são usadas para criar a trombose em ratos. Anteriormente nós usamos o modelo de cloreto férrico para induzir trombose na veia cava inferior (VCI) de ratos8,9,10. Este modelo tem a vantagem de produzir confiantemente trombos oclusivos em poucos minutos e pode ser usado para investigar o papel das drogas anticoagulantes e plaquetária durante TVP aguda. No entanto, é um procedimento de terminal. Assim, para estudar TVP aguda e crônica, o modelo de estase é mais adequado. Neste modelo, formação de trombos é induzida pela interrupção completa do fluxo de sangue na veia cava inferior, um dos fatores na tríade de Virchow para desenvolvimento de TVP. Este modelo pode ser usado para estudar a formação de TVP e resolução, que é uma vantagem em comparação com o FeCl3 modelo11.
Nós desenvolvemos um método não-invasivo para acompanhar a formação de trombos e resolução ao longo do tempo usando um sistema de ultra-som de alta frequência de micro imagem12. Demonstramos anteriormente que medição da trombose venosa por ultra-som correlaciona-se favoravelmente com trombos obtidos patologicamente. Confirmamos em dois estudos subsequentes que medições obtidas com ultra-som se correlacionam com o peso do trombo e área de trombo quantificada por histoquímica9,10. Mais importante, nós mostraram que o ultra-som de alta frequência pode ser usado para monitorar a formação de trombose venosa profunda em ratos12. Ele também pode ser usado para quantificar a resolução do trombo em uma forma não-invasiva.
Aqui, descrevemos o protocolo que permite a formação de trombos, usando o modelo do rato de trombose induzida em estase e como formação de trombos pode ser monitorizada de forma não-invasiva ao longo do tempo usando o ultra-som de alta frequência.

<table><tbody><tr><td>6-0 perma-hand silk suture</td><td>Ethicon</td><td>706G</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>Suture tying forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>blunt forceps (straight and curved)</td><td>Fine Science Tools</td><td>20830-00</td><td></td></tr><tr><td>Needle Driver</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>1ml syringes</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>26G needles</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VEVO 770 High Resolution Imaging System</td><td>Visualsonics</td><td>No longer sold</td><td></td></tr><tr><td>SR Buprenorphine</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>Given to LDI by Vet</td></tr><tr><td>Surgery Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica M651</td><td></td></tr><tr><td>Systan eye oinment</td><td>Alcon</td><td>288/28062-0</td><td></td></tr><tr><td>2x2 sterile Gauze</td><td>CDMV</td><td>#104148</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tip Applicators</td><td></td><td></td><td>from JGH</td></tr><tr><td>Transpore hypoallergenic surgical tape</td><td>CDMV</td><td>#7411</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound gel (Aquasonic-100)</td><td>Dufort &amp;amp; Lavigne</td><td>#AKEN4061</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>From JGH</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Dispomed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthetic chamber,hoses, and adminstration equipment</td><td>Dispomed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hair remover</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water heated hard pad</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>#HHP-2</td><td></td></tr><tr><td>Gaymar heater water pump TP500</td><td>MATVET Inc.</td><td>#R-500305</td><td></td></tr><tr><td>Infra-red heating lamp</td><td>electrimat inc.</td><td>#1R175R-PAR</td><td></td></tr><tr><td>Mouse rectal temperature prope</td><td>emkaTECHNOLOGIES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile water</td><td></td><td></td><td>From JGH</td></tr></tbody></table>

deep vein thrombosis induced by stasis in mice monitored by high frequency ultrasonography

Trombose venosa profunda é uma condição comum que afeta 1-2% da população, com uma incidência anual de 1 em 500. Trombose venosa profunda pode levar à morte por embolia pulmonar ou resultados na síndrome pós-trombótica, caracterizada por dor crônica, edema e ulceração, ou em hipertensão pulmonar crônica, resultando em significativa crônica respiratória compromisso. Esta é a mais comum doença cardiovascular após infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral isquêmico e é um desafio clínico para todas as disciplinas médicas, como isso pode complicar o curso de outras doenças como o câncer, doença sistêmica, cirurgia e grande trauma.
Modelos experimentais são necessários para estudar esses mecanismos. O modelo de estase induz o tamanho do trombo consistente e uma quantidade quantificável de trombo. No entanto, é necessário sistematicamente ligate ramos laterais da veia cava inferior para evitar a variabilidade em tamanhos de trombo e qualquer interpretação de dados errôneos. Nós desenvolvemos uma técnica não-invasiva para medir o tamanho do trombo usando a ultra-sonografia. Usando esta técnica, que podemos avaliar o desenvolvimento do trombo e resolução ao longo do tempo, no mesmo animal. Essa abordagem limita o número de ratos necessários para quantificação da trombose venosa consistente com o princípio da substituição, redução e refinamento de animais na investigação. Nós demonstramos que o peso do trombo e análise histológica de trombo tamanho se correlacionam com medição obtidos com ultra-sonografia. Portanto, o presente estudo descreve como induzir trombose venosa profunda em camundongos, usando o modelo de estase de veia cava inferior e como monitorá-lo usando o ultra-som de alta frequência.

Modelo de trombose venosa estase
No modelo de estase, ratos são anestesiados, e é feita uma incisão para expor a veia cava inferior (VCI). A incisão é feita no lado esquerdo ou direito do mouse em vez de uma laparotomia mediana de uma forma que não iria interferir com a sonda de ultra-som. A pele e os músculos abdominais são dobra para expor a veia cava inferior (Figura 1). ...

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Deep Vein Thrombosis Induced by Stasis in Mice Monitored by High Frequency Ultrasonography

O presente protocolo descreve as etapas para obter a trombose venosa, usando um modelo de estase. Além disso, estamos usando um método não-invasivo para medir a formação de trombos e resolução ao longo do tempo.

Trombose venosa profunda induzida por estase em camundongos monitorado por ultra-sonografia de alta frequência

Venous thrombosis is a common condition affecting 1 - 2% of the population, with an annual incidence of 1 in 500. Venous thrombosis can lead to death ...

deep-vein-thrombosis-induced-stasis-mice-monitored-high-frequency

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.8K visualizações.  McGill University. O presente protocolo descreve as etapas para obter a trombose venosa, usando um modelo de estase. Além disso, estamos usando um método não-invasivo para medir a formação de trombos e resolução ao longo do tempo.

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Electrolytic Inferior Vena Cava Model (EIM) of Venous Thrombosis

Animal models serve a vital role in deep venous thrombosis (DVT) research in order to study thrombus formation, thrombus resolution and to test potential therapeutic compounds (1). New compounds to be utilized in the treatment and prevention of DVT are currently being developed. The delivery of potential therapeutic antagonist compounds to an affected thrombosed vein has been problematic. In the context of therapeutic applications, a model that uses partial stasis and consistently generates thrombi within a major vein has been recently established. The Electrolytic Inferior vena cava Model (EIM) is mouse model of DVT that permits thrombus formation in the presence of continuous blood flow. This model allows therapeutic agents to be in contact with the thrombus in a dynamic fashion, and is more sensitive than other models of DVT (1). In addition, this thrombosis model closely simulates clinical situations of thrombus formation and is ideal to study venous endothelial cell activation, leukocyte migration, venous thrombogenesis, and to test therapeutic applications (1). The EIM model is technically simple, easily reproducible, creates consistent thrombi sizes and allows for a large sample (i.e. thrombus and vein wall) which is required for analytical purposes.

Electrolytic Inferior Vena Cava Model EIM of Venous Thrombosis

The electrolytic induction of endothelial activation to the internal surface of the Inferior Vena Cava results in venous type thrombus formation due to endothelial activation and partial blood stasis, two components of Virchow's triad.

Eletrolítico Veia Cava Inferior Model (EIM) de trombose venosa

Animal models serve a vital role in deep venous thrombosis (DVT) research in order to study thrombus formation, thrombus resolution and to test potential ...

Medicina

Mouse Complete Stasis Model of Inferior Vena Cava Thrombosis

Venous thromboembolism (VTE) includes both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE). In the United States (U.S.), the high morbidity and mortality rates make VTE a serious health concern 1-2. After heart disease and stroke, VTE is the third most common vascular disease 3. In the U.S. alone, there is an estimated 900,000 people affected each year, with 300,000 deaths occurring annually 3. A reliable in vivo animal model to study the mechanisms of this disease is necessary.
The advantages of using the mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis are several. The mouse model allows for the administration of very small volumes of limited availability test agents, reducing costs dramatically. Most promising is the potential for mice with gene knockouts that allow specific inflammatory and coagulation factor functions to be delineated. Current molecular assays allow for the quantitation of vein wall, thrombus, whole blood, and plasma for assays. However, a major concern involving this model is the operative size constraints and the friability of the vessels. Also, due to the small IVC sample weight (mean 0.005 grams) it is necessary to increase animal numbers for accurate statistical analysis for tissue, thrombus, and blood assays such as real-time polymerase chain reaction (RT-PCR), western blot, enzyme-linked immunosorbent (ELISA), zymography, vein wall and thrombus cellular analysis, and whole blood and plasma assays 4-8.
The major disadvantage with the stasis model is that the lack of blood flow inhibits the maximal effect of administered systemic therapeutic agents on the thrombus and vein wall.

The mouse complete stasis model of inferior vena cava thrombosis yields quantifiable amounts of vein wall tissue and thrombus. It has proven useful for evaluating interactions between the vein wall and the occlusive thrombus and in assessing the progression from acute to chronic inflammation.

Modelo do mouse completa de Stasis Inferior Trombose da veia cava

Venous thromboembolism (VTE) includes both deep vein thrombosis (DVT) and pulmonary embolism (PE).  In the United States (U.S.), the high morbidity and ...

Non-Invasive Ultrasound Assessment of Endometrial Cancer Progression in Pax8-Directed Deletion of the Tumor Suppressors Arid1a and Pten in Mice

Uterine cancers can be studied in mice due to the ease of handling and genetic manipulation in these models. However, these studies are often limited to assessing pathology post-mortem in animals euthanized at multiple time points in different cohorts, which increases the number of mice needed for a study. Imaging mice in longitudinal studies can track the progression of disease in individual animals, reducing the number of mice needed. Advances in ultrasound technology have allowed for the detection of micrometer-level changes in tissues. Ultrasound has been used to study follicle maturation in ovaries and xenograft growth but has not been applied to morphological changes in the mouse uterus. This protocol examines the juxtaposition of pathology with in vivo imaging comparisons in an induced endometrial cancer mouse model. The features observed by ultrasound were consistent with the degree of change seen by gross pathology and histology. Ultrasound was found to be highly predictive of the observed pathology, supporting the incorporation of ultrasonography into longitudinal studies of uterine diseases such as cancer in mice.

Non-Invasive Ultrasound Assessment of Endometrial Cancer Progression in Pax8-Directed Deletion of the Tumor Suppressors Arid1a and Pten in Mice

This protocol describes a method for monitoring the progression of morphological changes over time in the uterus in an inducible mouse model of endometrial cancer using ultrasound imaging with correlation to gross and histological changes.

Avaliação Ultrassonográfica Não Invasiva da Progressão do Câncer de Endométrio na Deleção Dirigida por Pax8 dos Supressores Tumorais Arid1a e Pten em Camundongos

Uterine cancers can be studied in mice due to the ease of handling and genetic manipulation in these models. However, these studies are often limited to ...

Pesquisa do câncer

Ensaio de trombose venosa otimizado em um modelo de câncer de camundongo usando clipes vasculares

Venous Thrombosis Assay in a Mouse Model of Cancer

This methodology paper highlights the surgical nuances of a rodent model of venous thrombosis, specifically in the context of cancer-associated thrombosis (CAT). Deep venous thrombosis is a common complication in cancer survivors and can be potentially fatal. The current murine venous thrombosis models typically involve a complete or partial mechanical occlusion of the inferior vena cava (IVC) using a suture. This procedure induces a total or partial stasis of blood and endothelial damage, triggering thrombogenesis. The current models have limitations such as higher variability in clot weights, significant mortality rate, and prolonged learning curve. This report introduces surgical refinements using vascular clips to address some of these limitations. Using a syngeneic colon cancer xenograft mouse model, we employed customized vascular clips to ligate the infrarenal vena cava. These clips allow residual lip space similar to a 5-0 polypropylene suture after IVC ligations. Mice with the suture method served as controls. The vascular clip method resulted in a consistent reproducible partial vascular occlusion and greater clot weights with less variability than the suture method. The larger clot weights, greater clot mass, and clot to the IVC luminal surface area were expected due to the higher pressure profile of the vascular clips compared to a 6-0 polypropylene suture. The approach was validated by gray scale ultrasonography, which revealed consistently greater clot mass in the infrarenal vena cava with vascular clips compared to the suture method. These observations were further substantiated with the immunofluorescence staining. This study offers an improved method to generate a venous thrombosis model in mice, which can be employed to deepen the mechanistic understanding of CAT and in translational research such as drug discovery.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de trombose associada ao câncer em modelos de roedores 

This article aims to present an optimized method for assessing venous thrombosis in a mouse cancer model, using vascular clips to achieve venous ligation. Optimization minimizes variability in thrombosis-related measurements and enhances relevance to human cancer-associated venous thrombosis.

Ensaio de Trombose Venosa em Modelo de Câncer em Camundongos

This methodology paper highlights the surgical nuances of a rodent model of venous thrombosis, specifically in the context of cancer-associated thrombosis ...

Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus formation in veins remain obscure. Lack of mobility (e.g., after surgery or long-haul flights) is one of the main factors leading to DVT. The pathophysiological consequence of the lack of mobility is blood flow stagnation in venous valves. Here, a model is described that mimics such flow disturbance as a thrombosis-driving factor. In this model, partial flow restriction (stenosis) in the inferior vena cava (IVC) is created. Closure of about 90% of the IVC lumen for 48 h results in development of thrombi structurally similar to those in humans. The similarities are: i) most of the thrombus volume is red, i.e., consists of red blood cells and fibrin, ii) presence of a white part (lines of Zahn), iii) non-denuded endothelial monolayer, iv) elevated plasma D-Dimer levels, and v) possibility to prevent thrombosis by low molecular weight heparin. Limitations include variable size of thrombi and the fact that a certain percentage of wild-type mice (0 - 35%) may not produce a thrombus. In addition to visual observation and measurement, thrombi may be visualized by non-invasive technologies, such as ultrasonography, which allows for monitoring the dynamics of thrombus development. At shorter time points (1 - 6 h), intravital microscopy may be applied to directly observe events (e.g., recruitment of cells to the vessel wall) preceding thrombus formation. Use of this method by several teams around the world has made it possible to uncover basic mechanisms of DVT initiation and identify potential targets that might be beneficial for its prevention.

We describe here stenosis in the inferior vena cava as a murine model of deep vein thrombosis. This model recapitulates blood flow restriction, one of the major triggers of venous thrombosis in humans.

Estenose da veia Cava Inferior: um modelo murino de trombose venosa profunda

Deep vein thrombosis (DVT) and its devastating complication, pulmonary embolism, are a severe health problem with high mortality. Mechanisms of thrombus ...

Imunologia e Infecção

Murine Model of Central Venous Stenosis using Aortocaval Fistula with an Outflow Stenosis

Central venous stenosis is an important entity contributing to arteriovenous fistula (AVF) failure. A murine AVF model was modified to create a partial ligation of the inferior vena cava (IVC) in the outflow of the fistula, mimicking central venous stenosis. Technical aspects of this model are introduced. The aorta and IVC are exposed, following an abdominal incision. The infra-renal aorta and IVC are dissected for proximal clamping, and the distal aorta is exposed for puncture. The IVC at the midpoint between the left renal vein and the aortic bifurcation is carefully dissected to place an 8-0 suture beneath the IVC. After clamping the aorta and IVC, an AVF is created by puncturing the infra-renal aorta through both walls into the IVC with a 25 G needle, followed by ligating a 22 G intra-venous (IV) catheter and IVC together. The catheter is then removed, creating a reproducible venous stenosis without occlusion. The aorta and IVC are unclamped after confirming primary hemostasis. This novel model of central vein stenosis is easy to perform, reproducible, and will facilitate studies on AVF failure.

An aortocaval fistula was created by puncturing the murine infra-renal aorta through both walls into the inferior vena cava and was followed by creation of a stenosis in its outflow via partial ligation of the inferior vena cava. This reproducible model can be used to study central venous stenosis.

Modelo murino de estenose venosa central usando fístula Aortocaval com estenose de saída

Central venous stenosis is an important entity contributing to arteriovenous fistula (AVF) failure. A murine AVF model was modified to create a partial ...

Analysis of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage with High Frequency Transcranial Duplex Ultrasound

Cerebral vasospasm that occurs in the weeks after subarachnoid hemorrhage, a type of hemorrhagic stroke, contributes to delayed cerebral ischemia. A problem encountered in experimental studies using murine models of SAH is that methods for in vivo monitoring of cerebral vasospasm in mice are lacking. Here, we demonstrate the application of high frequency ultrasound to perform transcranial Duplex sonography examinations on mice. Using the method, the internal carotid arteries (ICA) could be identified. The blood flow velocities in the intracranial ICAs were accelerated significantly after induction of SAH, while blood flow velocities in the extracranial ICAs remained low, indicating cerebral vasospasm. In conclusion, the method demonstrated here allows functional, noninvasive in vivo monitoring of cerebral vasospasm in a murine SAH model.

The aim of this manuscript is to present a sonography-based method that allows in vivo imaging of blood flow in cerebral arteries in mice. We demonstrate its application to determine changes in blood flow velocities associated with vasospasm in murine models of subarachnoid hemorrhage (SAH).

Análise do Vasospasmo Cerebral em um Modelo Murine de Hemorragia Subaracnóide com Ultrassom Duplex Transcranial de Alta Frequência

Cerebral vasospasm that occurs in the weeks after subarachnoid hemorrhage, a type of hemorrhagic stroke, contributes to delayed cerebral ischemia. A ...

Neurociência

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

Trombose venosa profunda induzida por estase em camundongos monitorado por ultra-sonografia de alta frequência

Resumo

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Eletrolítico Veia Cava Inferior Model (EIM) de trombose venosa

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Ensaio de Trombose Venosa em Modelo de Câncer em Camundongos

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