Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im biomedizinischen Bereich zu beantworten, wie z. B. das Verständnis des Phänotyps biologisch relevanter Subpopulationen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es einer Person ohne Programmiererfahrung ermöglicht, ihre Zytometriedaten mit den neuesten hochdimensionalen Techniken zu analysieren. Um eine Analysepipeline zu starten, wählen Sie zunächst den Zytometrietyp und die Anzahl der Ereignisse aus der Datei aus.
Klicken Sie als Nächstes auf Gate-Bevölkerung, wählen Sie die von Interesse interessierten Zellpopulationen aus, und geben Sie den Prozentsatz der Ereignisse für die nachgelagerte Analyse ein. Wählen Sie dann im Listenfeld die Anzahl der Kanäle aus, die für die Analyse verwendet werden sollen. Klicken Sie für T-distributed Stochastic Neighbor Embedding oder t-SNE-Analyse auf t-SNE, um mit der Berechnung des reduzierten Dimensionsdaten-Datasets zu beginnen.
Wenn der Satz berechnet wurde, klicken Sie auf TSNE-Bild speichern, und wählen Sie im Popupmenü Marker-Specific t-SNE einen bestimmten Marker aus. Es wird eine Abbildung angezeigt, die eine Heatmap-Darstellung des t-SNE-Plots zeigt, die für die Abbildungsgenerierung gespeichert werden kann. Um mit der Clusteranalyse zu beginnen, wählen Sie im Listenfeld Clusteringmethode eine Option aus, und klicken Sie auf Cluster.
Um die Cluster nach einer Markierung von Interesse zu sortieren, wählen Sie die entsprechende Option aus dem Popupmenü Sortieren aus, und klicken Sie im Listenfeld Cluster auf Aufsteigend, Absteigend, um die Liste der Cluster zu aktualisieren. Um einen minimalen Schwellenwert für einen bestimmten Cluster über einen bestimmten Kanal festzulegen, wählen Sie eine Option im Popupmenü Schwellenwert aus, und legen Sie einen entsprechenden Schwellenwert fest. Nachdem der Schwellenwert festgelegt wurde, klicken Sie auf Über-Schwellenwert hinzufügen oder Unterschwellenwert hinzufügen, um die Richtung des Schwellenwerts anzugeben, und geben Sie im Feld Clusterfrequenzschwellenwert im Clusterfilterfeld einen numerischen Grenzwert ein, um einen minimalen Schwellenwert für die Häufigkeit eines Clusters festzulegen.
Um Cluster für die weitere Analyseindividualisierung auszuwählen, wählen Sie im Listenfeld Cluster die clusters of interest aus. Verwenden Sie die Schaltfläche Auswählen, um die Optionen in das Listenfeld Clusteranalyse zu verschieben. Um Heatmaps der Cluster zu erstellen, wählen Sie die von Interesse sindden Cluster im Listenfeld Clusteranalyse aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche HeatMap der Cluster.
Um ein hochdimensionales Box-Plot oder ein hochdimensionales Flussdiagramm zu erstellen, wählen Sie die Cluster von Interesse im Listenfeld Clusteranalyse aus, und klicken Sie entweder auf High-Dimensional Box Plot oder High-Dimensional Flow Plot, um die Verteilung der angegebenen Kanäle verschiedener Cluster über alle Dimensionen hinweg visuell zu bewerten. Um Cluster in herkömmlichen 2D-Flussdiagrammen anzuzeigen, wählen Sie die entsprechende Transformation und den entsprechenden Kanal im Bedienfeld "Konventionelles Flussdiagramm" aus, und klicken Sie auf Konventionelles Flussdiagramm. Hier wird eine repräsentative t-SNE-Analyse von Heatmaps für verschiedene Marker innerhalb einer myeloischen Panelanalyse-Pipeline gezeigt.
Mit der schnellen gierigen Implementierung innerhalb von ExCYT wurden die Daten mit 100.000 der nächsten Nachbarn gruppiert, 19 Teilpopulationen von Zellen wurden aufgedeckt. Durch den Vergleich der ursprünglichen Heatmaps mit den von ExCYT erstellten Clustern konnten ähnliche Cluster der myeloischen Zellen zwischen den beiden Datengruppen identifiziert werden. Die Analyse des Lymphoid-Panels mit einem konventionelleren und schnelleren hierarchischen Clustering-Ansatz ergab ähnliche Markerverteilungen über t-SNE-Wärmekarten.
Darüber hinaus zeigte die Clusterbildung der Daten über hierarchische Clusterbildung ähnliche Cluster von Lymphzellen. Bemerkenswert ist, dass eine einzigartige regulatorische T-Zellpopulation auch über ein hochdimensionales Strömungsdiagramm identifiziert wurde. Um Die Ko-Assoziationen zwischen Markern schnell und quantitativ zu bewerten, wurde zunächst ein harter K-Means-Clustering-Algorithmus verwendet, um 5000 Cluster auf den zweidimensionalen t-SNE-Daten festzulegen.
Der mediane Ausdruck aller Marker aus allen Clustern wurde dann verwendet, um aus diesen Clustern eine Heatmap zu erstellen, mit der Ko-Assoziationen leicht identifiziert werden können, wie z. B. die Mitzuordnung von Tim-3, PD-1, CD38 und 4-1BB. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die verschiedenen Parameter, z. B. verschiedene Clusteringmethoden, zu untersuchen, um die Daten, die Sie untersuchen, vollständig zu untersuchen.
