Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biomedico, come la comprensione del fenotipo delle sotto-popolazioni biologicamente rilevanti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente a un individuo senza esperienza di programmazione di analizzare i propri dati di citometria con le più recenti tecniche ad alta dimensione. Per iniziare una pipeline di analisi, selezionare innanzitutto il tipo di citometria e il numero di eventi da campionare dal file.
Fare quindi clic su Gate Population, selezionare le popolazioni di celle di interesse e immettere la percentuale di eventi per l'analisi downstream. Selezionare quindi il numero di canali da utilizzare per l'analisi nella casella di riepilogo. Per l'incorporamento stocastico adiacente distribuito a T, o analisi t-SNE, fare clic su t-SNE per iniziare a calcolare il set di dati di dimensionalità ridotta.
Una volta calcolato il set, fate clic su Salva immagine TSNE (Save TSNE Image) e nel menu di scelta rapida T-SNE specifico del marcatore selezionare un marcatore specifico di interesse. Apparirà una figura che mostra una rappresentazione della mappa termica del plottaggio t-SNE che può essere salvata per la generazione della figura. Per iniziare l'analisi del clustering, selezionare un'opzione nella casella di riepilogo Metodo cluster e fare clic su Cluster.
Per ordinare i cluster in base a un indicatore di interesse, selezionare l'opzione corrispondente appropriata dal menu di scelta rapida Ordina e fare clic su Crescente, Decrescente, per aggiornare l'elenco dei cluster nella casella di riepilogo Cluster. Per impostare un valore di soglia minimo per un determinato cluster su un determinato canale, selezionare un'opzione dal menu di scelta rapida Soglia e impostare una soglia appropriata. Una volta impostata la soglia, fare clic su Aggiungi soglia sopra o Aggiungi sotto soglia per specificare la direzione della soglia e immettere un taglio numerico nella casella Soglia frequenza cluster, nel pannello Filtro cluster, per impostare una soglia minima per la frequenza di un cluster.
Per selezionare i cluster per un'ulteriore individualizzazione dell'analisi, selezionare i cluster di interesse nella casella di riepilogo Cluster. Usare il pulsante Seleziona per spostare le opzioni nella casella di riepilogo Analisi cluster. Per creare mappe di calore dei cluster, selezionare i cluster di interesse nella casella di riepilogo Analisi cluster e fare clic sul pulsante HeatMap of Clusters.
Per creare un box plot ad alta dimensione o un plottaggio di flusso ad alta dimensione, selezionate i cluster di interesse nella casella di riepilogo Analisi cluster e fate clic su Plot scatola altadimensionale o plottaggio flusso ad alta dimensione per valutare visivamente la distribuzione di determinati canali di vari cluster in tutte le quote. Per visualizzare i cluster nei plottamenti di flusso 2D tradizionali, selezionate la trasformazione e il canale appropriati nel pannello Plottaggio flusso convenzionale e fate clic su Plottaggio flusso convenzionale (Conventional Flow Plot). Qui viene mostrata un'analisi rappresentativa t-SNE delle mappe di calore per vari marcatori all'interno di una tubazione di analisi del pannello mieloide.
Utilizzando la rapida implementazione avida all'interno di ExCYT per raggruppare i dati con 100.000 dei vicini più vicini, sono state rivelate 19 sotto-popolazioni di cellule. Il confronto delle mappe di calore originali con i cluster creati da ExCYT ha permesso di identificare cluster simili delle cellule mieloidi tra i due gruppi di dati. L'analisi del pannello linfoide con un approccio di clustering gerarchico più convenzionale e veloce, ha prodotto distribuzioni marcatori simili tramite mappe di calore t-SNE.
Inoltre, il raggruppamento dei dati attraverso il clustering gerarchico ha dimostrato cluster simili di cellule linfoidi. In particolare, una popolazione di cellule T regolatorie unica è stata identificata anche attraverso un diagramma di flusso ad alta dimensione. Per valutare rapidamente e quantitativamente le co-associazioni tra marcatori, prima è stato utilizzato un algoritmo di clustering K-means duro per stabilire 5000 cluster sui dati t-SNE bidimensionali.
L'espressione mediana di tutti i marcatori di tutti i cluster è stata quindi utilizzata, per creare una mappa termica da questi cluster, consentendo di identificare facilmente le co-associazioni, come la co-associazione di Tim-3, PD-1, CD38 e 4-1BB. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di esplorare i diversi parametri, ad esempio diversi metodi di clustering, per esplorare completamente i dati che si stanno studiando.
