Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo biomédico, como a compreensão do fenótipo de subsébios biologicamente relevantes. A principal vantagem dessa técnica é que permite que um indivíduo sem experiência de programação analise seus dados de citometria com o que há de mais moderno em técnicas de alta dimensão. Para iniciar um pipeline de análise, selecione primeiro o tipo de citometria e o número de eventos para amostrar do arquivo.
Em seguida, clique em População de Portão, selecione as populações celulares de interesse e insira a porcentagem de eventos para análise a jusante. Em seguida, selecione o número de canais a serem usados para a análise na caixa de lista. Para a análise do Vizinho Estocástico distribuído por T, ou análise t-SNE, clique em t-SNE para começar a calcular o conjunto de dados de dimensionalidade reduzido.
Quando o conjunto tiver sido calculado, clique em Salvar a imagem TSNE e no menu pop-s t-SNE específico do marcador, selecione um marcador específico de interesse. Uma figura aparecerá mostrando uma representação do mapa de calor do enredo t-SNE que pode ser salvo para geração de figuras. Para iniciar a análise de clustering, selecione uma opção na lista Método de clustering e clique em Cluster.
Para classificar os clusters por um marcador de interesse, selecione a opção correspondente apropriada no menu pop-up Sort e clique em Ascender, Descendo, para atualizar a lista de clusters na lista Clusters. Para definir um valor mínimo de limite para um determinado cluster em um determinado canal, selecione uma opção no menu pop-up Threshold e defina um limite apropriado. Uma vez definido o limiar, clique em Adicionar acima do limiar ou adicionar abaixo do limiar, para especificar a direção do limiar e digitar um corte numérico na caixa Limiar de Frequência de Cluster, no painel Filtro de Cluster, para definir um limite mínimo para a frequência de um cluster.
Para selecionar clusters para posterior individualização de análise, selecione os clusters de interesse, na caixa de lista Clusters. E use o botão Selecionar, para mover as opções para a caixa de lista Cluster Analyze. Para criar mapas de calor dos clusters, selecione os clusters de interesse na caixa de lista Cluster Analyze e clique no botão HeatMap of Clusters.
Para criar um gráfico de caixa de alta dimensão, ou um gráfico de fluxo de alta dimensão, selecione os clusters de interesse na caixa de lista Cluster Analyze e clique em Gráfico de Caixa De alta dimensão, ou Gráfico de Fluxo de Alta Dimensão, para avaliar visualmente a distribuição de determinados canais de vários clusters em todas as dimensões. Para mostrar clusters em gráficos de fluxo 2D tradicionais, selecione a transformação e o canal apropriados no painel Plot de Fluxo Convencional e clique em Plot de Fluxo Convencional. Aqui, uma análise t-SNE representativa de mapas de calor para vários marcadores dentro de um pipeline de análise de painel mielóide, são mostrados.
Usando a rápida implementação gananciosa dentro do ExCYT para agrupar os dados com 100.000 dos vizinhos mais próximos, 19 subsu populações de células foram reveladas. A comparação dos mapas de calor originais com os clusters criados pela ExCYT permitiu que grupos semelhantes das células mielóides fossem identificados entre os dois grupos de dados. A análise do painel linfoide com uma abordagem hierárquica mais convencional e mais rápida, rendeu distribuições de marcadores semelhantes através de mapas de calor t-SNE.
Além disso, o agrupamento dos dados através de agrupamento hierárquico demonstrou agrupamentos semelhantes de células linfoides. Notavelmente, uma população de células T regulamentar única também foi identificada através de uma parcela de fluxo de alta dimensão. Para avaliar de forma rápida e quantitativa as co-associações entre os marcadores, primeiro um algoritmo de agrupamento de meios K rígido foi usado para estabelecer 5000 clusters nos dados t-SNE bidimensionais.
A expressão mediana de todos os marcadores de todos os clusters foi então utilizada, para criar um mapa de calor a partir desses clusters, permitindo que co-associações fossem facilmente identificadas, como a co-associação de Tim-3, PD-1, CD38 e 4-1BB. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar de explorar os diferentes parâmetros, como diferentes métodos de agrupamento, para explorar completamente os dados que você está estudando.
