我々 は感謝ローラ Denti、ヴァレンティーナなガール フレンドとの UCL 眼科研究所で生物資源部スタッフは、テクニカル サポートのマウス飼育とカミーユ Charoy ヘルプします。この作品は、c. Ruhrberg、j. t. ブラッシュ (FS/13/59/30649) に英国心臓財団博士課程学生の身分 (氏/N011511/1) 医学研究評議会の助成金によって支えられました。

すべての動物の仕事は英国ホーム オフィスと機関の動物福祉・倫理的なレビューの体 (AWERB) のガイドラインに従って実施されました。
1. マウス作製
注: は、生後 6 ヶ月にまで少なくとも 8 週齢、成体マウスの実験を実行します。技術の再現性と一貫性のあるタイミングの異なる動物間この手順の各ステップを示すために実験的セッションごとに 2 の最小値と最大 6 匹のマウスを使用します。遺伝子組み換えマウスで透過性を誘発する物質の突然変異の効果の評価、理想的には、2 の変異マウスと実験あたり 2 濾胞を使用します。
<ol><li>24 時間刺激的な血管血管前の適切な吸入麻酔薬イソフルランなどを用いたマウスを麻酔します。立ち直り反射が失われ、マウスが外部刺激に応答するまで、麻酔導入の 3% イソフルランを使用します。麻酔維持のため 1.5% イソフルランを使用 (マウスが一定の呼吸数であることを確認)。麻酔下で慎重に、電気シェーバー、皮膚への傷害を避けることを各マウスの両翼を剃る。 注: 動物にストレスの原因を避けるために、皮膚損傷の結果可能性がありますシェービング中の動きを最小限に抑えるため、麻酔が使用されます。</li>
	<li>坊主のマウスをその家のケージに戻ります。雄マウスの各男性に個々 のケージにしないように麻酔回復後配置の戦いと、そのため、皮膚を損傷します。雌マウスのグループの彼らの家のケージに戻します。 注: 場合ケージの雄マウスの間に戦闘の現象は、施術前に区切ります個々 のケージに癒すために皮膚損傷の可能性を許可する実験の前に 3 日間。</li>
	<li>までは (通常数秒) 内で意識を回復し、(通常は 1 分) 内のケージの周りを移動、マウスを監視します。</li>
</ol>2. 静脈内注射・ エヴァンスの青い色素
<ol><li>流キャビネットでヒスタミン阻害剤ピリラミン マレイン酸 (4 μ g/μ L で 0.9% 生理食塩水) ・ エバンス ブルー色素 (1% 0.9% 生理食塩水の w/v) 個別に滅菌ソリューションを準備します。22 μ m フィルターを通して解決策を渡すことによって殺菌しなさい。</li>
	<li>30 G の針で 10 μ L ピリラミン マレイン酸ソリューション/グラムの体重 (図 1 a) それぞれのマウス腹腔内注入するのに滅菌 1 mL 注射器を使用します。注入、最初、首筋、マウスを行い、地面に向かって頭を監督し、腹部が上向きに指示される、それを傾けます。膀胱にぶつからないように正中線から腹部のより低い象限儀で注入します。 注: 8 週と生後 6 ヶ月の間のマウスの重量通常範囲は 15 と 30 g. ピリラミン マレイン酸が放出を阻害するテストするエージェントとは関係なく血管漏れを促進するそれ以外の場合、内因性のヒスタミンの。</li>
	<li>血管拡張を促進するために 10 分の 37 ° C の熱チャンバー内でマウスを配置します。また、熱ランプの使用はローカル倫理的なガイドラインによって許可されている場合は、血管拡張を促進するために、しっぽに焦点を当てた適切な熱ランプを使用します。</li>
	<li>マウス落に一度に 1 つのマウスを移動して 70% エタノール注入領域をきれいにし、血管拡張を促進する尾をこする。</li>
	<li>1 mL の滅菌注射器 30 G 針を使用して、100 μ L を管理 (図 1 b) の尾静脈を介して静脈内エバンス ブルー色素。すぐに出血を防ぐために親指と指尾を保持することによって、注射部位に圧力を適用します。 注: 尾静脈の可視化は、注入領域にひを向けることによって改善できます。マウス尾静脈に静脈注射の実行に関する詳細は、公開されているプロトコル18で見つけることが。</li>
	<li>30 分間循環する色素を許可します。</li>
</ol>3. 血管血管を刺激します。
<ol><li>20 μ L のボリュームで配信される最終的な投与ができる濃度に関心の透過性誘導剤を希釈滅菌ソリューションを使用すると、キャビネット層流。 注:図 1-図 2に示すように、pbs は、2.5 ng/μ L の濃度で血管の血管を刺激するために VEGFA を使用例実験で車両制御として使用されます 50 ng、および PBS の総線量を降伏します。</li>
	<li>31 G 針 2 別の 300 μ L の滅菌シリンジに関心と車両制御の透磁率を誘発するエージェントをロードします。それぞれのマウスに 3 通ソリューションの 20 μ L 注入する十分なソリューションを読み込む (すなわち針のデッド ボリュームを考慮するエージェントとマウス、プラス追加ボリュームあたりの車両の 60 μ L を準備)。</li>
	<li>イソフルラン (3% 麻酔導入立ち直り反射が失われ、マウスが外部刺激に応答するまで、マウスが一定の呼吸率を確かめる麻酔維持のため 1.5%) でテストする最初のマウスを麻酔します。</li>
	<li>掻きマウス (図 1) の側面に透過性促進剤の 20 μ L を注入します。針が、皮膚に対して 15 ° の角度であることを確認します。成功した注入を示す皮膚内で発生したバブルの形成を確認します。少なくとも 1 cm 離れて、2 追加サイトに皮内注射を繰り返します。</li>
	<li>第 2 側面を公開し制御車両ソリューションと帳票の注射を繰り返しますマウスをオンにします。皮膚のサンプルのそれに続くコレクションの識別を容易にするために各部位の位置を紙に記録します。 注: この段階で慎重にマウスの皮膚を処理します。たとえば、皮内注射の際の皮膚をつまんでは避けてください。</li>
	<li>その家のケージに注入されたマウスを戻り、それが (数秒) 内では通常意識を回復し、ケージの周りに移動するまでマウスを監視します。</li>
	<li>最初のマウスは、回復しながらすぐに手順 3.3 3.5 秒のマウス (までの六つのセッションごとに最大限にマウス).各マウスは、以降のステップに進むための時間を調整する注入した時の記録を残します。</li>
</ol>4. 真皮内で蓄積されたエバンス ブルーの定量化
<ol><li>マウスが注入された同じ順序を観察、皮内注射を受けた後、頚部転位 20 分で各マウスを処分します。 メモ: 血管漏れの期間使用すると、透水性誘導剤によって異なります、したがって、皮内注射と殺処分の間の時間を最適化するを必要があります。</li>
	<li>各場所は、その前後のクリーンな組織 (図 1) で包まれたコルク ボードに足ピンにマウスを抜粋しました。</li>
	<li>鋏は使いよう 】 を使用して、死んだマウスの胸まで下腹部から約 3-4 cm の縦切開を作る。メスと鉗子、真皮の内側とエバンス ブルー蓄積 (図 1E) のサイトを明らかにするための両方の側面から皮膚はいじめます。たるんだ皮膚をピンで止めるし、メスの漏れサイトの周りの地域から脂肪を除去します。必要な場合は、皮膚にエバンス ブルー漏れの大きさを示す代表的な写真を撮る。</li>
	<li>鉗子やメスを使用して、各サイトの流出・ エバンス ブルー色素を含む消費税皮膚領域は透過性誘導剤や車両を注入しました。 注意: 後続ステップ 4.7 ホルムアミド ボリュームの似ている部分が残りホルムアミドのようなボリュームで希釈する抽出された色素をできるように、各皮膚サンプルが吸着されること、ように皮膚の同様に大きさで分類された地域を消費税に世話します。.3.5 の手順で記録したインジェクション マップは、摘出するエリアを定義に役立ちます。</li>
	<li>1.5 mL チューブに各サンプルを配置し、それに応じて、ラベル付け、管の底にかかっている各サンプルを確かめます。さらに使用するまでの 20 ° C でサンプルを格納します。すぐに処理する場合以下の手順に従います。</li>
	<li>オーブンでまたは 55 ° C で加熱ブロックのウェルに開いてチューブを配置することによって、皮膚のサンプルを一晩乾燥します。</li>
	<li>エバンス ブルー色素を抽出、発煙のフードのサンプルを 250 μ L の脱イオン ホルムアミドを追加、チューブを閉じます。皮膚サンプル ホルムアミドすべて覆われてしまっています、オーブンまたは 55 ° C で加熱ブロックで一晩インキュベートを確認します。</li>
	<li>遠心分離機の最大速度でベンチトップ遠心分離機のサンプル (> 10,000 x g) 40 分。</li>
	<li>ヒューム フードの透明は、平底 96 ウェル プレート (図 2 a) の別のウェルに各サンプルから色素を含む上清の 100 μ L を転送します。</li>
	<li>メジャー ピーク 620 エバンス ブルー吸光度 740 のリファレンスを読む nm nm の分光光度計です。 注: 620 nm がピークのエバンス ブルーの吸光度、ながら 740 nm エバンス ブルーは吸収されない、参照波長を果たします。</li>
	<li>(図 2 b) 技術的な可変性を考慮して同じエージェントまたはマウスの各車両の帳票注射の吸光度の測定値の平均値します。</li>
	<li>対車両制御 (図 2) 透水性誘導剤からの測定値の倍の違いを計算します。</li>
</ol>

<ol>
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著者は宣言する利害の対立があります。

195217の最初の記述からマイル アッセイは血管の血管の分子機構を研究するため比較的、簡単、迅速かつ信頼性の高い方法で研究者を提供しています。たとえば、マイル アッセイは、したがって19,20,21を誘発するまたは血管ブロック エージェント8 の有効性をテストする能力や異なるエージェントの効力をテストする使用されています、22,23。別の例として血管透過性亢進を誘発するエージェントは、遺伝子改変マウス及び特定の受容体とシグナル伝達タンパク質リガンド誘導性の血管のための要件を決定する彼らの濾胞でテストされています。レスポンス10、11,12,13,14,15,20,23。マイルの試金のいくつかの変更されたバージョンはので、トレーサーの使用に関して、例えば使用されています。したがって、さまざまなサイズの微粒子11,13dextrans の蛍光標識といくつかの研究でエバンス ブルーを置き換えられます。
血管血管メカニズムを調査するため他のアッセイのマイル アッセイの主な利点はそれが比較的容易に行えるし、高価な機器を必要としません。さらに、そのまま血管のコンテキストでこのアッセイのモデルの血管漏れ、体内法を通して漏れを測定に関係なく体外試金のトランスもフラックス アッセイまたはトランス内皮電気抵抗 (のようTEER) アッセイは、内皮細胞の単層のみ、焦点します。したがって誘導剤の異なる配送ルートを活用してまたはのため別のサイトで血管漏れを分析することによって、ここで説明するマイル アッセイから血管血管の代替生体内で試金が異なる場合があります。続いて血管漏れ検査、肺や気管の11,13,15尾静脈を介してエージェントの全身投与による例です。マイルの試金の制限の 1 つは、します特定のエージェントの皮内注射、原則としても血圧と内皮バリアに加えてフローに影響も直接血管の透過性の影響をそのため。それにもかかわらず、この試金は最近による血管透過性を測定するため示されている VEGF の全身血圧15に及ぼす影響とは無関係。マイルの試金のもう一つの制限は、さまざまな組織で血管ベッドに異なる透過性促進剤及び皮膚のマイルの試験で得られた結果できない場合があります、したがって、代表などで発生する内容の応答可能性があります、肺や脳。
動物の年齢と体重は、マイルのアッセイで漏に影響を与える可能性があります。研究者をこれらの変数の影響を最小限に抑えるには、同腹子を使用する必要がありますまたは同様にサイズを使用して、コントロールとしてマウスを高齢者します。ときマウス興味の特定遺伝子の変異を評価し、マウス コントロールとして使用されるヘテロ接合体の繁殖戦略と野生型同腹子対ヘテロ接合体を生成します。さらに、いくつかの麻酔薬を静脈注射24,25を介して投与の記載されている血管収縮を避けるためにすぐに元に戻せる状態のガス麻酔薬イソフルランなどを使用することをお勧めします。マウス外側尾静脈にエバンス ブルー色素の注入はこのプロトコルの重要なステップを実験とデータの品質に大きく影響することができます。したがって、研究者は尾静脈注射を行う主務する必要があります、可能性があります必要があります経験またはマイル測定開始前に練習実験します。代わりに、研究者は、エバンス ブルー、レトロな軌道注入それを経験している場合などを提供するのに他の静脈内のルートを使用できます。透過性促進の皮内注射ソリューションは皮膚にエージェントに依存しない損傷を引き起こすことができます。そのため、皮内注射ボリュームの 20 μ l を超えないようにする必要があります、する必要があります常にヒスタミン阻害剤の存在下で行わし、車両制御の注射に正規化します。
マイル アッセイに使用されている多くの研究者によって、VEGF のシグナル伝達経路のたとえば、コンポーネントを評価 VEGF A 誘発血管透過性亢進の原因腹水癌患者16とビジョンを損なういくつかの新生血管浮腫目の病気7。私たちと他の人が VEGF A シグナル伝達カスケード12,13,14,の特定のコンポーネントの不足のために遺伝的に変更されたマウスにおける VEGF の誘導血管漏れを比較するのにマイルの試金を使用しているため、15,20,23. メインの病理学的 VEGF のアイソ VEGF165、信号 VEGFR2 と NRP1 の細胞質ドメインが SRC 家族キナーゼの ABL キナーゼを介した活性化を促進する NRP1 の複合体を介して、このアプローチを使用して私たちの最近の研究が明らかに14血管の応答を呼び起こす。VEGFA はまた血管の成長を促進する、その血管の活動は具体的には抑制されること場合、虚血性の組織に血流を回復する治療に使用可能性があります、したがって。操縦する血管の血管に向かって血管内皮細胞の VEGF の応答分子機構の解明研究があります、したがって、病理学的 VEGF A 誘発浮腫を抑制する選択的に操作できる経路を識別がんや虚血性眼疾患等の疾患。マイルの試金はこれらと分子のレギュレータと血管血管のエフェクターを解明する機能研究の他の多くの種類を支えるための便利な方法をする間違いなくいきます。

心血管システムの主な機能は循環のすべての臓器組織間ガス, 栄養素, と廃棄物の転送を有効にするのには。血管は、このような交換の1を許可するように基底の透磁率の臓器固有のレベルを持っています。例えば、腎臓の血管が血液脳関門を形成するタイトな非常に不可解なインタ フェース2,3,4ながら、浸透性の高い。血管の内側の粘膜を形成する内皮細胞は循環と基になる組織の間の物理的な障壁を提供して臓器特異的に血管透過性を調節します。しかし、ある特定の刺激は基底のレベル1を超える間に循環からの流体の漏出を高めるため内皮障壁の部分的崩壊を引き起こします。このような血管は、たとえば、サイトで観測された組織の外傷、炎症、腫瘍での敗血症、新生血管の疾患、脳や心臓、目の中に組織の虚血が発生するとそれぞれ脳卒中や心筋梗塞が原因5,6,7,8します。 慢性的に上昇、血管浮腫、眼疾患9に視力の低下など、組織の損傷が原因となりが発生。したがって、血管血管応答のモデリングは血管透過性を増加するメカニズムを理解するため、これを阻害するエージェントの有効性をテストすることが望ましい。
マイル アッセイは、血管の血管の代理指標として体内の血管漏れ対策確立、一般的に使用される、比較的単純な手法です。マイル アッセイが評価する信頼性の高い方法を提供する考えが一般に血圧や血流などの内皮障壁規制とは関係なく血管漏れを高める可能性があります因子を配合アカウントに入れないのに、物質の透磁率変調活動し、彼らの活動を促進するシグナル伝達の仲介。したがって、マイル アッセイは血管の血管のメディエーターとアクション10、11,12,13,のメカニズムを識別した数多くの研究に不可欠なされている14,15など血管内皮増殖因子 VEGF のことはもともと VPF16血管透過性因子として同定されました。
もともとモルモット17血管透過性亢進を勉強するマイルとマイルによって開発された, その分析後に適応されました選択血管透過性の分子機構を解明するためのモデル生物であるマウスを使用して遺伝子操作に彼らの絶妙な適合性のための規則。簡単に言えば、エバンス ブルー色素を静脈内に成体マウスに注入し、30 分 (図 1) を循環させること。車両制御対透水性誘導剤は血管漏出 (図 1) を誘発するために、マウスの側面に反対で複数のサイトでは皮内注射します。その結果、アルブミン結合エバンス ブルー色素は extravasates、(図 1) 真皮に蓄積されます。後マウスをカリング人道的、エバンス ブルーは真皮から抽出され血管漏出のレベルは光学濃度 (図 2) 物質-車両によるテストの比率として計算されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Pyrilamine maleate salt</td>
			<td style="width:141px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">P5514-5G</td>
			<td style="width:167px;">Resuspend in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Deionised Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4117</td>
			<td>Use in fume cupboard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microlance Needles 30g x 0.5&#34;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sterile Plastipak 1ml Luer</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:320px;">Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&#160;</td>
			<td>BD&#160;</td>
			<td>324826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Evans blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse restrainer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heat chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hair clippers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isoflurane</td>
			<td>Merial</td>
			<td>ap/drugs/220/96</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpal&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Blunt scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heatblock</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cork board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Benchtop refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td>
			<td>Reliatech</td>
			<td>M30-004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

脊椎動物の生物における血管内皮細胞の主な機能は、血液と血液細胞、プラズマ高分子と水に内皮細胞の透過性によると合わせることができるという、体の各組織間の障壁として機能するには生理学的な必要はありません。特定疾患におけるサイトカインおよび成長因子が解放される一過性の血管透過性を増加する内皮障壁を対象とします。ただし、彼らの長期の存在は、慢性血管血管と浮腫のことにより組織損傷を引き起こす可能性があります。マイル アッセイは、血管漏れのプロキシの測定を通して血管血管を研究する研究者を可能にする生体内で手法です。ここでは、哺乳類の生理学と病理学を研究に最も広く使用されているモデル生物であるマウスでこの手順を実行する方法の詳細なプロトコルを提供します。プロシージャは、ラベルをマウスの側面に反対に透過性誘導剤と車両制御ソリューションの複数の皮内注射が続く循環アルブミンにエバンス ブルー色素の静脈内投与を含みます。その結果、エバンス ブルー色素は、徐々 にそれが蓄積し、車両に対する透過性誘導剤による漏れと定量化のため抽出することができます真皮にリークします。マイル アッセイ野生型で実行することができますまたは遺伝的マウスモデルを変更し、血管の透過性を調節し、エージェント/ターゲットの誘導またはブロックできるを識別する分子機構を研究対象に薬剤管理と組み合わせることがしたがって。

車両制御 (PBS) 野生型 C57/Bl6 マウスにおける相対的血管漏出を誘導するのに VEGF A の能力を評価するためにマイルの試金を使用しました。ここで、20 μ L 溶液 50 皮内注射で刺激なしの野生型マウスを用いた代表的な実験を示す VEGF A PBS または車両 PBS のみの ng。VEGF a 注入皮膚サンプルでエバンス ブルー色素漏出の増加が明確 PBS と比較して明らかな上皮内(図 1E) だった、ホルムアミド (図 2 a) の色素の抽出の後。複数の実験の定量化は、ことを示しています 50 VEGF-A の ng は大幅 PBS 単独で (図 2 b)、平均よりも青漏れは三枚開き (図 2) の車と比較して血管・ リーケージの増加より多くのエバンスを誘導します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> 図 1: マイル アッセイにおける血管漏れの誘導します。模式図 (上部パネル) とマウスでマイルの分析を実行するときの一連のステップの対応する画像 (底面)。(A) ピリラミン マレイン酸は 10 ~ 30 分 (B) 100 μ l 1% マウスの尾に青いエバンス静脈注射前に内因性ヒスタミンの放出を防ぐために腹腔内に注入されます。(C) 30 分後、血管漏れはエージェントの皮内注射による (50 ng の VEGF-A の緑の円) 対車両制御 (PBS; 白い円).(D, E)エバンス ブルー蓄積のサイトにアクセス、マウスは皮内注射後の選別の 20 分、両翼の皮膚解剖し釘付けに。i. p.: 腹腔内;静脈: 静脈;内径: 皮;スケール バー、1 cm.<a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> 図 2: マイル アッセイにおける血管漏れの定量化します。(A) エバンス ブルーの染料は肌サンプルを図 1にそれぞれの皮内注射から得られた吸光度を分光光度計で読み取りの 96 ウェル プレートに読み込まれるからホルムアミドで抽出されます。(B、C)両方透過性を誘発するエージェントのいずれか (B) 正規化された吸光度値 (光学密度、OD) をプロットすることによって複数の実験から吸光度の測定値のグラフィカルな表現 (VEGF A; 濃い緑の円) および車両 (PBS; グレー円)、または (C) 倍 OD で車両対エージェントの変更 (誤差範囲: SEM)。帳票 PBS と VEGF のサンプルのように (A) の吸光度の測定値は平均化され (B、C) にそれぞれ白または緑の円で表示されます。<a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

ここでは、マウスの皮膚に透過性促進剤の皮内投与により血管漏出を測定するためのプロトコルを提案する.この手法は、促進、あるいは血管漏れを抑制または血管の透過性を調節する分子機構を研究する分子の能力を決定する使用できます。

マイル アッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

evaluating-vascular-hyperpermeability-inducing-agents-skin-with-miles

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K ビュー.  University College London. ここでは、マウスの皮膚に透過性促進剤の皮内投与により血管漏出を測定するためのプロトコルを提案する.この手法は、促進、あるいは血管漏れを抑制または血管の透過性を調節する分子機構を研究する分子の能力を決定する使用できます。

ビデオ: Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction.  (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).

As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns.

神経刺激剤の徐放のためのMicroinfusionシステムの構築と注入。

Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with ...

生物学

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

クローン原性アッセイ：付着細胞

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching morphogenesis. We have developed the limb skin vasculature model to study vascular development in which a pre-existing primitive capillary plexus is reorganized into a hierarchically branched vascular network. Whole-mount confocal microscopy with multiple labelling allows for robust imaging of intact blood vessels as well as their cellular components including endothelial cells, pericytes and smooth muscle cells, using specific fluorescent markers. Advances in this limb skin vasculature model with genetic studies have improved understanding molecular mechanisms of vascular development and patterning. The limb skin vasculature model has been used to study how peripheral nerves provide a spatial template for the differentiation and patterning of arteries. This video article describes a simple and robust protocol to stain intact blood vessels with vascular specific antibodies and fluorescent secondary antibodies, which is applicable for vascularized embryonic organs where we are able to follow the process of vascular development.

We introduce a whole-mount immunohistochemistry and laser scanning confocal microscopy with multiple labelling for analyzing intricate vascular network formation in mouse embryonic limb skin.

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

生殖様細胞に新生マウス皮膚由来幹細胞の分化<em&gt;インビトロ</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

マウス冠動脈血管平滑筋細胞の単離

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

血管周囲脂肪組織による変調に焦点を当てた孤立腸間膜動脈を用いた血管緊張応答性の評価

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

Deep Vascular Imaging in the Eye with Flow-Enhanced Ultrasound

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood supply. The capillary lamina of the choroid lines the outer surface of the retina and is the dominating source of oxygen in most vertebrate retinas. However, this vascular bed is challenging to image with traditional optical techniques due to its position behind the highly light-absorbing retina. Here we describe a high-frequency ultrasound technique with subsequent flow-enhancement to image deep vascular beds (0.5-3 cm) of the eye with a high spatiotemporal resolution. This non-invasive method works well in species with nucleated red blood cells (non-mammalian and fetal animal models). It allows for the generation of non-invasive three-dimensional angiographies without the use of contrast agents, and it is independent of blood flow angles with a higher sensitivity than Doppler-based ultrasound imaging techniques.

We present a non-invasive ultrasound technique for generating three-dimensional angiographies in the eye without the use of contrast agents.

フロー強化超音波による眼の深部血管イメージング

The retina within the eye is one of the most energy-demanding tissues in the body and thus requires high rates of oxygen delivery from a rich blood ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

げっ歯類の頭部に定義された加速度を生成するための受動的頭部運動の適用

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

電気生理学的研究のための成体、幼若、幼虫および胚性ゼブラフィッシュからの心臓および血管平滑筋細胞の単離(英語)

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

マイル アッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価

マイルアッセイで皮膚の血管の血管誘導剤の評価