Name: evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay at JoVE.com

Agradecemos a Laura Denti, Valentina Senatore e o pessoal da unidade de recursos biológicos no Instituto de Oftalmologia da UCL para ajuda com a criação de rato e Camille Charoy para suporte técnico. Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Medical Research Council (Sr/N011511/1) C. Ruhrberg e uma bolsa de estudo britânico PhD de fundação do coração de gelo J.T. (FS/13/59/30649).

Todo o trabalho animal foi realizado seguindo UK Home Office e as orientações institucionais de bem-estar Animal e o corpo de revisão ética (AWERB).
1. preparação Mouse
Nota: Realizar experimentos em ratos adultos pelo menos 8 semanas de idade, até 6 meses de idade. Para demonstrar a reprodutibilidade técnica e sincronismo consistente para cada etapa deste procedimento entre animais diferentes, use um mínimo de 2 e máximo de 6 ratos para cada sessão experimental. Para avaliar o efeito de uma mutação em uma substância indutora de permeabilidade em camundongos geneticamente modificados, idealmente, use 2 ratos mutantes e 2 controles littermate por experimentos.
<ol><li>24 h antes da estimulante vascular hyperpermeability, anestesiamos ratos usando uma inalação adequada anestésica como isoflurano. Use 3% de isoflurano para indução de anestesia, o braço endireitante reflexo é perdido e o mouse não está respondendo a estímulos externos. Use o isoflurano 1,5% para a manutenção da anestesia (certifique-se de que o mouse tem taxas respiratórias constantes). Sob anestesia, raspe cuidadosamente ambos os flancos de cada rato com um barbeador elétrico, evitando danos à pele. Nota: A anestesia é utilizada para evitar causando estresse ao animal e para minimizar o movimento durante o barbear, o que pode resultar em danos à pele.</li>
	<li>Retorne o mouse raspado para sua gaiola em casa. Para camundongos machos, coloque cada macho em uma gaiola individual após a recuperação da anestesia para evitar a luta e, portanto, danificar a pele. Para ratos fêmeas, devolvê-los em um grupo de sua gaiola em casa. Nota: Se um comportamento de lutando é observado entre ratos masculinos na gaiola, antes do procedimento, separá-los em gaiolas individuais para 3 dias antes do experimento para permitir que o dano potencial da pele curar.</li>
	<li>Monitore os ratos até recuperar a consciência (geralmente dentro de alguns segundos) e movimentar a gaiola (geralmente dentro de 1 min).</li>
</ol>2. endovenosa injeção de Evans Blue Dye
<ol><li>Em um fluxo laminar, prepare soluções estéreis separadas do maleato de pirilamina de inibidor da histamina (4 µ g / µ l de soro fisiológico a 0,9%) e do corante azul de Evans (1% p/v em soro fisiológico a 0,9%). Esterilize, passando as soluções através de um filtro de 22 µm.</li>
	<li>Utilize uma seringa de 1ml estéril com uma agulha 30G intraperitonealmente injetar cada rato com 10 µ l pirilamina maleato solução/grama de peso corporal (figura 1A). Para realizar a nuca de injeção, primeira, o mouse e em seguida incline-a para que a cabeça é direcionada para o chão e o abdômen é dirigido para cima. Injete nos quadrantes inferiores do abdómen longe da linha média para evitar bater a bexiga. Nota: O peso dos ratos entre 8 semanas e 6 meses de idade geralmente varia entre 15 e 30 g. maleato de pirilamina inibem a liberação de histamina endógena, que caso contrário seria promover vazamento vascular, independentemente do agente a ser testado.</li>
	<li>Coloque o mouse em uma câmara de calor de 37 ° C por 10 min promover a vasodilatação. Como alternativa, use uma lâmpada de calor apropriado, focada na cauda para promover a vasodilatação se é permitida a utilização de uma lâmpada de calor pelas diretrizes éticas do locais.</li>
	<li>Mova o um mouse de cada vez para uma retenção de rato e esfregar o rabo com etanol a 70% para limpar a área de injeção e promover vasodilatação.</li>
	<li>Usar uma seringa estéril 1 mL com agulha 30G para administrar 100 µ l corante azul de Evans por via intravenosa na veia cauda (figura 1B). Imediatamente, aplica pressão para o local da injeção, segurando a cauda entre um dedo e o polegar para prevenir hemorragias. Nota: A visualização da veia da cauda pode ser melhorada direcionando o lamplight para a área de injeção. Mais detalhes sobre a realização de injeções intravenosas na veia de cauda de rato podem ser encontrado em um protocolo publicado18.</li>
	<li>Permitir que o corante circular por 30 min.</li>
</ol>3. estimular Hyperpermeability Vascular
<ol><li>Usando soluções estéreis em um fluxo laminar, dilua o agente indutor de permeabilidade de interesse a uma concentração que permite que a dose final a ser entregue em um volume de 20 µ l. Nota: No experimento de exemplo mostrado na Figura 1-Figura 2, que VEGFA é utilizado para estimular hyperpermeability vascular em uma concentração de 2,5 ng / µ l de PBS, render uma dose total de 50 ng e PBS é usado como um controle de veículo.</li>
	<li>Carrega o agente indutor de permeabilidade dos juros e o controle do veículo em 2 separado 300 µ l seringas esterilizadas com uma agulha de 31 mil. Carregar a solução suficiente para injetar cada rato com 20 µ l da solução em triplicado (ou seja, preparar 60 µ l de agente e veículo por rato, mais volume adicional para contabilizar o volume morto da agulha).</li>
	<li>Anestesia o primeiro rato a ser testado com isoflurano (3% para a indução de anestesia, reflexo de endireitamento é perdida e o mouse não está respondendo a estímulos externos e 1,5% para a manutenção da anestesia, certificando-se de que o mouse tem taxas respiratórias constantes).</li>
	<li>Por via intradérmica, injete 20 µ l do agente promover a permeabilidade do flanco do mouse (Figura 1). Verifique se a agulha está em um ângulo de 15° para a pele. Seleção para a formação de uma bolha levantada dentro da pele que indica uma injeção bem sucedida. Repeti a injecção intradérmica em 2 locais adicionais, um distante menos de 1 cm.</li>
	<li>Vire o mouse para expor o flanco 2 e repita injeções triplicadas com a solução de controle de veículo. Grave no papel a posição de cada injecção para facilitar a sua identificação para posterior coleta de amostras de pele. Nota: Lidar com a pele de rato com cuidado nesta fase; por exemplo, evite beliscar a pele quando efectuar injecções intradérmicas.</li>
	<li>Retorne o mouse injetado para sua gaiola em casa e monitorar o mouse até que ele recupera a consciência (geralmente dentro de alguns segundos) e se move em torno da gaiola.</li>
	<li>Enquanto o primeiro rato recupera, imediatamente repita os passos 3.3 e 3.5 com o segundo botão do mouse e assim por diante (até 6 ratos màxima por sessão). Manter um registo do tempo que cada rato foi injetado para ajustar o tempo em que se proceda à etapa subsequente.</li>
</ol>4. quantificação de azul de Evans acumulada dentro da derme
<ol><li>Abate cada rato por deslocamento cervical 20 min depois de ter recebido as injeções intradérmicas, observando a mesma ordem em que os ratos foram injetados. Nota: A duração do escapamento vascular pode variar de acordo com o agente indutor de permeabilidade usado, e, portanto, o tempo entre a injeção intradérmica e abate pode precisar otimizar.</li>
	<li>Lugar cada abatidos mouse sobre suas costas e pino seus pés em uma placa de cortiça enroladas com um tecido limpo (Figura 1).</li>
	<li>Usando a tesoura sem corte, faça uma incisão vertical de aproximadamente 3-4 cm da parte inferior do abdome até o peito do rato morto. Com fórceps e um bisturi, embora provoque a pele de ambos os flancos para revelar o lado interno da derme e sites de acumulação de azul de Evans (Figura 1E). Segure a pele frouxa e remover a gordura das regiões em torno do local da fuga com um bisturi. Se necessário, tire uma foto representativa para demonstrar a magnitude do vazamento de azul de Evans na pele.</li>
	<li>Impostos especiais de consumo pele regiões compreendendo o corante azul de Evans vazado para cada site usando fórceps e um bisturi, injetaram com o agente indutor de permeabilidade ou veículo. Nota: tenha cuidado para limitar o tamanho da mesma forma as regiões da pele para certificar-se que, nos 4,7 etapa subsequente, uma parte semelhante do formamide volume vai ser adsorvida por cada amostra de pele, permitindo que o corante extraído ser diluído em um volume semelhante de formamida restante . O mapa de injeção registrado na etapa 3.5 ajudará a definir a área a ser excisada.</li>
	<li>Colocar cada amostra em um tubo de 1,5 mL e o rótulo em conformidade, certificando-se de cada amostra baseia-se na parte inferior do tubo. Armazene as amostras em - 20 ° C até utilização posterior. Se o processamento imediatamente, siga as etapas abaixo.</li>
	<li>Secar as amostras de pele durante a noite, colocando os tubos abertos em um forno ou dentro do poço de um bloco de aquecimento a 55 ° C.</li>
	<li>Para extrair o corante azul de Evans, adicionar 250 µ l de formamida deionizada para as amostras em uma coifa, feche os tubos. Certifique-se de amostras de pele são todos cobertas pelo formamide e incubam durante uma noite em um forno ou um bloco de aquecimento a 55 ° C.</li>
	<li>Centrifugar as amostras em uma centrífuga de bancada na velocidade máxima (> 10.000 x g) por 40 min.</li>
	<li>Em uma coifa, transferi 100 µ l do sobrenadante contendo corante de cada amostra em um poço separado de uma placa de 96 poços de fundo transparente, plana (Figura 2A).</li>
	<li>Pico de medida absorvância de azul de Evans a 620 nm, com uma leitura de referência de 740 nm em um espectrofotômetro. Nota: 620 nm é a absorvância de pico de Evans azul, enquanto 740 nm não é absorvida pelo azul de Evans e atua como um comprimento de onda de referência.</li>
	<li>Média as leituras de absorbância de injeções três vias do mesmo agente ou veículo para cada mouse para contabilizar a variabilidade técnica (Figura 2B).</li>
	<li>Calcule a diferença de dobra das leituras do agente indutor de permeabilidade contra o controle do veículo (Figura 2).</li>
</ol>

<ol>
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Os autores têm sem interesses conflitantes para declarar.

Desde sua primeira descrição em 195217, o ensaio de Miles forneceu pesquisadores com um método relativamente rápido, simples e confiável para estudar os mecanismos moleculares de hyperpermeability vascular. Por exemplo, o ensaio de Miles tem sido usado para testar a capacidade e/ou potência dos diferentes agentes para induzir hyperpermeability19,20,21 ou para testar a eficácia do bloqueio hyperpermeability agentes8 ,22,23. Como outro exemplo, agentes que induzem a permeabilidade vascular foram testados em ratos geneticamente modificados e seus controles littermate para determinar os requisitos de receptores específicos e sinal transducing proteínas para hyperpermeability induzida pelo ligante respostas10,11,12,13,14,15,20,23. Várias versões modificadas do ensaio Miles desde tem sido usadas, por exemplo no que diz respeito o palpador usado. Assim, azul de Evans tem sido substituída em alguns estudos com fluorescência-etiquetada dextranos de tamanhos diferentes ou microesferas11,13.
A principal vantagem do ensaio Miles sobre outros ensaios para investigar mecanismos hyperpermeability vascular é que é relativamente fácil de executar e não requer equipamento caro. Além disso, como uma em vivo técnica, este vazamento vascular modelos de ensaio no contexto de vasos intactos, ao contrário de vazamento através de medição em vitro ensaios tais como trans bem ensaios de fluxo ou trans-resistência elétrica endotelial ( Ensaios TEER), que incidem, unicamente, sobre a monocamada endotelial. Os ensaios alternativos na vivo de hyperpermeability vascular podem diferir o Miles ensaio descrito aqui, utilizando uma rota de entrega diferente para o agente indutor de hyperpermeability ou analisando o escapamento vascular em locais diferentes, para exemplo pela entrega sistémica de um agente através da veia da cauda seguido de exame de escapamento vascular nos pulmões ou a traqueia11,13,15. Uma limitação do ensaio Miles é que a injeção intradérmica de certos agentes pode, em princípio, também influenciam a pressão arterial e fluxo além do rompimento da barreira endotelial e, portanto, influenciar a permeabilidade vascular também indiretamente. No entanto, este ensaio recentemente tem sido mostrado para medir a permeabilidade vascular induzida por VEGF-A, independentemente de efeitos na pressão arterial sistêmica15. Outra limitação do ensaio Miles é que camas vasculares em tecidos diferentes podem responder diferentemente a permeabilidade-promoção agentes e os resultados obtidos com um ensaio de Miles na pele podem, portanto, não ser representativa, por exemplo, do que ocorre na pulmão ou cérebro.
Idade e peso do animal podem influenciar o escapamento observado no ensaio de Miles. Para minimizar o efeito dessas variáveis, pesquisadores devem usar littermates ou da mesma forma tamanho e envelhecido ratos como controles. Ao avaliar os mutantes do mouse para um determinado gene de interesse, os ratos devem ser gerados através um heterozigoto contra littermates estratégia e sua reprodução heterozigoto usados como controles. Além disso, é aconselhável a utilização de anestésicos de gás rapidamente reversível, tais como o isoflurano, para evitar a vasoconstrição, o que foi descrita por algumas drogas anestésicas administrada através de injeções parenterais24,25. A injeção de corante azul de Evans na veia lateral da cauda do rato é um passo crítico no presente protocolo e grandemente pode influenciar a qualidade da experiência e dados. Assim, pesquisadores devem ser competentes na realização de cauda veia injeções e irá provavelmente precisar de experiência prévia ou prática antes do início que do ensaio as milhas experimentar. Alternativamente, os investigadores poderiam usar outras vias intravenosa entregar Evans azul, tais como a injeção retro-orbital se eles são experientes com isso. Injeção intradérmica de permeabilidade-promover soluções podem causar danos agente independente à pele. Portanto, injecções intradérmicas não deve exceder 20 µ l de volume, devem sempre ser realizadas na presença do inibidor da histamina e normalizadas para injeções de controle do veículo.
O ensaio de Miles tem sido utilizado por muitos pesquisadores para avaliar os componentes da VEGF-A via de sinalização, por exemplo, porque a permeabilidade vascular VEGF A-induzida provoca ascite em pacientes de câncer16 e edema prejudicando a visão em vários neovascular doença de olho7. Assim, nós e os outros têm usado o ensaio de Miles para comparar o VEGF-A fuga de vascular induzida em ratos que foram geneticamente modificados para a falta de componentes específicos do VEGF-A sinalização cascata12,13,14, 15 , 20 , 23. nosso estudo recente usando esta abordagem revelou que a principal isoforma de VEGF-A patológica, VEGF165, os sinais através de um complexo de VEGFR2 e NRP1, em que o domínio citoplasmático NRP1 promove a ativação de ABL quinase-mediada de quinases família SRC para evocar uma resposta de hyperpermeability14. VEGFA também promove o crescimento de vasos sanguíneos e pode, portanto, ser utilizada terapeuticamente para restabelecer o fluxo sanguíneo para os tecidos isquêmicos, se suas atividades hyperpermeability podem ser especificamente inibidas. Investigação para elucidar o mecanismo molecular que orienta o VEGF-A respostas das células endoteliais vasculares no sentido hyperpermeability vascular pode, portanto, identificar caminhos que podem ser manipulados seletivamente para inibir o edema patológico induzido VEGF-A em doenças, como câncer ou doença isquêmica ocular. O ensaio de milhas, sem dúvida, vai continuar a ser um método útil para apoiar estes e muitos outros tipos de estudos funcionais para elucidar os reguladores moleculares e efetores de hyperpermeability vascular.

A principal função do sistema cardiovascular é permitir a transferência de gases, nutrientes e resíduos entre a circulação e tecidos em todos os órgãos. Vasos sanguíneos têm níveis de órgão específico de permeabilidade basal para permitir tais intercâmbios1. Por exemplo, os vasos sanguíneos nos rins são altamente permeáveis, enquanto a barreira hemato-encefálica constitui uma interface altamente impenetrável e apertado2,3,4. As células endoteliais que formam o revestimento interno dos vasos sanguíneos fornecem uma barreira física entre a circulação e tecidos subjacentes e regulam a permeabilidade vascular de forma órgão específico. No entanto, certos estímulos causam um colapso parcial da barreira endotelial para aumentar o extravasamento de fluido de circulação para o interstício acima os níveis basais de1. Tal hyperpermeability é observado, por exemplo, em locais de trauma do tecido, na inflamação, tumores, durante a sepse, nos olhos com doença neovascular ou no cérebro e coração, quando a isquemia do tecido ocorre devido a um acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio, respectivamente 5 , 6 , 7 , 8. quando cronicamente elevada, hyperpermeability leva ao edema, que por sua vez, provoca danos nos tecidos, tais como perda de visão no olho doença9. Assim, a resposta vascular hyperpermeability de modelagem é desejável para compreender os mecanismos que aumentam a permeabilidade endotelial e para testar a eficácia de agentes projetado para inibir isto.
O ensaio de milhas é uma técnica bem estabelecida, comumente usada e relativamente simples que mede escapamento vascular na vivo como uma medida de substituto de hyperpermeability vascular. Mesmo que isso não leva em conta a composição de fatores que podem aumentar o vazamento vascular independentemente do Regulamento da barreira endotelial, tais como pressão arterial ou o fluxo de sangue, o ensaio de Miles geralmente é pensado para fornecer um método confiável para avaliar o permeabilidade-modulando a atividade de substâncias e identificar os sinalização mediadores que promovem a sua actividade. Nesse sentido, o ensaio de Miles tem sido parte integrante de inúmeros estudos que identificaram mediadores de hyperpermeability vascular e seus mecanismos de ação10,11,12,13, 14,15, como o fator de crescimento vascular endotelial VEGF-A que foi originalmente identificada como o fator de permeabilidade vascular VPF16.
Originalmente desenvolvido por milhas e milhas para estudar a permeabilidade vascular em cobaias17, seu ensaio foi posteriormente adaptado para usando ratos, que são agora o organismo modelo de escolha para elucidar os mecanismos moleculares da permeabilidade vascular Regulamento, devido a sua excelente adequação para manipulação genética. Brevemente, corante azul de Evans por via intravenosa é injetado em ratos adultos e autorizado a circular por 30 minutos (Figura 1). Agentes de indução permeabilidade contra o controle do veículo em seguida são injetados por via intradérmica em vários sites em opostos os flancos do rato para induzir vazamento vascular (Figura 1). Por conseguinte, albumina ligados a Evans corante azul extravasates e acumula-se na derme (Figura 1). Após abate humanamente o mouse, azul de Evans é extraído da derme e o nível de vazamento vascular calculado como uma relação do teste de substância para veículo-induzida de densidade óptica (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>Pyrilamine maleate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5514-5G</td><td>Resuspend in PBS</td></tr><tr><td>Deionised Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4117</td><td>Use in fume cupboard</td></tr><tr><td>Microlance Needles 30g x 0.5&quot;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Plastipak 1ml Luer</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G&amp;nbsp;</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Mouse restrainer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hair clippers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>ap/drugs/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Scalpal&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt scissor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heatblock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cork board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchtop refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165</td><td>Reliatech</td><td>M30-004</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluating vascular hyperpermeability-inducing agents in the skin with the miles assay

A principal função do endotélio vascular em organismos vertebrados é servir como uma barreira entre o sangue e cada tecido do corpo, através do qual a permeabilidade do endotélio, de células do sangue, macromoléculas do plasma e água pode ser adaptada de acordo com a necessidade fisiológica. Em certas doenças, citocinas e fatores de crescimento são liberados em que se destinam a barreira endotelial para aumentar transitoriamente a permeabilidade vascular; no entanto, sua presença prolongada pode causar hyperpermeability vascular crônica e edema do tecido-prejudiciais desse modo. O ensaio de milhas é uma técnica na vivo que permite aos pesquisadores estudar hyperpermeability vascular através da medição de proxy de escapamento vascular. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado sobre como executar esse procedimento no mouse, que é o organismo modelo mais amplamente usado para estudar patologia e fisiologia dos mamíferos. O procedimento envolve a injeção intravenosa de corante azul de Evans para rotular a albumina circulante seguida por múltiplas injecções intradérmicas de agentes de indução permeabilidade e soluções de controle de veículos em oposição os flancos do mouse. Por conseguinte, corante azul de Evans gradualmente vaza para a derme, onde se acumula e pode ser extraído para quantificação como escapamento induzida pelo agente indutor de permeabilidade em relação ao veículo. O ensaio de milhas pode ser executado em tipo selvagem ou geneticamente modificado em modelos do rato e pode ser combinado com a administração de drogas para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular e identificam agentes/metas capazes de induzir ou bloqueio hyperpermeability.

Usamos o Miles ensaio para avaliar a habilidade do VEGF-A para induzir vazamento vascular em relação ao controle do veículo (PBS) em camundongos C57/Bl6 de sua. Aqui, nós mostramos um representante experimento usando sua ratos estimulados com injeção intradérmica de solução de 20 µ l contendo 50 ng do VEGF-A em PBS ou PBS veículo apenas. Um claro aumento escapamento de corante azul de Evans em amostras de pele injetado com VEGF-A em comparação com PBS foi aparente em situ (Figura 1E) e após a extração do corante em formamida (Figura 2A). Quantificação de vários experimentos que ilustra 50 ng do VEGF-A induz significativamente mais Evans escapamento azul que PBS sozinho (Figura 2B), com uma média aumentar 3 vezes no escapamento vascular em relação ao veículo (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg"> Figura 1: indução de escapamento vascular no ensaio de Miles. Representação esquemática (top painéis) e imagens correspondentes (painéis de fundo) das etapas sequenciais ao realizar o ensaio de Miles no mouse. (A) pirilamina maleato é injetado intraperitonealmente para evitar a liberação de histamina endógena de 10 a 30 minutos antes da injeção intravenosa (B) de 100 µ l 1% Evans azul para a cauda da veia do mouse. (C), 30 min depois, vascular escapamento é induzido pela injeção intradérmica do agente (50 ng do VEGF-A; verde círculos) contra o controle do veículo (PBS; círculos brancos). (D, E) Para acessar sites de acumulação de azul de Evans, o mouse é abatidos 20 minutos após as injeções intradérmicas e a pele de ambos os flancos dissecados e encurralados. i.p.: intraperitoneal; i.v.: intravenosa; identificação: intradérmica; escala de bares, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg"> Figura 2: quantificação de escapamento vascular no ensaio de Miles. (A) Evans corante azul é extraído em formamida de amostras de pele obtidos de cada injeção intradérmica na Figura 1 e carregado em uma placa de 96 poços para ler com um Espectrofotômetro de absorção. (B, C) Representação gráfica das leituras de absorbância de múltiplas experiências traçando valores (B) a absorvância normalizada (densidade óptica, OD) de ambos o agente indutor de permeabilidade (VEGF-A; escuro verde círculos) e veículo (PBS; cinza círculos), ou (C) a prega mudança de OD para o agente contra o veículo (barras de erro: SEM). As leituras de absorvância do PBS triplicado e amostras de VEGF-A, mostradas em (A) são em média e mostradas em (B, C) como círculos brancos ou verdes, respectivamente. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Aqui, apresentamos um protocolo para medir o vazamento vascular induzido pela administração intradérmica de agentes de promoção de permeabilidade na pele murino. Esta técnica pode ser usada para determinar a capacidade das moléculas de promover ou inibir vazamento vascular ou para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular.

Avaliação de agentes de indução Hyperpermeability vasculares na pele com o ensaio de milhas

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

evaluating-vascular-hyperpermeability-inducing-agents-skin-with-miles

Research

JoVE Journal

Biology

14.7K visualizações.  University College London. Aqui, apresentamos um protocolo para medir o vazamento vascular induzido pela administração intradérmica de agentes de promoção de permeabilidade na pele murino. Esta técnica pode ser usada para determinar a capacidade das moléculas de promover ou inibir vazamento vascular ou para estudar os mecanismos moleculares que regulam a permeabilidade vascular.

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Assessing Tumor Microenvironment of Metastasis Doorway-Mediated Vascular Permeability Associated with Cancer Cell Dissemination using Intravital Imaging and Fixed Tissue Analysis

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary sites. Recently, we established that cancer cell dissemination in primary breast cancer and at metastatic sites in the lung occurs only at doorways called Tumor MicroEnvironment of Metastasis (TMEM). TMEM doorway number is prognostic for distant recurrence of metastatic disease in breast cancer patients. TMEM doorways are composed of a cancer cell which over-expresses the actin regulatory protein Mena in direct contact with a perivascular, proangiogenic macrophage which expresses high levels of TIE2 and VEGF, where both of these cells are tightly bound to a blood vessel endothelial cell. Cancer cells can intravasate through TMEM doorways due to transient vascular permeability orchestrated by the joint activity of the TMEM-associated macrophage and the TMEM-associated Mena-expressing cancer cell. In this manuscript, we describe two methods for assessment of TMEM-mediated transient vascular permeability: intravital imaging and fixed tissue immunofluorescence. Although both methods have their advantages and disadvantages, combining the two may provide the most complete analyses of TMEM-mediated vascular permeability as well as microenvironmental prerequisites for TMEM function. Since the metastatic process in breast cancer, and possibly other types of cancer, involves cancer cell dissemination via TMEM doorways, it is essential to employ well established methods for the analysis of the TMEM doorway activity. The two methods described here provide a comprehensive approach to the analysis of TMEM doorway activity, either in na&#239;ve or pharmacologically treated animals, which is of paramount importance for pre-clinical trials of agents that prevent cancer cell dissemination via TMEM.

We describe two methods for assessing transient vascular permeability associated with tumor microenvironment of metastasis (TMEM) doorway function and cancer cell intravasation using intravenous injection of high-molecular weight (155 kDa) dextran in mice. The methods include intravital imaging in live animals and fixed tissue analysis using immunofluorescence.

Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

The most common cause of cancer related mortality is metastasis, a process that requires dissemination of cancer cells from the primary tumor to secondary ...

Pesquisa do câncer

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Medicina

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Bioengenharia

Measuring Local Anaphylaxis in Mice

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. Exposure to an allergen in a sensitized individual can result in clinical symptoms that vary from minor erythema to life threatening anaphylaxis. In the laboratory, various animal models have been developed to understand the mechanisms driving allergic responses. Herein, we describe a detailed method for measuring changes in vascular permeability to quantify localized allergic responses. The local anaphylaxis assay was first reported in the 1920s, and has been adapted from the technique published by Kojima et al. in 20071. In this assay, mice sensitized to OVA are challenged in the left ear with vehicle and in the right ear with OVA. This is followed by an intravenous injection of Evans Blue dye. Ten min after injecting Evans Blue, the animal is euthanized and the dye that has extravasated into the ears is extracted overnight in formamide. The absorbance of the extracted dye is then quantified with a spectrophotometer. This method reliably results in a visual and quantifiable manifestation of a local allergic response.

Allergic responses, characterized by the activation of mast cells and basophils, are driven by the cross-linking of IgE and release of proinflammatory mediators. A quantitative assessment of allergic responses can be achieved by using Evans Blue dye to monitor changes in vascular permeability after allergen challenge.

Medindo Anafilaxia locais em Ratos

Allergic responses are the result of the activation of mast cells and basophils, and the subsequent release of vasoactive and proinflammatory mediators. ...

Imunologia e Infecção

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that system. Changes in blood flow to the small intestine can result in effects on the absorptive functions of the organ. Particular interest in toxins liberated from feedstuffs through fermentative and digestive processes has developed in ruminants as an area where productive efficiencies could be improved. The video associated with this article describes an in vitro bioassay developed to screen compounds for vasoactivity in isolated cross-sections of bovine mesenteric artery and vein using a multimyograph. Once the blood vessels are mounted and equilibrated in the myograph, the bioassay itself can be used: as a screening tool to evaluate the contractile response or vasoactivity of compounds of interest; determine the presence of receptor types by pharmacologically targeting receptors with specific agonists; determine the role of a receptor with the presence of one or more antagonists; or determine potential interactions of compounds of interest with antagonists. Through all of this, data are collected real-time, tissue collected from a single animal can be exposed to a large number of different experimental treatments (an in vitro advantage), and represents vasculature on either side of the capillary bed to provide an accurate picture of what could be happening in the afferent and efferent blood supply supporting the small intestine.

The small intestine is frequently exposed to toxins that can influence blood flow and negatively impact nutrient absorption. Using a multimyograph and mesenteric artery and vein isolates, compounds or toxins of interest can be screened for vasoactivity.

Isolando e com cortes de bovinos artéria e veia mesentérica como Bioassay teste para vasoactividade no intestino delgado

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

A Methodological Approach to Non-invasive Assessments of Vascular Function and Morphology

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis. Damage to the endothelium may predispose the vessel to atherosclerosis and increase the risk for cardiovascular disease. Assessments of peripheral endothelial function are good indicators of early abnormalities in the vascular wall and correlate well with assessments of coronary endothelial function. The present manuscript details the important methodological steps necessary for the assessment of microvascular endothelial function using laser Doppler imaging with iontophoresis, large vessel endothelial function using flow-mediated dilatation, and carotid atherosclerosis using carotid artery ultrasound. A discussion on the methodological considerations for each of the techniques is also presented, and recommendations are made for future research.

The present article describes the methodological considerations for several non-invasive assessments of vascular function and morphology that are commonly used in medical research to assess different stages of atherosclerosis.

Uma abordagem metodológica para avaliações não-invasivas de função vascular e Morfologia

The endothelium is the innermost lining of the vasculature and is involved in the maintenance of vascular homeostasis.  Damage to the endothelium may ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary to produce erythema (inflammatory reddening) on the surface of the skin. In this context, the MED is regarded as a key factor in determining starting doses for UV phototherapy for common skin conditions such as psoriasis and eczema. In research settings, MED testing also has potential to be a powerful tool for assessing within- and between-persons variation in inflammatory responses. However, MED testing has not been widely adopted for use in research settings, likely owing to a lack of published guidelines, which is a barrier to obtaining reproducible results from this assay. Also, protocols and equipment for establishing MED vary widely, making it difficult to compare results across laboratories. Here, we describe a precise and reproducible method to induce and measure superficial erythema using newly designed protocols and methods that can easily be adapted to other equipment and laboratory environments. The method described here includes detail on procedures that will allow extrapolation of a standardized dosage schedule to other equipment so that this protocol can be adapted to any UV radiation source.

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is used to establish dosage schedules for ultraviolet radiation phototherapy. It can assess individual variation in inflammatory response but lacks methodology for achieving reproducible results. Here, we present a precision implementation of MED and demonstrate its ability to capture individual variation in inflammatory response.

Implementação de precisão do teste de dose mínima de eritema (MED) para avaliar a variação individual na resposta inflamatória humana

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Biologia

Investigando novos mecanismos de disfunção microvascular em humanos

Intradermal Microdialysis: An Approach to Investigating Novel Mechanisms of Microvascular Dysfunction in Humans

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate mechanisms of vascular smooth muscle and endothelial function in the cutaneous circulation. This technique allows for the pharmacological dissection of the pathophysiology of microvascular endothelial dysfunction as indexed by decreased nitric oxide-mediated vasodilation, an indicator of cardiovascular disease development risk. In this technique, a microdialysis probe is placed in the dermal layer of the skin, and a local heating unit with a laser Doppler flowmetry probe is placed over the probe to measure the red blood cell flux. The local skin temperature is clamped or stimulated with direct heat application, and pharmacological agents are perfused through the probe to stimulate or inhibit intracellular signaling pathways in order to induce vasodilation or vasoconstriction or to interrogate mechanisms of interest (co-factors, antioxidants, etc.). The cutaneous vascular conductance is quantified, and mechanisms of endothelial dysfunction in disease states can be delineated.

Autor em destaque: uma abordagem de farmacodissecção para descobrir mecanismos em populações de risco de doenças cardiovasculares 

Intradermal microdialysis is a minimally invasive technique used to investigate microvascular function in health and disease. Both dose-response and local heating protocols can be utilized for this technique to explore mechanisms of vasodilation and vasoconstriction in the cutaneous circulation.

Microdiálise Intradérmica: Uma Abordagem para Investigação de Novos Mecanismos de Disfunção Microvascular em Humanos

The cutaneous vasculature is an accessible tissue that can be used to assess microvascular function in humans. Intradermal microdialysis is a minimally ...

Avaliação de agentes de indução Hyperpermeability vasculares na pele com o ensaio de milhas

Resumo

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Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

Um

A pele completa Defeito Modelo Estudar a vascularização de Biomateriais

Medindo Anafilaxia locais em Ratos

Isolando e com cortes de bovinos artéria e veia mesentérica como Bioassay teste para vasoactividade no intestino delgado

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Implementação de precisão do teste de dose mínima de eritema (MED) para avaliar a variação individual na resposta inflamatória humana

Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Microdiálise Intradérmica: Uma Abordagem para Investigação de Novos Mecanismos de Disfunção Microvascular em Humanos

Microdiálise Intradérmica: Uma Abordagem para Investigação de Novos Mecanismos de Disfunção Microvascular em Humanos