Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine biomédical, comme la compréhension du phénotype de sous-populations biologiquement pertinentes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet à un individu sans expérience de programmation d’analyser ses données de cytométrie avec les dernières techniques de haute dimension. Pour commencer un pipeline d’analyse, sélectionnez d’abord le type de cytométrie et le nombre d’événements à échantillonner dans le fichier.
Ensuite, cliquez sur Gate Population, sélectionnez les populations cellulaires d’intérêt et entrez le pourcentage d’événements pour analyse en aval. Sélectionnez ensuite le nombre de canaux à utiliser pour l’analyse dans la boîte de liste. Pour l’intégration du voisin stochastique distribuée en T, ou l’analyse t-SNE, cliquez sur t-SNE pour commencer à calculer l’ensemble de données de dimensionnalité réduite.
Lorsque l’ensemble a été calculé, cliquez sur Enregistrer l’image TSNE et dans le menu popup t-SNE spécifique au marqueur, sélectionnez un marqueur d’intérêt spécifique. Une figure apparaîtra montrant une représentation de la carte thermique de l’intrigue t-SNE qui peut être enregistrée pour la génération de chiffres. Pour commencer l’analyse de clustering, sélectionnez une option dans la boîte de liste de méthode de clustering, et cliquez sur Cluster.
Pour trier les clusters par un marqueur d’intérêt, sélectionnez l’option correspondante appropriée dans le menu Sort popup, et cliquez sur Ascendant, Descente, pour mettre à jour la liste des clusters dans la boîte de liste clusters. Pour définir une valeur seuil minimale pour un cluster donné sur un certain canal, sélectionnez une option dans le menu popup Threshold et fixez un seuil approprié. Une fois le seuil défini, cliquez sur Ajouter au-dessus du seuil, ou Ajouter en dessous du seuil, pour spécifier la direction du seuil, et entrez une coupure numérique dans la case Seuil de fréquence de cluster, dans le panneau filtre cluster, pour définir un seuil minimal pour la fréquence d’un cluster.
Pour sélectionner des clusters pour une analyse plus approfondie de l’individualisation, sélectionnez les clusters d’intérêt, dans la boîte de liste clusters. Et utilisez le bouton Sélectionnez, pour déplacer les options vers la boîte de liste Cluster Analyze. Pour créer des cartes thermiques des clusters, sélectionnez les clusters d’intérêt dans la boîte de liste Cluster Analyze et cliquez sur le bouton HeatMap of Clusters.
Pour créer une parcelle de boîte haute dimensionnelle, ou une parcelle de flux de haute dimension, sélectionnez les clusters d’intérêt dans la boîte de liste Cluster Analyze, et cliquez soit sur High-Dimensional Box Plot, ou High-Dimensional Flow Plot, pour évaluer visuellement la distribution de canaux donnés de différents clusters dans toutes les dimensions. Pour afficher les clusters dans les parcelles de flux 2D traditionnelles, sélectionnez la transformation et le canal appropriés dans le panneau Conventional Flow Plot, et cliquez sur Conventional Flow Plot. Ici, une analyse représentative t-SNE des cartes thermiques pour divers marqueurs dans un pipeline d’analyse de panneau myéloïde, sont montrés.
En utilisant la mise en œuvre rapide et gourmande au sein d’ExCYT pour regrouper les données avec 100 000 des voisins les plus proches, 19 sous-populations de cellules ont été révélées. La comparaison des cartes thermiques originales avec les grappes créées par ExCYT a permis d’identifier des grappes similaires des cellules myéloïdes entre les deux groupes de données. L’analyse du panneau lymphoïde avec une approche hiérarchique plus conventionnelle et plus rapide de regroupement, a donné des distributions semblables de marqueur par l’intermédiaire des cartes thermiques de t-SNE.
En outre, le regroupement des données par clustering hiérarchique a démontré des grappes similaires de cellules lymphoïdes. Notamment, une population unique de cellules T réglementaires a également été identifiée par l’intermédiaire d’une parcelle de débit de haute dimension. Pour évaluer rapidement et quantitativement les co-associations entre les marqueurs, un algorithme de clustering k-means dur a d’abord été utilisé pour poser 5000 clusters sur les données bidimensionnelles t-SNE.
L’expression médiane de tous les marqueurs de tous les clusters a ensuite été utilisée, pour créer une carte thermique à partir de ces clusters, permettant d’identifier facilement les co-associations, telles que la co-association de Tim-3, PD-1, CD38 et 4-1BB. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’explorer les différents paramètres, tels que les différentes méthodes de clustering, pour explorer pleinement les données que vous étudiez.
